| Mundry, Tobias: Einbrennsilikonisierung bei pharmazeutischen Glaspackmitteln - Analytische Studien eines Produktionsprozesses |
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Nach dem Einbrennen des wäßrigen Silikonfilmes aus wäßriger Emulsion verbleibt das thermostabile Polydimethylsiloxan auf der Oberfläche des Glases. Das Wasser der Emulsion wird verdampft. Zu den enthaltenen Emulgatoren äußert sich z. B. Dow Corning mit der Aussage, daß diese Stoffe durch die Verdünnung vor der Anwendung bereits auf einen nicht nachweisbaren Gehalt gebracht werden: "Therefore, they do not interfere with the customer`s solutions and they are not of any consequence for consideration in heating and sterilization processes" (Produktinformation Dow Corning [ 238 ]). Hiermit ist offensichtlich gemeint, daß die Substanzen durch die Heißluftsterilisation zerstört werden.
In den unverdünnten Silikonölemulsionen sind Emulgatoren im einstelligen Prozentbereich enthalten. Geht man von einer Verdünnung der Emulsion vor der Anwendung von ca. 1:20 aus, so ist in der anwendungsfertigen Emulsion mit Konzentrationen von ca. 0.1-0.01% zu rechnen. Dieser Gehalt ist aber entgegen der obigen Aussage problemlos nachzuweisen.
Sollten auch nach dem Einbrennen der Emulsion noch meßbare Mengen von Emulgatoren zurückbleiben, müßte damit gerechnet werden, daß durch Grenzflächeneffekte Wechselwirkungen zwischen Produkt und Silikon eintreten könnten.
Es war Ziel dieser Studie herauszufinden, ob sich in einbrennsilikonisierten Behältnissen noch detektierbare Anteile der entsprechenden Emulgatoren befinden, und eine Strukturanalyse der Detergentien durchzuführen.
Handelsübliche Silikonölemulsionen z.B. von Dow Corning oder Bayer enthalten Polydimethylsiloxan zumeist in einer Konzentration von ca. 36% [ 239 , 240 , 241 ] in Wasser für Injektionszwecke. Bei den in Silikonölemulsionen befindlichen Emulgatoren handelt es sich nach Herstellerangaben [ 239 , 240 , 241 ] um Substanzen vom nichtionischen Typ.
Es besteht außerdem die Möglichkeit, daß Konservierungsmittel zugesetzt werden, um die wäßrigen Emulsionen für längere Lagerzeiten zu stabilisieren.
In der Silikonölemulsion der Fa. Dow Corning sind nach firmeneigenen Angaben [ 241 ] nichtionische Emulgatoren und Konservierungsstoffe enthalten.
In Frage kommende Substanzklassen sind z.B.:
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Zur Konservierung wäßriger Systeme im pharmazeutischen, im Lebensmittel- und kosmetischen Bereich werden typischerweise häufig Benzoesäure oder p-Hydroxybenzoesäureester verwendet.Ein wesentliches, immer wiederkehrendes Strukturelement bei den meisten nichtionischen Emulgatoren sind die wechselnd langen Polyethylenglycol-Seitenketten. Diese können durch Einwirkung von Ethylenoxid auf unterschiedliche Alkohole an verschiedene lipohile Ketten gebunden werden.
Deren allgemeine Formeln können wie folgt angegeben werden:
Abb. 114 allgemeine Strukturformeln von nichtionischen Emulgatoren für Silikonölemulsionen
a) ethoxylierte Sorbitanfettsäureester; b) Polyoxyethylenalkylphenolether
c) Polyoxyethylenfettalkoholether; d) Polyoxyethylentriglyceride
Der lipohile Molekülteil ist variabel. Häufig werden Fettsäuren oder Fettalkohole verwendet. Daneben kommen aber auch aromatische Kohlenwasserstoffe zum Einsatz, deren Seitenketten häufig verzweigte Nonyl- oder Octylgruppen darstellen. Bei den sogenannten Polyoxyethylentriglyceriden werden die PEG-Anteile nicht einfach an den hydrophoben Teil angehangen, sondern schieben sich nach primärer Verseifung zwischen das Glycerol- und die Fettsäuremoleküle.
