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6 Experimenteller Teil

6.1 Geräte

Sicherheitswerkbank

Tecnoflow Integra Biosciences

Vakuumpumpe

Vacuumbrand GmbH

Vortexer REAX 2000

Heidolph

CO2-Inkubator

Tecnoflow Integra Biosciences

Umkehrmikroskop mit Photoapparat

Nikon Corporation

Wasserbad

GFL

Massenspektrometer 5890 Serie II und Gas Chromatograph, 5989B

Hewlett Packard

UV-Lampe

CAMAG

HPLC-Gerät LC6-A

Shimadsu

DC-Probenautomat III

CAMAG

HPTLC Scanner II V3.15, PC, CATS 3.15

CAMAG

Kühlzentrifuge ZK380

Hermle

Ultrazentrifuge VP65M

MLW Electronic

Tischzentrifuge 5415C

Eppendorf

Vakuum Rotationsverdampfer 461 mit Wasserbad

Büchi

Mikrotiterplatten-Photometer Lesetyp EAR 340-AT

SLT Labinstruments


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6.2 Substanzen und Kulturzubehör

Kulturmedien und -zusätze

Sigma, USA

Kulturflaschen und Multischalen

Sigma, USA

Sterilfilter

Minisart Sartorius

AWD 100-041

AWD, Dresden

AR 12463

DHW, Rodleben

FLM 5011

Fahlberg List, Freiberg

FLM 5011-Metaboliten

Prof. Dr. Kühn, Institut für Biochemie, Humboldt Universität zu Berlin

Annexin-V-Biotin

Boehringer Mannheim, MD

Streptavidin-Peroxidase-Konjugat

Boehringer Mannheim, MD

Diaminbenzidin

Boehringer Mannheim, MD

LDH-Test-Kit

Boehringer Mannheim, MD

DNA-Leiter

GIBCO BRL

ApoAlert FLICE Assay Kit

Clontech Laboratories

CytodexÒ

Pharmacia, Schweden

Carbogen-Gas (95% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid)

Technische Gase, Berlin

sonstige Chemikalien

Sigma, USA

6.3 Zellkulturen und Versuchstiere

Hep G2-Zellen wurden bei ATCC, USA käuflich erworben. Hepatozyten und Lymphozyten wurden aus männlichen Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 150-200g gewonnen. Die Tiere (Tierzucht Schönewalde GmbH, Berlin) erhielten Standardmischfutter (Rezeptur R), und Leitungswasser ad libitum. Sie wurden unter Standardbedingungen gehalten. Dazu gehörten Makrolon Standardkäfige, Haltung in einem klimatisierten, abgeschlossenen Raum mit 12h Dunkelphase und Käfigwechsel 1-2mal die Woche.

6.4 Sterilisation

Alle Glasgeräte, wie z.B. Pasteurpipetten, wurden heißluftsterilisiert bei 180°C über 30min. Plastikgefäße, Pipettenspitzen und wäßrige Lösungen wurden bei 121°C für 15min autoklaviert. Thermolabile Lösungen, wie Trypsin-Lösung, Kollagenase-Lösungen und kleine Mengen [Seite 106↓] Lösungen wurden mit Hilfe eines sterilen Membranfilters mit Porengröße 0,2µm sterilfiltriert.

Arbeitsflächen und Hände wurden mit MeliseptolÒ und anderen Desinfektionsmitteln desinfiziert.

6.5 Kultivierung der Hep G2-Zellen

Hep G2-Zellen wurden in 25cm2- bzw. 75cm2-Polystyren-Kulturflaschen mit 5ml bzw. 15ml Medium kultiviert. Nach 24-72h oder wenn das Phenolrot-haltige Medium eine gelb-orange Farbe aufwies, was auf einen pH unter 7 hinweist, wurde das Medium gewechselt. Dazu wurde das Kulturmedium mittels einer Saugpumpe, an der eine sterile Pasteurpipette mit Schlauch und Auffanggerät befestigt war, restlos entfernt. Nun wurde mit frischem Kulturmedium aufgefüllt.

Bei genügend hoher Zelldichte oder zum Vorbereiten von Versuchen wurden die Zellen passagiert. Dazu wurde das Kulturmedium entfernt und nun mit 1,5ml bei 25cm2- bzw. 2,5ml bei 75cm2-Kulturflaschen einer sterilen Trypsin-EDTA-Lösung 3-5min bei 37°C inkubiert.

Trypsin-EDTA-Lösung:

NaCl

8,0g

 

KCl

0,2g

 

Na2HPO4

1,15g

 

KH2PO4

0,2g

 

Phenolrot

0,01g

 

Trypsin (1:250)

0,5g

 

EDTA

0,2g

 

in 1000ml destilliertem Wasser

Die Lösung ohne Trypsin und EDTA entspricht der Formulierung der Salzlösung nach Earl. Die Bezeichnung 1:250 kennzeichnet die Enzymaktivität von Trypsin: 1g Trypsin verdaut bzw. hydrolisiert 250g Caseinsubstrat bei 25°C, in 10min und bei pH 7,6.

Eine Vorinkubation mit einer sterilen EDTA-Lösung war nicht nötig. Wenn die Zellen sich durch leichtes Rütteln der Kulturflasche vom Substrat gelöst hatten, wurden sie in der 3-fachen Menge an Kulturmedium suspendiert und bei Bedarf gezählt mit einem Casy-Zellzählgerät. Die Zellsuspension konnte nun auf mehrere neue Kulturgefäße verteilt werden. Nach 24h wurde das Kulturmedium entfernt und durch frisches ersetzt. Eine Passage wurde ca. einmal pro Woche durchgeführt.

Zur Erstellen einer Wachstumstumskurve wurden 105 Zellen pro well in 24well-Multischalen eingesät. Nach 4h fand in allen Kulturen ein Mediumwechsel statt. Anschließend wurden 5 [Seite 107↓] ohne weiteren Wechsel des Mediums kultiviert, während 5 weitere Kulturen nach jeweils 24h frisches Medium bekamen.

6.5.1  Medium und Kultivierungsbedingungen

Die Zellkulturen wurden mit leicht geöffneter Kappe der Kulturflaschen in einem CO2-Inkubator mit 5% CO2 in der Gasphase und bei 37°C kultiviert. Eine hohe Luftfeuchtigkeit wurde durch Füllen des Wasserbeckens des Inkubators mit destilliertem Wasser gewährleistet.