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Zunächst sollten die in den Emulsionen enthaltenen Emulgatoren, wenn möglich, bezüglich ihrer Stoffklasse identifiziert werden. In einem zweiten Schritt sollte geprüft werden, inwieweit der Nachweis mit den gewählten Methoden möglich ist und bei Validität des entwickelten Modells dieses anschließend auf entsprechend eingebrannte Silikonöle angewendet werden.
Neben der kernmagnetischen Resonanzspektroskopie wurde die Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie als Verfahren für die Spurenanalyse von Emulgatoren in eingebrannten Silikonölemulsionen ausgewählt.
Besonders nützlich neben der ausreichenden Empfindlichkeit ist die Tatsache, daß Polydimethylsiloxan im 1H-NMR-Spektrum nur ein einziges Resonanzsignal erzeugt. Dieses Signal tritt außerdem nur als Singulett und mit sehr geringer chemischer Verschiebung bei ca. 0.1 ppm im Spektrum auf. Daher konnte bei den vergleichenden Analysen auch auf den Einsatz von Tetramethylsilan (TMS) als internen Standard verzichtet werden, indem das Silikonsignal auf 0 ppm referenziert wurde.
Jede von PDMS verschiedene wasserstoffhaltige Gruppierung kann also ohne Überlappung von Signalen problemlos im Spektrum beobachtet werden.
Nichtionische Emulgatoren wie die oben angeführten enthalten zahlreiche verschieden gebundene H-Atome im Molekül und können daher selektiv von diesem 1H-NMR Verfahren erfaßt werden.
Die Isolierung und Strukturbewertung der Emulgatorfraktion aus Silikonölemulsionen kann durch Abtrennung und Charakterisierung mit Matrix unterstützter Laser-Desorptions-Ionisations-Massenspektroskopie erfolgen (MALDI-TOF). Man erhält dadurch Aussagen über die Zusammensetzung dieser Fraktion.
In der Literatur finden sind Überblicke über instrumentelle Verfahren, die zur Analyse von Emulgatoren geeignet sind. Beschrieben worden sind neben NMR- und IR-Spektroskopie auch die Gaschromatographie, Massenspektroskopie, UV- sowie Ramanspektroskopie und Thermoanalyse [ 242 , 243 ].
Nadeau [ 244 ] diskutierte ebenfalls instrumentelle Analysemöglichkeiten für nichtionische Emulgatoren. Näher eingegangen wurde dabei vor allem auf die Absorptionsspektroskopie im UV-, IR- und Nah-IR-Bereich sowie auf NMR- und Röntgendiffraktionsanalyse.
Es existieren einige ältere Arbeiten aus den 60er Jahren, die sich mit der Analyse von nichtionischen Detergentien auseinandersetzen. Im Vordergrund stand dabei aber weniger die Detektion von Emulgatorspuren als vielmehr die Strukturanalyse der Substanzen selbst.
Walz und Kirschnek [ 245 ] zeigten, daß die NMR-Spektroskopie "als wertvolle Ergänzung zur Infrarot- und Ultraviolett-Analyse grenzflächenaktiver Verbindungen" genutzt werden kann.
Greff und Flanagan [ 246 ] wendeten die NMR-Methodik auf eine Reihe von kommerziellen nichtionischen Emulgatoren an.
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In einer weiteren Arbeit von Flanagan et al. [ 247 ] wurde vor allem die Präzision der Bestimmung der Anzahl von Ethylenglycol-Einheiten im Molekül überprüft.Crutchfield et al. [ 248 ] führten ebenfalls umfangreiche Analysen mit verschiedenen nichtionischen Emulgatoren durch. Sie erarbeiteten Werte von zahlreichen unterschiedlich substituierten Alkylphenolen und -benzolen.
Eine NMR-Methode zur Endgruppenanalyse bzw. Molekulargewichtsbestimmung bei Polyalkylenglycolen bzw. deren Estern wurde von Page und Bressler [ 249 ] vorgestellt.
Ludwig [ 250 ] charakterisierte PEG- oder PPG-Addukte von Alkylphenolen und Alkoholen umfassend mit NMR-Spektroskopie. Für eine Reihe von kommerziellen Produkten (z.B. Pluronic® und Alfol®) wurde der Gehalt an primären OH-Gruppen als Maß für die Anzahl von PEG- bzw. PPG-Einheiten bestimmt. Da häufig breite Verteilungen vorliegen, ist es sinnvoll, auch Trennmethoden zur Analyse heranzuziehen. Mit derivatisierender Gaschromatographie, Dünnschicht- und Gelpermeationschromatographie wurden in dieser Studie zusätzliche Daten gewonnen.
Die konzentrationsabhängige Intensität des PDMS-Methylpeaks kann auch problemlos für die quantitative Bestimmung von Silikonöl eingesetzt werden. So wendeten Anhoury et al. [ 251 ] das Verfahren zur Quantifizierung von verschiedenviskosen Silikonölen an, die als Gleitbeschichtung auf Injektionskanülen aufgebracht waren. Im Vergleich mit einer Standard-IR-Methode wurden dabei gleiche Ergebnisse erzielt.
Zur Spektrenaufnahme wurde eine 500 MHz-Anlage der Fa. Bruker, Modell AMX-500 eingesetzt. Folgende Parameter wurden für die Messungen verwendet:
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1H |
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5 mm 1H-Probenkopf |
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27° C |
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2.03161 sec |
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0.2461 Hz |
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32768 |
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2048 |
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161239.03 Hz |
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500.140 MHz |
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CDCl3 bzw. MeOD |
Für die Spurenanalyse wurden die Spektren mit Unterdrückung der Lösemittel- bzw. Silikonsignale aufgenommen.
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Tab. 43 unterdrückte Signale zur Spurenanalyse
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H2O |
CHCl3 |
MeOH |
Polydimethylsiloxan |
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Aufnahme in MeOD |
4.81 ppm |
_ |
3.30 ppm |
0.11 ppm |
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Aufnahme in CDCl3 |
1.55 ppm |
7.27 ppm |
_ |
0.11 ppm |
Dazu wurde ein modulierter Frequenzpuls in die entsprechenden Bereiche eingestrahlt, um die Signale zu sättigen (siehe Tab. 43 ).
Die Spektrenaufnahme erfolgte durch Aufbringen der im NMR-Teil verwendeten Lösungen auf KBr-Leerpreßlinge (Herstellung siehe 11.3.4 ) und Verdampfen des Lösemittels bei Raumtemperatur. Es wurden unterschiedliche Volumina zwischen 20 µl und 90 µl verwendet. Vom verbleibenden Film wurde ein Transmissions- Spektrum aufgezeichnet.
Zur Spektrenaufnahme wurde ein Fourier-Transform-Infrarot-Spektrometer mit nachfolgender Spezifikation und Meßparametern verwendet.
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Perkin-Elmer FT-IR, Paragon-1000 |
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DTGS |
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stark |
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4000-400 cm-1 |
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2 cm-1 |
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4 cm-1 |
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Jede Probenmessung erfolgte gegen Abzug des spektralen Hintergrundes (ratio-mode), der alle 2h erneut aufgenommen wurde.
Die Analyse erfolgte durch Lösen der isolierten Emulgatorfraktion und Zugabe einer geeigneten Matrix mit nachfolgenden Geräteparametern.
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Fisons Scientific VG-Tofspec |
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Flugzeit (TOF) im Reflectron-Betrieb |
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4.68 J/m2 bei 337nm (Attenuation: 3.95) |
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4 ns |
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150 x 400 µm |
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250 mHz |
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21 kV (Reflectron), 23 kV (linear) |
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[2-(4-hydroxyphenylazo)]-Benzoesäure (HABA) |
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Tetrahydrofuran (THF) |
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3. Dow Corning 365 medical grade Emulsion, 1.8%, dehydratisiert
3a. Dow Corning 365 medical grade Emulsion, 1:100 verdünnt, 0.018%, dehydratisiert
4. Dow Corning 365 medical grade Emulsion, 1.8%, hitzebehandelt (Einbrennsimulation)
5. Baysilone-Ölemulsion-H, 1.8% dehydratisiert
6. Baysilone-Ölemulsion-H, 1.8% hitzebehandelt (Einbrennsimulation)
7. Polyoxyethylen-Nonylphenol (= Triton-X-100®, Fa. Fluka-Chemicals)
8. Sorbitan-Polyoxyethylen-Laurat (= Polysorbat-20 bzw. Tween-20®, Fa. Merck)
Die Proben 3-6 wurden zunächst im Verhältnis 1:20 mit Reinstwasser verdünnt.