Das Kulturmedium für Hep G2-Zellen hatte folgende Zusamensetzung:

RPMI 1640 Medium.
ohne L-Glutamin und NaHCO3

400,0ml

Medium 199
mit Hank’s Salzen, mit L-Glutamin und ohne NaHCO

100,0ml

L-Glutamin-Lösung
200mM

10,0ml

Natriumpyruvat-Lösung
100mM

5,0ml

MEM nichtessentielle Aminosäure-Lösung
890,0mg/l L-Alanin, 1500,0mg/l L-Asparagin H2O,
1330,0mg/l L-Asparaginsäure, 1470,0mg/l L-Glutaminsäure,
750,0mg/l L-Glycin, 1150,0mg/l L-Prolin, 1050,0mg/l L-Serin

5,0ml

Penicillin/Streptomycin-Mischung
(10000 Einheiten Penicillin und 10000µg Streptomycin
pro ml in physiologischer Kochsalzlösung)

10,0ml

NaHCO3.
gelöst in 20ml destilliertem Wasser und sterilfiltriert

0,6g

fetales Kälberserum

50ml

Bei Versuchen mit photometrischer Detektion wurde das Medium aus RPMI 1640- und Medium 199-Formulierungen hergestellt, die kein Phenolrot enthielten. Bei fluorimetrischen Bestimmungen störte Phenolrot nicht.


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6.5.2  Kultivierung an Cytodex®

300mg CytodexÒ3 Microcarrier wurden in 30ml Phosphatpuffer (PBS) 3h bei 20°C hydratisiert. Nach anschließendem Dekantieren und Waschen der Microcarrier, wurden diese in 10ml PBS autoklaviert. Jeweils 2ml dieser Suspension wurden in einem 100ml Kolben auf 20ml mit einer Zellsuspension in Kulturmedium aufgefüllt, so daß 106 Zellen 1ml Microcarrier-Suspension zur Verfügung stand. Mit leicht geöffnetem Verschluß des Kolbens wurde die Zellkultur im CO2-Inkubator kultiviert, wobei alle 20min geschwenkt wurde, um ein gleichmäßiges Anwachsen und einen kontinuierlicher Gasaustausch zu gewährleisten [80]. Nach 4h wurde das Kulturmedium nach Sedimentation der Microcarrier entfernt und durch frisches Medium ersetzt. Während der Versuche wurden die Kulturen in einem temperierbaren Schüttler inkubiert, nachdem sie mit CO2 begast wurden. So konnte eine gleichmäßige Verteilung des Substrats gewährleistet werden.

Phosphatpuffer (PBS):

KCl

0,2g/l

 

K2PO4

0,2g/l

 

MgSO4x7H2O

0,1g/l

 

NaCl

8,0g/l

 

Na2HPO4x7H2O

2,16g/l

6.6 Kultivierung der Hepatozyten

6.6.1  Isolation

Die Isolierung der Hepatozyten aus der Rattenleben erfolgte in Anlehnung an die Zwei-Schritt-Kollagenase-Perfusionstechnik nach Seglen [93].

Der Bauchraum der narkotisierten Wistar-Ratte (Urethan 1mg/kgKG i.p.) wurde geöffnet und in die freigelegte Pfortader eine Flexüle eingeführt, die dann mit einem chirurgischen Faden fixiert wurde.

Die Flexüle war über eine zwischengeschaltete Blasenfalle und einer Schlauchpumpe mit dem auf 37°C temperierten Vorratsgefäß verbunden.

Als erstes wurde die Leber mit Ca2+-freien Medium für 10min mit einer Durchflußrate von 15 ml/min perfundiert, wodurch die Leber vollständig entblutet wurde. Nach ca. 10s wurde die untere Hohlvene durchtrennt, um Verstopfungen von einzelnen Leberlappen durch Blutgerinnsel zu vermeiden.


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Ca2+-freies Perfusionsmedium:

NaCl

8,0g

KCl

0,2g

Na2HPO4

1,15g

KH2PO4

0,2g

Phenolrot

0,01g

HEPES

100mM

destilliertes Wasser.

ad 1,00 l

Im zweiten Schritt erfolgte nun die enzymatische Gewebedissoziation mit einer Kollagenase-Lösung. Hierbei wurde ca. 8-10 min perfundiert.

Kollagenaselösung:

Kollagenase

50 mg

Calciumchlorid

110 mg

Perfusionsmedium

ad 100 ml

Die Leberkapsel wurde dann in einen sterilen Kolben mit Kulturmedium überführt und gewaschen, um noch an der Oberfläche haftendes Blut und Haare zu entfernen. Dann wurde sie vorsichtig mit Skalpell und Schere geöffnet und zerkleinert. Dauernde Eiskühlung, sowie Vorkühlung des Kulturmediums, war hierbei notwendig. Die grobe Zellsuspension wurde nun durch ein grobmaschiges Perlonsieb gegossen, um noch verbliebene Leberstücke abzutrennen. Die Zellsuspension wurde zweimal für 10min auf Eis stehengelassen, damit es zu einer Sedimentation der Zellen kam und um überstehendes Kulturmedium mit Zelltrümmern und anderen Verunreinigungen absaugen und durch frisches ersetzen zu können.

Nun wurden die Zellen mit Hilfe des Casy-Zellzählgerätes gezählt und die Vitalität durch die Trypanblau-Färbung bestimmt.

Dazu wurde das Deckglas eines Hämozytometers, welches angefeuchtet wurde, fest auf die Zählfläche gedrückt. In einem Eppendorfgefäß wurden 50µl Trypanblaulösung, 30µl Kulturmedium und 20µl Zellsuspension gemischt. Ein Tropfen dieser Mischung wurde an das Hämozytometer herangeführt. Durch Kapillarkräfte fließt eine konstante Menge unter das Deckblatt. Unter dem Lichtmikroskop wurde die Menge an gefärbten und ungefärbten Zellen gezählt. Die durchschnittliche Vitalität lag bei 60-80%. Zellsuspensionen mit einer Vitalität unter 50% wurden verworfen oder über HistopaqueÒ mit der Dichte r= 1,077g/cm2 (Polysucrose 5,7g/dl und Natriumditrizoat 9g/dl) bei 50g für 10min bei 0°C zentrifugiert, um vitale und geschädigte Zellen voneinander zu trennen. Die vitalen Zellen sammeltenn sich an der Grenzschicht und wurden nach der Trennung noch zweimal gewaschen [34].