Von den Proben 3 und 5 wurden je 200 mg in ein 4ml-HPLC-Vial eingewogen. Anschließend wurden die beschickten Vials im Trockenschrank bei 105° C für 2 h eingetrocknet.
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Eine zusätzliche Probe (3a) wurde durch weitere Verdünnung der Probe 3 im Verhältnis 1:100 hergestellt (Endkonzentration: 0.018% Silikonöl).Die Einwaage für die Proben 4 und 6 betrug 300 mg. Die Vials mit der Emulsion wurden anschließend für 20 min im Muffelofen bei 330° C erhitzt.
Die dehydratisierten und hitzebehandelten Proben wurden analog 13.3.4.2.1 vor der Messung in 0.7 ml Lösemittel aufgenommen und das Spektrum anschließend aufgezeichnet.
Einwaagen von je ca. 10 mg erfolgten in die gleichen Vials wie auch für die Emulsionsproben. Nach Aufnahme in eine entsprechende Menge Lösemittel wurde das Spektrum aufgezeichnet.
Auf Grund der verschiedenen Löslichkeit der Emulgatoren und des Silikonöls in lipophilen bzw. hydrophilen organischen Lösemitteln wurde eine Flüssigextraktion durchgeführt. Nach Entfernung des Wasseranteils wurden die Emulgatoren mit Methanol aus dem Rückstand extrahiert.
Für eine Probe wurden 20 ml in einen Rundkolben pipettiert. Anschließend wurde das Wasser durch Trocknen während 48 h im Trockenschrank bei 90° C entfernt. Der ölige Rückstand wurde dann 3 x mit je 10 ml Methanol p.A. im Rundkolben ausgeschüttelt. Es wurde die Trennung der Silikon- und Methanolphasen abgewartet und dann der methanolische Überstand dekantiert. Die vereinigten Extrakte wurden über Na2SO4 getrocknet und am Rotationsverdampfer zur Trockne eingeengt. Der teilweise ölige (Dow Corning) oder feste (Baysilone) Rückstand wurde für die Analyse verwendet.
Ausgehend von einem Orientierungswert für den Gehalt an Emulgatoren in handelsüblichen Produkten wird im folgenden eine Modellrechnung angestellt, aus der die bei Verwendung der hier dargestellten Methode minimal nachzuweisenden Mengen an Emulgatoren abgeleitet werden.
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Durch Isolation der Emulgatorfraktion ( 13.3.4.2.4 ) aus Silikonölemulsionen und gravimetrische Bestimmung dieses Anteils errechnet sich bei den Emulsionen Baysilone-H und DC 365 ein Massenanteil von ca. 3%. Es wird daher hier der Fall konstruiert, der einen Gehalt von zwei unterschiedlichen Emulgatoren mit einem Massenanteil von je 1% in der Silikonölemulsion voraussetzt.In 100 ml Glaszylindern wurden nach einem typischen Silikonisierprozess ca. 1.8 mg Silikonöl wiedergefunden (IR-spektroskopische Quantifizierung). Der Extrakt von je zwei 100 ml Glaszylindern (entsprechend 3.6 mg) sollte untersucht werden. Die Berechnung ergibt daher, daß diese Menge in einer Masse von 200 mg verdünnter Silikonölemulsion (1.8%) enthalten ist. Ziel ist es, die in dieser Menge enthaltenen Gewichtsanteile pro Emulgator nachweisen zu können.
Bei einem Gehalt von 0.05% pro Emulgator in der anwendungsfertigen, verdünnten (1:20 = 1.8%) Emulsion sind in 200 mg Silikonölemulsion 0.1 mg eines jeden Emulgators enthalten.