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Trypanblau-Lösung:

NaCl

0,15M

Trypanblau

0,4g

Aqua bidest.

ad 100ml

Der pH wurde auf 7,4 eingestellt.

2x105 vitale Zellen wurden je well in eine 24well-Multischale ausgesät, die zuvor mit Kollagen beschichtet wurde. Nach 24h wurden die Zellen, die sich nicht angeheftet hatten entfernt und das Kulturmedium erneuert.

6.6.2 Medium und Kultivierungsbedingungen

Zur Kultivierung der Rattenhepatozyten wurde das gleiche Medium wie für Hep G2-Zellen verwendet. Um eine bessere Anheftung der Hepatozyten an das Substrat zu gewährleisten, wurden folgende Zusätze während der Phase des Anheftens der Zellen zu dem Kulturmedium gegeben [7]:

Insulin

0,3µM

Dexamethason

0,1µM

Phenobarbital

0,8mM

Damit es überhaupt zu einer Anheftung der Zellen kam, wurden die Kulturgefäße mit Kollagen beschichtet. Dazu wurden 0,17ml einer sterilen Kollagen I-R-Lösung gleichmäßig über den Boden eines wells einer 24well-Multischale verteilt. Danach wurden 0,04ml einer sterilen NaOH-Medium Mischung (0,34M NaOH und Kulturmedium 1:2) hinzupipettiert und durch schwenken verteilt. Nach 15-30min war das Kollagen geliert und wurde mit 1ml Kulturmedium überschichtet und 24h im Brutschrank vorinkubiert. Vor der Zugabe der Zellsuspension, wurde das Medium entfernt.

Die ausgesäten Zellen wurden mit 2ml Kulturmedium pro well kultiviert. Ansonsten galten die Kulturbedingungen, wie sie in 6.5.1 beschrieben wurden.


[Seite 111↓]

6.7  Kultivierung der Lymphozyten

6.7.1 Isolation

Die Milz wurde nach Entnahme aus der toten Ratte sofort in eisgekühlte physiologische Kochsalzlösung gegeben. Überflüssiges Fettgewebe wurde mit Schere und Skalpell entfernt. Mit Hilfe eines Pistills wurde das Organ zerdrückt und durch ein grobes Nylonsieb gepreßt. Das so entstandene Milzhomogenat wurde mit physiologischer Kochsalzlösung auf 10ml aufgefüllt und über 6ml HistopaqueÒ in einem Zentrifugengefäß geschichtet. Es wurde 30min bei Raumtemperatur bei 400g ohne abzubremsen zentrifugiert. Der Überstand über der Interphase wurde verworfen. Die undurchsichtige Interphase wurde in ein sauberes Zentrifugengefäß pipettiert und mit 10ml Kulturmedium versetzt. Anschließend wurde wiederum bei 400g 10min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 5ml Kulturmedium aufgenommen. Die Zellzahl und die Vitalität (siehe 6.6.1) wurden bestimmt. Je nach Ausbeute wurde durch Verdünnen mit Medium eine Zellkonzentration von 106 Zellen/ml eingestellt.

6.7.2 Medium und Kultivierungsbedingungen

Das Kulturmedium für die Lymphozyten hatte folgende Zusammensetzung:

fetales Kälberserum

50ml

HEPES

25mM

RPMI 1640-Medium

ad 500ml

Die Lymphozyten wurden in einem temperierbaren Schüttler bei 37°C im Brutschrank geschüttelt. Als Kulturgefäße kamen 25cm2-Kulturflaschen zum Einsatz.

6.8  Modellreaktionen

Alle Substrate, die bei der Durchführung der Modellreaktionen zur Anwendung kamen, wurden in DMSO gelöst. Dabei wurde darauf geachtet, daß die Gesamtkonzentration von DMSO im Medium niemals 0,5% überschritten wurde (siehe 4.1.2.8).

Am Ende der Inkubationszeiten wurden bei jedem Versuch die Zellen gezählt, da bei langen Inkubationszeiten (48 und 72h) ein Wachstum zu erwarten war, das nicht vernachlässigt werden konnte. Für Versuche, bei denen photometrisch detektiert wurde, wurde farbloses Medium, also [Seite 112↓] Medium ohne Phenolrot eingesetzt.

6.8.1  7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung

Das Kulturmedium wurde mit 8nmol/ml 7-Ethoxyresorufin und 10nmol/ml Dicumarol, um eine weitere Metabolisierung von entstandenem Resorufin durch das zytosolische Enzym Diaphorase zu schützen, versetzt. Proben wurden nach 1, 4, 24, 48 und 72h entnommen. Freies unkonjugiertes Resorufin konnte direkt in der Probe fluorimetrisch bei einer Exitationswellenlänge von 530nm und einer Emissionswellenlänge von 583nm vermessen werden. Um die Gesamtmenge an entstandenem Resorufin zu bestimmen, wurden 1ml Proben mit 0,25ml 0,1M Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH 4,5) und 50µl ß-Glucuronidase/Sulfatase-Gemisch (100000Units/ml bzw.5000Units/ml) versetzt und mindestens 2h bei 37°C inkubiert. Proteine wurden danach durch Zugabe von 3ml 96% Ethanol gefällt und bei 10000g 2min abzentrifugiert. Der Überstand konnte nun fluorimetrisch vermessen werden [22].

Kalibrierungskurven wurden sowohl für die Bestimmung von freiem Resorufin als auch für die Bestimmung an insgesamt entstandenem Resorufin erstellt und mittels linearer Regression ausgewertet.

Die Konzentrationen betrugen 0,4, 0,8, 1,6, 2,4, 3,2, 4,0, 4,8, 5,6, 6,4, 7,2 und 8µmol/ml Resorufin in Medium für die Bestimmung an freiem Resorufin. Für die Bestimmung an entstandenem Gesamtresorufin wurden Standardlösungen mit 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 und 8,0 µmol/ml Resorufin herangezogen. Die Proben wurden wie oben beschrieben behandelt.

6.8.2 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung

Das Kulturmedium wurde mit 250nmol/ml 7-Ethoxycoumarin versetzt. Die 2ml Proben wurden nach 1, 4, 24, 48 und 72h entnommen und sofort auf Eis gekühlt. 7ml eiskalter Ether, der mit 1,5ml Isoamylalkohol versetzt wurde, wurden zu den Proben gegeben, die nun auf dem Vortexer 1min vermischt wurden. 5ml der Etherphase wurden zu 3,5ml 0,2M Glycin/NaOH-Puffer (pH10,4) gegeben und erneut auf dem Vortexer gemischt. Die eisgekühlte wäßrige Phase konnte nun fluorimetrisch bei einer Exitationswellenlänge von 366nm und einer Emissionswellenlänge von 452nm vermessen werden.

Zur Bestimmung der Konjugate wurde die wäßrige Phase nach der Etherextraktion mit 0,25ml 0,1M Essigsäure-Natriumacetat-Puffer (pH 4,5) und 50µl ß-Glucuronidase/ Sulfatase-Gemisch versetzt und mindestens 2h bei 37°C inkubiert. Dann wurde wie oben beschrieben verfahren.

Zur Quantifizierung wurde ein Standard von 10,5 nmol/ml 7-Hydroxycoumarin in Glycin/NaOH-Puffer vermessen und die Wiederfindungsrate bestimmt [17].


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6.8.3  Aminophenazon-N-demethylierung

Der bei der oxidativen Demethylierung von Aminophenazon entstandene Formaldehyd wurde nach der Methode von Nash quantifiziert [75].

Das Kulturmedium wurde mit 0,322µmol/ml Aminophenazon und 0,338µmol/ml Semicarbazid-HCl, um entstandenen Formaldehyd vor einer weiteren Verstoffwechselung zu CO2 zu schützen, versetzt. Die 0,5ml Proben wurden nach 4, 24, 48 und 72h entnommen und mit 0,4ml 12% ZnCl2-Lösung und 0,2ml gesättigter Ba(OH)2 Lösung zwecks Proteinfällung versetzt. Bei 10000g wurden für 5min die Proteine abzentrifugiert. 1ml des Überstands wurden dann mit 0,4ml doppelt starkem Nash-Reagenz, welches aus 100ml 0,4% wäßriger Acetylacetonlösung bestand, die 30g Ammoniumacetat und 0,6ml Essigsäure enthielt, versetzt. Die Proben wurden im Wasserbad für 30min auf 60°C erhitzt, schnell auf Eis abgekühlt und dann nochmals zentrifugiert. Die Proben wurden bei 420nm photometrisch gegen einen Leerwert, der aus einer unbehandelten Zellkultur entnommen wurde, vermessen.

Die Kalibrierungskurve wurde mit gleich behandelte Proben mit den Konzentrationen 0,1, 0,2, 0,5, 0,7, 0,8 und 0,1µmol/ml Formaldehyd erstellt und mittels linearer Regression ausgewertet.

6.8.4 4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen-Reduktion

Das bei der Azoreduktion von DAB entstandene 4-(N,N-Dimethylamino)anilin wurde mit der Methode von Huang et al. [45] bestimmt. Bei der Reduktion von DAB können auch andere Metaboliten entstehen, die bei dieser Methode nicht erfaßt werden. Daher stellt diese Methode keine Quantifizierung der absoluten reduktiven Aktivität dar.

Das Kulturmedium wurde mit 0,2µmol/ml DAB versetzt und 0,5ml Proben wurden nach 1, 2, 4 und 24h entnommen. 0,1ml 0,5M NaOH-Lösung wurde zu den Proben gegeben und dann mit 1,0ml Hexan auf dem Vortexer für 30s durchmischt. Nach kurzem Zentrifugieren wurde die Hexanphase entfernt und die Probe wurde erneut mit 1ml Hexan extrahiert. Die Hexanphasen wurden vereinigt und 1ml der Hexanphase wurde mit 1ml 0,1M Essigsäure/Natriumacetatpuffer (pH4) wie oben beschrieben extrahiert. Die Hexanphase wurde nun verworfen und die wäßrigen Phase wurde mit 10µl Fluorescaminlösung (2mg Fluorescamin in 1ml wasserfreiem Aceton) versetzt. Nach 30min konnte das entstandene Fluorescaminderivat bei einer Exitationswellenlänge von 410nm und einer Emissionswellenlänge von 500nm fluorimetrisch bestimmt werden.


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Zur Quantifizierung wurde eine Kalibrierungskurve mit wie oben behandelten Proben unterschiedlicher Konzentrationen 4-(N,N-Dimethylamino)anilin erstellt und durch lineare Regression ausgewertet.

6.8.5  p-Nitrophenol-Konjugation

Mittels Quantifizieren des nicht konjugierten Anteils durch Bildung des gelb gefärbten Phenolatanions wurde die Konjugation von p-Nitrophenol indirekt bestimmt.

Dem Medium wurden 0,25µmol/ml p-Nitrophenol zugesetzt und Proben wurden nach 4, 24, 48 und 72h entnommen.

Zu 0,1ml Probe wurden 0,9ml Trichloressigsäure gegeben, um die in der Probe enthaltenen Proteine zu fällen. Nach 5min Zentrifugation bei 10000g wurden 0,4ml des Überstandes entfernt und mit 1ml 0,5M NaOH versetzt und nochmals zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand bei 405nm gegen einen mitgeführten Leerwert vermessen.

Eine Kalbrierungskurve wurde mit analog behandelten Nitrophenollösungen der Konzentrationen 0,15, 0,30, 0,45, 0,6, 0,75 und 0,9µmol/ml erstellt und mittels linearer Regression ausgewertet.

6.8.6 Bestimmung der Enzymaktivitäten in Ultraschall-behandelten Zellkulturen

Nach Kultivierung der Hep G2-Zellen in 24well-Platten wurde das Medium entfernt und der Zellrasen mit eiskaltem 0,1M Phosphatpuffer pH 7,4 gewaschen. In jedes well wurden 0,5ml Phosphatpuffer pipettiert, die Kulturen auf Eis gestellt und jedes well 15s mit Ultraschall mit Hilfe eines Ultraschallstabes (30W/cm2) behandelt. Nun wurden pro well 0,5ml Reaktionspuffer hinzugesetzt und die Reaktion durch Zugabe des Substrats gestartet. Die Konzentrationen und die Bestimmungen der Enzymaktivität wurden gewählt, wie unter 6.8.1-6.8.5 beschrieben wurde.