Im untersuchten Analysenmaterial aus 2 Kartuschenzylindern von je 100 ml bzw. 20 Injektionsflaschen (siehe 13.3.4.1.1 ) sollten demzufolge je 100 µg eines Emulgators nachweisbar sein.
Durch die weitere Verdünnung von 1:100 reduziert sich die in einer Probe enthaltenen Menge an Emulgator auf 1µg pro Substanz. Mittels der stark verdünnten Probe sollte gezeigt werden, ob die Emulgatoren auch nach Reduktion ihrer Masse um den Faktor 100 noch nachgewiesen werden können.
Bei der IR-Spektroskopie kann nicht die gesamte Lösung zur Analyse verwendet werden. Deswegen wird eine Detektionsgrenze in Prozent angegeben. Bezogen auf den Silikonölanteil von 36% enthält die angenommene Emulsion also 1:35 = 2.8% eines jeden Emulgators. Es muß also, wenn die Emulgatoren beim Einbrennen nicht zerstört werden, zumindest dieser Anteil neben PDMS im Spektrum detektierbar sein. Bei angenommener Reduktion durch die thermische Behandlung sollte allerdings ein wesentlich geringerer Anteil erfaßt werden. Da die Erkennung von Substanzen eines Gehaltes von 5% neben einer Hauptsubstanz mit IR bereits häufig nicht möglich ist, werden Spurenverunreinigungen mit dieser Methodik nicht nachgewiesen.
Alle Spektrenaufnahmen erfolgten in CDCl3, einem Lösemittel, welches für Silikonöl gut geeignet ist. Zwar lösen sich Emulgatoren besser in hydrophilen Medien wie z.B. Methanol, jedoch sollte sichergestellt werden, daß mit der Methode (Extraktion des gesamten löslichen Silikons mit Toluol) die Emulgatoren auch erfaßt werden können und eine Spektrenaufnahme nicht an der unvollständigen Ablösung des Silikonanteils scheitert.
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Es wurden zwei Modellversuche vorbereitet. Dazu wurden die kommerziellen Silikonölemulsionen in einer Menge von 200-300 mg abgewogen und in kleine Glasvials (4 ml) verbracht (siehe 13.3.4.2.2 ).
Nach der gewünschten Dehydratisierung im Trockenschrank bzw. nach der Erhitzung im Muffelofen (siehe 13.3.4.2.2 ) wurde der jeweilige Rückstand in 1 ml CDCl3 aufgenommen und durch mehrfaches Umschwenken in Lösung gebracht. Von beiden Proben wurden unter den oben genannten Bedingungen 500 MHz-Spektren aufgezeichnet.
Neben dem dominierenden Signal der Methylprotonen des PDMS bei ca. 0.1 ppm sind im Spektrum der entwässerten Silikonölemulsion zahlreiche Signale zu erkennen ( Abb. 115 ).
Abb. 115 500 MHz 1H-NMR Spektren thermisch belasteter DC-Silikonölemulsionen (DC 365)
Im Bereich aliphatischer Protonen fallen die drei intensiven peaks bei 0.7, 1.3 und 1.7 ppm auf. Diese sind in ihrer Lage identisch mit der Gruppierung im später aufgezeichneten Spektrum von Triton-X-100® und ihre Integration ergibt das gleiche Verhältnis von 9:6:1.
Weiterhin sind im Bereich aromatischer Protonen einige Signale zu erkennen. Diese können bei vergrößerter Darstellung als zwei isolierte Spinsysteme von p-substituierten Aromaten erkannt werden (S1: 6.81+7.26 ppm und S2: 6.83+7.93 ppm). System 1 wird vom Lösemitte-
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signal des CDCl3 bei 7.26 ppm überlagert. System 1 zeigt eine identische Verschiebung wie die aromatischen Protonen im Spektrum von Triton-X-100® (vergleiche Abb. 120 ).Sehr intensiv ist auch die Resonanz bei 3.6 ppm (Methylenprotonen von PEG-Ketten).