Reaktionspuffer:

NADP

0,6mg

 

Glucose-6-phosphat

0,365mg

 

MgCl2 6 H2O

3,25mg

 

Nicotinsäureamid

40µmol

6.8.7 Bestimmung der Enzymaktivitäten in isolierten Zellorganellen von Hep G2-Zellen

Nach Kultivierung der Hep G2-Zellen wurde das Medium entfernt und der Zellrasen mit eiskaltem 0,1M Phosphatpuffer pH 7,4 gewaschen. Die Zellen wurden nun mit einem cellscraper vom Substrat gelöst, in 1,15% eiskalter KCl-Lösung suspendiert und mittels Potter-Elvehjem [Seite 115↓] (5x in 15s bei 1500 Umdrehungen/min). Zum Abtrennen von Zelltrümmern und Kernen wurde zuerst 10min bei 1000g bei 0°C zentrifugiert, danach, um eine Trennung von Rohmitochondrien und Mikrosomen zu erreichen, wurde bei 9000g 30 min bei 0°C zentrifugiert.

Das entstandene Pellet, welches nun die Rohmitochondrien enthielt, wurde in 5ml Phosphatpuffer suspendiert und mit Hilfe des Potter-Elvehjem wiederum homogenisiert. Das Homogenat wurde über einen Dichtegradienten 2h bei 2000g zentrifugiert, um eine Mitochondrien- und eine Lysosomen/ Peroxysomen-Fraktion zu erhalten. Die Lösungen für den Gradienten enthielten 0,8, 1,0 und 1,2mol/l Saccharose in Phosphatpuffer. Das Pellet enthielt nun die Mitochondrien, während die Lysosomen und Peroxysomen als milchige Schicht im Gradienten erschienen. Eine Auftrennung von Lysosomen und Peroxysomen erfolgte nicht. Die Fraktionen wurden jeweils in 0,1M Phosphatpuffer pH 7,4 aufgenommen.

Der 9000g-Überstand wurde zwecks Trennung der Mikrosomen vom Zytosol der Ultrazentrifugation bei 105000g für 60min bei 4°C unterzogen. Die entstandene Mikrosomenfraktion wurde ebenfalls in Phosphatpuffer suspendiert. Vor der Messung der Enzymaktivitäten wurden alle Fraktionen unter Eiskühlung mittels Ultraschallbehandlung (1min 30W/cm2) aufgeschlossen.

Die Inkubationsansätze für die Bestimmung der Enzymaktivität enthielten jeweils 1ml Reaktionspuffer 1 bzw. 2 und 1ml der Fraktion. Die Bestimmung wurde gestartet durch Zugabe der Substrate in den gleichen Konzentrationen, wie unter 6.8.1- 6.8.5 beschrieben wurde.

Der Reaktionspuffer für die Bestimmung der Dealkylierung von 7-Ethoxyresorufin, 7-Ethoxycoumarin und Aminophenazon hatte folgende Zusammensetzung:

Reaktionspuffer1:

NADP

0,6mg

 

Glucose-6-phosphat

0,365mg

 

MgCl2 6 H2O

3,25mg

 

Nicotinsäureamid

40µmol

 

Glucose-6-phosphatdehydrogenase

1U

 

0,1M Phosaphatpuffer pH7,4

ad 1ml

Bei der Azoreduktion von DAB wurde statt NADP NADPH eingesetzt.

Der Reaktionspuffer zur Untersuchung der Konjugation von p-Nitrophenol war folgendermaßen zusammengesetzt:

Reaktionspuffer 2:

EDTA

10µmol

 

UDP-Glucuronsäure

1,66µmol

 

0,1M Phosphatpuffer pH 7,4

ad 1ml


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Reaktionen wurden nach 1h gestoppt durch Eiweißfällung oder durch sofortige Extraktion des Produkts. Die Bestimmungen wurden wie unter 6.8.1-6.8.5 beschrieben durchgeführt.

6.9 Statistische Auswertung

Bei der Bestimmung der Enzymaktivität in Hep G2-Zellen und Hepatozytenkulturen mittels Modellreaktionen wurden mindestens 6 Meßwerte, die aus unterschiedlichen Kulturen gewonnen wurden, zur Bestimmung von Mittelwert und Standardabweichung herangezogen. Ausreißer wurden mit dem Test nach Grubbs eleminiert. Zur Prüfung auf Normalverteilung wurde der Schnelltest nach David et al. durchgeführt. Anschließend fand ein Vergleich der Varianzen mit Hilfe des F-Tests statt. Die Prüfung auf Signifikanz der Unterschiede der Mittelwerte erfolgte mittels t-Test nach Student. Bei der Bestimmung der Zytotoxizität bzw. Proliferation wurden auf Grund der Verwendung von Mikrotiterplatten 8 Werte erhalten, die zur Berechnung genutzt wurden. Bei der Signifikanztestung wurden die Ergebnisse mit dem Blindwert, also mit dem Ergebnis unbehandelter Kulturen verglichen.

6.10 Biotransformation von potentiellen Arzneistoffen

6.10.1 AWD 100-041

6.10.1.1 Gewinnung der Metaboliten

107 Hep G2-Zellen wurden mit 0,05mg/ml AWD 100-041 in 15ml Medium 72h inkubiert. Das Medium mit den Zellen, die mit einem cellscraper entfernt wurden, wurde auf pH 4,8 eingestellt und mit 0,25ml eines ß-Glucuronidase/Sulfatase-Gemisches versetzt. Nach 2h wurde das Medium jeweils 3mal bei pH 3 und pH 9 mit dem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden am Rotationsverdampfer eingeengt und in Methanol aufgenommen.

6.10.1.2  Isolation und Identifikation der Metaboliten mittels HPLC

Die Trennung der Metaboliten erfolgte mit Hilfe von reverse-phase HPLC (LC6-A, Shimadsu) mit einer RP-18 Säule (Merck). Dabei wurden 2 Gradientensysteme eingesetzt:

1.Gradientensystem

0-2min Wasser/Methanol 50/50

 

2-10min zu Wasser/Methanol 0/100

2.Gradientensystem

0-10min von Wasser/Methanol 50/50 zu Wasser/Methanol 5/95

 

10-15min zu 0/100% Wasser/Methanol


[Seite 117↓]

Hilfe des 1. Gradientensystems wurden die Metaboliten getrennt und die Metaboliten-fraktionen durch photometrische Detektion bei 311nm gewonnen. Diese wurden eingeengt und wiederum für die HPLC genutzt. Sowohl für das 1. als auch das 2. Gradientensystem wurden die Retentionszeiten und die Spektren der Metaboliten bestimmt und mit Vergleichsmetaboliten verglichen. Zusätzlich fand eine Co-Chromatographie statt.

6.10.1.3 Identifikation der Metaboliten mittels DC

Die eingeengten Fraktionen, die bei der HPLC gewonnen wurden, wurden für die DC eingesetzt. Es wurden Silica Gel Dünnschichtplatten ohne Fluoreszenzindikator benutzt und die Methanolextrakte wurden bandenförmig aufgetragen. Zusätzlich fand eine Co-Chromatographie mit den Vergleichssubstanzen statt. Da AWD 100-041 und seine Metaboliten eine starke Eigenfluoreszenz bei 366nm aufweisen, konnte auf die Detektion mittels Fluoreszenzlöschung verzichtet werden (Nachweisgrenze 1µg [57]).

Folgende Fließmittel kamen zur Anwendung:

1. Fließmittel

Chloroform/Methanol

95:5

2. Fließmittel

Toluen:Aceton:Methanol

70:20:10

6.10.1.4  Identifizierung der Metaboliten mittels MS

Die Massenspektren der Metaboliten von AWD 100-041 wurden im Fachinstitut für angewandte Analytil und Umweltchemie der Humboldt-Universität zu Berlin durch Dr. M. von Löwis of Menar erstellt. Als Gerät kam ein Hewlett Packard 5995A mit Direkteinlaßsystem (Elektronenstoßionisation, Ionenquellentemperatur 140-175°C, Elektronenenergie 70eV) zum Einsatz.

6.10.2 AR 12463

6.10.2.1 Gewinnung der Metaboliten

107 Hep G2-Zellen, die mit 0,8µM Phenobarbital 72h vorbehandelt wurden, wurden mit 0,05mg/ml AR 12463 in 15ml Medium für 72h kultiviert. Danach wurde das Medium entfernt und die Zellen mittels eines cellscraper gelöst und mit dem Medium vereinigt.

Nach Einstellen des pH auf 4,8 und nach Zugabe von 0,25ml eines ß-Glucuronidase/ Sulfatase-[Seite 118↓] wurde 24h inkubiert, um mögliche Konjugate zu spalten. Nun wurde der pH auf 9 eingestellt und das Medium drei mal mit 30ml Chloroform extrahiert. Nach Entfernen des Chloroforms am Rotationsverdampfer wurde der Rückstand in Methanol aufgenommen.

6.10.2.2 Isolation und Identifikation der Metaboliten mittels HPLC

Die Trennung der Metaboliten und die Gewinnung der einzelnen Fraktionen erfolgte wie unter 6.10.1.2. Auch hier wurden die Metaboliten einer Co-Chromatographie mit Vergleichssubstanzen unterzogen. Die Detektion der Metaboliten erfolgte bei 250 und 280nm. Es wurden zusätzlich Spektren aufgenommen.

6.10.2.3 Identifikation der Metaboliten mittels DC

Die eingeengten Fraktionen, die bei der HPLC gewonnen wurden, wurden auch für die DC eingesetzt. Hierbei wurden Silica Gel F254 Dünnschichtplatten benutzt und die Methanolextrakte wurden bandenförmig aufgetragen. Es fand ebenfalls eine Co-Chromatographie mit den Vergleichssubstanzen statt, wobei bei 254nm mittels Fluoreszenzlöschung detektiert wurde.

Folgende Fließmittel kamen zur Anwendung:

Fließmittel

Chloroform/Methanol/Eisessig

85:13:2

Fließmittel

Chloroform/Methanol/konzentrierter Ammoniak

85:14:1

6.10.2.4 Identifikation der Metaboliten mittels von GC/MS

Zur Identifizierung der Metaboliten mittels GC/MS wurden die gewonnenen Einzelfraktionen eingesetzt. Die Untersuchungen fanden unter folgenden Bedingungen statt:

HP-5 MS, 30m, Innendurchmesser 250µm, Filmdicke 0,25µm

Aufheizung von 180 auf 300°C mit 10°C pro Minute

Split 1:20

70eV

70EI

Massenscan 40-500


[Seite 119↓]

6.10.3  FLM 5011

6.10.3.1  Gewinnung der Metaboliten

2x107 Hep G2 Zellen wurden mit 25µg/ml FLM 5011 mit 150ml Medium 72h inkubiert. Das Medium mit den Zellen, die mit einem cellscraper entfernt wurden, wurde auf pH 4,8 eingestellt und mit 0,25ml eines ß-Glucuronidase/Sulfatase-Gemisches (siehe 6.8.1) versetzt. Nach 2h wurde das Medium 3mal bei pH 3 und 3mal bei pH 9 mit einem Chloroform/Isopropanol-Gemisch (3:1) extrahiert. Die Extrakte wurden am Rotations-verdampfer eingeengt und in Methanol aufgenommen.

6.10.3.2 Isolation und Identifikation der Metaboliten mittels HPLC

Die Trennung der Metaboliten erfolgte wie unter 6.10.1.2 beschrieben. Die Metaboliten wurden bei 312nm, ein Absorbtionsmaximum der Oxim-Metaboliten, und bei 330nm, ein Absorbtionsmaximum der Keton-Metaboliten, detektiert. Zusätzlich wurden Spektren aufgenommen. Die Co-Chromatographie fand unter gleichen Bedingungen statt.

6.10.3.3 Identifikation der Metaboliten mittels DC

Die eingeengten Fraktionen, die bei der HPLC gewonnen wurden, wurden auch hier für die DC eingesetzt. Es wurden Silica Gel F254 Dünnschichtplatten benutzt und die Methanolextrakte wurden bandenförmig aufgetragen. Zusätzlich fand eine Co-Chromatographie mit den Vergleichssubstanzen statt. Detektiert wurden die Substanzen durch Fluoreszenzlöschung bei 254nm und durch Eigenfluoreszenz bei 366nm, wobei die Metaboliten mit einer Oximgruppe eine blaue und die mit einer Ketongruppe eine bräunliche Fluoreszenz aufwiesen und so leicht voneinander unterschieden werden können.