Weitere Resonanzen von aliphatischen Protonen finden sich bei 0.88, 1.26, 2.32 und 4.22. Eine fast identische chemische Verschiebung zeigen auch Signale im Spektrum des zum Vergleich ausgewählten Sorbitanesters. Vor allem der mittelstarke peak bei 1.26 ppm deutet auf das Vorliegen einer längeren aliphatischen Kette mit mehreren CH2-Gruppen hin (vergleiche Abb. 120 ).
Aus der Summe dieser Informationen kann abgeleitet werden, daß mit hoher Wahrscheinlichkeit in der Emulsion ein ethoxyliertes Alkylphenol vom Triton-Typ und möglicherweise ein Sorbitan Fettsäureester in geringerer Konzentration vorliegen.
Das aromatische System 2 rührt evtl. von Konservierungsstoffen vom PHB-(p-hydroxybenzoesäure)-typ her. Die Literaturspektren [ 252 ] solcher Substanzen weisen entsprechende Signale auf.
Nach der Hitzebehandlung bei über 300° C hat sich das Spektrum verändert ( Abb. 115 ). In dem bereits mit größerer Intensität gezeigten Spektrum finden sich neben dem immer noch sehr starken Silikonsignal nur noch schwache peaks im übrigen Bereich des Spektrums. Immer noch erkennbar sind die peaks Nr. 2, 7 und 8 des verzweigten Alkylsubstituenten des betreffenden Alkylphenols.
Abb. 116 500 MHz 1H-NMR Spektren thermisch belasteter Baysilone-Ölemulsion-H (36%)
An weiteren typischen Signalen ist die breite Gruppe bei 3.6 ppm identifizierbar. Außerdem findet sich ein sehr schwaches Signal des Aromaten-Spinsystems 1 bei 6.82 ppm. Die peaks
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bei 7.26 und 1.58 ppm stammen vom Lösemittel (CDCl3+H2O in CDCl3). Neu aufgetreten sind Signale bei 2.2 und 2.48 ppm.Durch diese Probe ist ersichtlich, daß die Menge der enthaltenen Emulgatoren stark reduziert worden ist. Signale von Resten der PEG-Ketten und des substituierten Aromaten (6.8 ppm) sind noch zweifelsfrei zu identifizieren. Unter den Bedingungen dieses Modellversuches sind die Emulgatoren also nicht vollständig abgebaut worden.
Die neu auftauchenden Resonanzen zeugen davon, daß Umsetzungen der Emulgatoren stattgefunden haben. Diese führten zur Bildung von Fragmenten, die nicht näher charakterisiert werden können. Beim schwachen Signal bei 1.25 ppm könnte es sich um die aliphatische Kette einer freigesetzten Fettsäure handeln.
Bei der entwässerten Baysilone-Ölemulsion war ebenfalls eine Lösemittel- bzw. Silikonsignalunterdrückung notwendig, um die entsprechenden Emulgatorpeaks sichtbar zu machen. ( Abb. 116 : Die unterdrückten Bereiche bei 0.05, 7.26 und 1.5 ppm sind wegen Artefaktbildung ausgeblendet.)
Dominierend ist in diesem Spektrum das typische Methylenprotonensignal der PEG-Ketten bei 3.6 ppm. Typische Resonanzen eines Emulgators vom Alkylphenoltyp sind hier nicht zu erkennnen. Die Anwesenheit einer solchen Substanz kann daher ausgeschlossen werden.
Stattdessen findet sich aber eine schlecht aufgelöste peak-Gruppe mit Maxima bei 0.79 und 1.19 ppm. Der Vergleich mit Literaturspektren [ 253 ] zeigt, daß diese Gruppierung typischerweise bei Fettsäurestrukturen, z.B. Estern ungesättigter Fettsäuren, auftritt. Bei breiten Gemischen, wie sie bei nichtionischen Emulgatoren vorliegen, kommt es im genannten Spektrenbereich dann zu den stark überlagerten Signalen.
Weitere peaks finden sich bei 4.2-4.3 ppm, die möglicherweise von ungesättigten CH-Strukturen hervorgerufen werden. Bei 8.02 ppm wird ein weiteres sehr scharfes Signal identifiziert. Die starke chemische Verschiebung des Signals kann z.B. von einem Carbonsäure-Proton stammen. Die Zuordnung des scharfen peaks bei 2.1 ppm ist unklar.