Folgende Fließmittel kamen zur Anwendung:

1. Fließmittel

Toluol/Methanol

95:5

2. Fließmittel

Chloroform/Acetonitril/Methanol

80:10:10

3. Fließmittel

Toluol/Ethylacetat

85:15

6.10.3.4 Identifizierung der Metaboliten mittels MS

Die Aufnahme der Massenspektren wurde wie unter 6.10.1.4 durchgeführt.


[Seite 120↓]

6.10.3.5  Bestimmung der Umsatzrate

Zur Bestimmung der Wiederfindungsrate wurden 25µg/ml FLM 5011 in 150ml Kulturmedium gelöst und entsprechend 6.10.3.1 extrahiert und aufgearbeitet. Das methanolische Extrakt der Wiederfindungsraten, die Proben, sowie FLM 5011-Standardlösungen zum Erstellen einer Kalibrierungsgeraden wurden mit Hilfe des CAMAG DC-Probenautomats auf 10x10cm HPTLC-Kieselgel-60-Platten ohne Fluoreszenzindikator aufgesprüht. Die HPTLC-Platten wurden in einer Horizontalkammer mit Fließmittel 2 entwickelt. Mit dem CAMAG Scanner wurde bei einer Wellenlänge von 316nm die Absorptionen gemessen und über die Peakflächen eine Kalibrierungsgerade erstellt und der FLM 5011 Gehalt in den Proben errechnet. Dies erfolgte mit Hilfe des CAMAG Auswerteprogramms CATS Version 3.15.

Ebenso wurde bei AWD 100-041 und AR 12463 verfahren, wobei für letzteres keine Umsatzrate bestimmt werden konnte, da es nicht-enzymatisch fast vollständig zu einem Disulfid umgewandelt wurde, welches in keinem Lösungsmittel löslich war.

6.11 Zytotoxizitätsbestimmungen

6.11.1 Der Amidoschwarztest

Die kultivierten Hep G2-Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet und nach Zählung mit dem Casy-Zellzählgerät in Medium suspendiert und auf eine Zelldichte von 105 Zellen/ml eingestellt. Durch Schütteln wurden die Zellen am Sedimentieren gehindert. Danach wurden jeweils 100µl Zellsuspension pro well in eine Flach-Boden-96well TC Mikrotiterplatte pipettiert und die Zellen 24h kultiviert. Die zu prüfenden Substanzen wurden mit Hilfe von DMSO in Medium gelöst und 100µl dieser Substanzlösungen wurden in jedes well pipettiert. Nun wurde 4, 24 oder 72h inkubiert.

Nach erfolgter Inkubation wurde das Medium vorsichtig entfernt und zwecks Fixierung der Zellen in jedes well 100µl Acetat-gepufferte Formaldehydlösung (10% Formaldehyd in 0,1M Natriumacetat/Essigsäure-Puffer, pH 3,5) gegeben. Nach 15min wurde der Überstand vorsichtig abgesaugt.

Zur Färbung der Zellproteine wurde jedes well mit 100µl Amidoschwarz-Lösung (100mg Amidoschwarz 10B in 100ml 0,1M Natriumacetat/Essigsäure Puffer pH 3,5 gelöst und filtriert) versetzt. Die Farbstofflösung wurde nach 30min restlos entfernt.

Um nicht absorbierten Farbstoff auszuschwemmen, wurde jedes well mit 150µl HCl-angesäuertem Wasser (pH 3,5-5) gewaschen.

Durch Zugabe von 150µl 50mM NaOH pro well wurde die proteingebundene Farbe eluiert und [Seite 121↓] 10min Schütteln auf einem Plattenschüttler homogenisiert.

Die Absorption wurde mit einem Mikrotiterplatten-Photometer gemessen. Dabei wurde die Absorption bei der Wellenlänge des Absorptionsmaximums von Amidoschwarz 10B (620nm) und die Absorption bei der Wellenlänge des Absorptionsminimums (450nm) voneinander abgezogen.

6.11.2 Der LDH Test

Zur Bestimmung der LDH-Aktivität wurde das Cytotoxicity Detection Kit von Boehringer Mannheim eingesetzt.

Die kultivierten Hep G2-Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet und nach Zählung mit dem Casy-Zellzählgerät in Medium suspendiert und auf eine Zelldichte von 105 Zellen/ml eingestellt.

Nun wurden 200µl Zellsuspension pro well in 96well-Mikrotiterplatten eingesät und 24h kultiviert. Das Medium wurde nun entfernt und durch 200µl Medium ersetzt, das die zu prüfenden Substanzen enthielt. Nach 24h Inkubation wurden 100µl Überstand entnommen, in eine andere 96well-Mikrotiterplatte pipettiert und mit 100µl Reaktionspuffer versetzt. Der Reaktionspuffer enthielt das Tetrazolium-Salz 2-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazoliumchlorid und als Katalysator Diaphorase. Im Dunkeln wurde 30min inkubiert. Die Auswertung fand mit einem Mikrotiterplatten-Photometer statt bei einer Wellenlänge von 450nm und einer Referenzwellenlänge von 620nm.

Zur Berechnung der Zytotoxizität waren des weiteren ein Mediumleerwert (ML), ein Wert für die in Medium gelöste Substanz, für den Fall, daß diese die Reaktion beeinflußt, ein Wert für die LDH-Aktivität bei unbehandelten Zellen (minK) und ein Wert für maximale LDH-Aktivität (maxK), der durch Zugabe von 2% Triton X 100 zu den Zellen erstellt wurde, erforderlich.

Errechnung der Zytotoxizität:

6.11.3 Bestimmung der Zytotoxizität durch Quantifizieren des DNA-Gehalts

Hep G2-Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet, in Medium suspendiert und nach Zählung mit einem Casy Zellzählgerät auf 50000 Zellen/ml eingestellt. 1ml der Zellsuspension wurde in jedes well einer 24well-Platte eingesät. Nach 24h wurde das Medium abgesaugt und mit 1ml frischem Medium ersetzt und die zu prüfenden Substanzen hinzugefügt. Nach 24 oder 72h Inkubationszeit wurde das Medium abgesaugt und die Zellen bei -20°C eingefroren. Nach zweimaligem Einfrieren und Auftauen wurde jedes well mit 100µl Aqua dest. versetzt, bei 37°C [Seite 122↓] inkubiert und dann erneut eingefroren. Nach erneutem Auftauen wurde in jedes well 300µl eines Puffers mit folgender Zusammensetzung pipettiert:

Na2HPO4•12H2O

1,96g

NaH2PO4•H2O

0,164g

NaCl

15,6g

EDTA

0,1g

Es wurde auf 100ml mit destilliertem Wasser aufgefüllt und vor Gebrauch 1:0,25 verdünnt.

In Eppendorfgefäßen wurden nun 30µl bisBenzimid-Lösung (10µg/ml in destilliertem Wasser) vorgelegt, mit 270µl der Zellsuspension vermischt und dann auf 1500µl mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Die Proben wurden dann fluorimetrisch bei einer Emissionswellenlänge von 356nm und einer Exitationswellenlänge von 458nm vermessen. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe einer Kalibrierungsgeraden.

6.12 Nachweismethoden für Apoptose

6.12.1 DNA-Leiter

2x106 Zellen wurden für 4 und 24h mit 0,05mM FLM 5011 inkubiert. Dann wurden sie mit einem cellscraper geerntet, in 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan HCl-Puffer (TRIS HCl) pH7 suspendiert und bei 1500g für 5min zentrifugiert. Nun folgte die Lyse der Zellen mit Hilfe von 400µl Lysepuffer.

Lysepuffer:

Tris HCl

10mM

 

EDTA

10mM

 

Triton X 100

0,2%

 

pH 7,5

 

Nach einer Inkubation von 2min auf Eis wurde wiederum zentrifugiert bei einer Beschleunigung von 13000g für 10min. Der Überstand wurde extrahiert mit einer Chloroform/Phenol-Mischung 1:1.

Die wäßrige Phase wurde schließlich mit Volumen 1M Natriumacetat-Puffer pH 7 versetzt.

Nach Hinzufügen von 2 Volumenteilen 96% Ethanol wurde 20min bei -20°C inkubiert und schließlich bei 13000g für 15min zentrifugiert. Im Pellet befand sich nun die DNA, die nochmals mit 70% Ethanol gewaschen wurde. Nach Resuspension in 200µl TE-Puffer wurde die Probe [Seite 123↓] bei 37°C mit 0,1mg RNase behandelt.

TE-Puffer:

Tris HCl

10mM

 

EDTA

1mM

 

pH 8,0

 

Die Probe wurde 1:1 mit dem Auftragepuffer vermischt und für die Elektrophorese aufgetragen.

Die DNA-Elektrophorese wurde bei 100V und 100mA in einem 1,5% Agarosegel für 1h in TAE-Puffer durchgeführt.

Auftragepuffer:

Glycerin

50% (v/v)

 

Natrium Dodecylsulfat

0,2%

 

Bromphenolblau

0,05%

 

Xylencyanol

0,05%

 

in TAE Puffer

 

TAE-Puffer:

Tris-Base

2M

 

Essigsäure

1M

 

EDTA

0,1M

 

pH 8,3

 
 

vor Gebrauch 1:50 zu verdünnen

 

Die DNA wurde visualisiert durch 10-30 minütiges Behandeln mit einer 0,001‰ Ethidiumbromid-Lösung. Nach waschen in destilliertem Wasser konnte das Agarosegel unter einer UV-Lampe bei 366nm betrachtet werden.

6.12.2 Anfärben von apoptotischen Zellen mit Annexin-V-Biotin

Zum Färben der mit FLM 5011 für 4h inkubierten Zellen wurden 105 Hep G2-Zellen mit 100µl Annexin-V-Biotin Lösung für 15min inkubiert. Anschließend wurden sie 2mal mit Puffer gewaschen.

Waschpuffer:

HEPES

10mM

 

NaCl

140mM

 

CaCl2

5mM

Der Puffer wurde mit NaOH auf pH 7,4 eingestellt. Nun wurden die Zellen luftgetrocknet und [Seite 124↓] mit einer Methanol/Ethanol-Mischung 1:1 fixiert. Wieder wurde luftgetrocknet und dann mit 100µl Streptavidin-Peroxidase-Konjugat-Lösung 1h inkubiert. Ein weiterer Waschschritt wurde angeschlossen und dann 100µl der Substratlösung, die Diaminbenzidin enthielt, hinzugefügt. Nach 15min und einem erneuten Waschschritt konnten die Zellen unter dem Lichtmikroskop betrachtet werde, wobei die apoptotischen Zellen rotbraun angefärbt waren. Als Kontrolle wurde eine weitere Kultur, die kurz mit Trypanblau behandelt wurde, betrachtet, um ein Anfärben von nekrotischen Zellen auszuschließen.

6.12.3 ApoAlert FLICE Assay von CLONTECH Laboratories

5x105 Hep G2-Zellen wurden mit 0,05mM FLM 5011 für 1h, 4h und 24h inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen geerntet und bei 200g für 5min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde nun in 50µl eiskaltem Zell-Lyse-Puffer resuspendiert und 10min auf Eis inkubiert.

Das Zellysat wurde wiederum für 3min bei 12000g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde nun mit 50µl Reaktionspuffer, der 10mM Dithiotreitol enthielt, und 5µl 1mM IETD-AFC (Isoleucin-Glutamat-Threonin-Aspartat-7-Amino-4-trifluoromethylcoumarin), dem konjugiertem FLICE-Substrat, versetzt und 1h bei 37°C inkubiert.

Nun wurde die Fluoreszenz bei einer Exitationswellenlänge von 380nm und einer Emissionswellenlänge von 508nm gemessen. Zur Quantifizierung der Protease-Aktivität wurde eine Kalibrierungskurve aufgenommen. Dazu wurde AFC in Zell-Lyse-Puffer gelöst und die Fluoreszenzintensität (Fl) von 0, 0,1, 0,2, 0,4 und 0,8nmol AFC gemessen.

Als Negativkontrolle fungierte eine unbehandelte Hep G2-Kultur. Als Leerwert wurde für jeden Zeitpunkt eine Probe parallel mitgeführt, die nicht mit konjugiertem FLICE-Substrat versetzt wurde.

Um sicher zu sein, daß die Fluoreszenz auf eine FLICE-Aktivität zurückzuführen ist, wurde jeweils eine Probe mit FLICE-Inhibitor versetzt. Dazu wurde direkt vor dem Zusatz des FLICE-Substrats 50µl Reaktionspuffer und 0,5µl der IETD-fmk-Inhibitor-Lösung (IETD-Fluoromethylketon) zu dem Überstand nach der Zentrifugation hinzugefügt. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C wurde weiterhin genauso verfahren wie mit den anderen Proben.


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10.09.2004