Aus diesen Informationen kann geschlossen werden, daß in diesem Produkt Emulgatoren vom Typ der Fettsäure- oder Fettalkoholester mit PEG-Ketten als hydrophilem Element vorliegen. (siehe dazu die Strukturen in Abb. 114 c und d (evtl. mit freien Fettsäureanteilen)).
Damit ist klar, daß als Leitstrukturen für die Emulgatorspurenanalyse v.a. die Resonanzen der Alkylphenole (aromatisch und aliphatisch), die Signale der PEG-Gruppen und von längeren aliphatischen Ketten, wie in Fettsäuren und Fettalkoholen, verwendet werden können.
Nach der Hitzebehandlung ( Abb. 116 unten) können bei normaler Spektrenaufnahme neben den PDMS- und den CDCl3/H2O-Signalen keine peaks der typischen Strukturelemente erkannt werden. Detektierbar sind bei Lösemittelunterdrückung noch die Signale bei 2.1 und 1.2 ppm. Die Emulgatoren sind hier also weitestgehend zerstört worden, zurückgeblieben sind evtl. geringe Reste von schwerflüchtigen aliphatischen Ketten, wie Fettalkoholen oder -säuren.
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Abb. 117 500 MHz 1H-NMR Spektrum von dehydratisierten Silikonölemulsionen (1:100 verdünnt); unten: Baysilone-Ölemulsion-H; oben: Dow Corning 365 Emulsion
Ganz ähnlich stellt sich das Spektrum der zusätzlich 1:100 verdünnten Baysilone und Dow Corning Emulsionen dar. Neben den peaks von PDMS, H2O und Toluol sind nach Sättigung dieser Resonanzen noch deutlich charakteristische peaks der Emulgatoren zu erkennen. Die peaks des Alkylphenols (0.7, 1.3 und 1.68 sowie 6.8) im DC-Produkt fallen schwach aus. Bei beiden Emulsionen gut erkennbar ist die typische Gruppierung bei 3.6 ppm, die den PEG-Anteilen entspricht. Auffällig sind die intensiven peaks bei 1.25 und 2.17 ppm. Sie treten in beiden Spektren gleichermaßen auf. Beide stammen von Emulgatormolekülen. Die genaue Zuordnung dieser peaks ist nicht eindeutig. Bei Peak Nr. 5 handelt es sich wahrscheinlich um die Resonanz von Protonen einer langen CH2-Kette (z.B. Fettsäure oder Fettalkohol, siehe dazu Formelbilder unter 13.2 ). Solche Elemente sind in beiden Produkten vorhanden.
Die Auswertung dieses Spektrums zeigt einerseits an, daß auch bei einer Reduktion der Emulgatoren um den Faktor 100 ein Nachweis möglich ist. Die Verstärkung der letztgenannten peaks (5+9) läßt andererseits eine teilweise Zersetzung der Emulgatoren während der Trocknung vermuten.
Die Analyse der isolierten Emulgatorfraktion lieferte charakteristische Spektren, die eine teilweise strukturelle Aufklärung erlaubten.
Die MALDI-Spektren der Dow Corning- und Baysilone-Emulgatoren zeigen gleichermaßen die Anwesenheit von oligo- bzw. polymeren Produkten an. In beiden isolierten
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Emulgatorfraktionen finden sich zwei (Dow Corning) bzw. drei (Baysilone) unabhängig erscheinende Massenverteilungen.Die Massendifferenz von aufeinanderfolgenden peaks beträgt in allen diesen Verteilungen 44 amu. Daraus kann gefolgert werden, daß es sich immer um homologe Substanzen handelt, die unterschiedlich lange Polyoxyethylen-Seitenketten besitzen (-CH2CH2O = 44).
Bei Spreizung des Spektrums sieht man beim Extrakt aus der Baysilone-Ölemulsion immer eine begleitende zusätzliche Verteilung von peaks mit geringer Intensität. Die Massendifferenz zu den Hauptpeaks beträgt jeweils + 16 amu (siehe Abb. 118 ). Diese begleitenden peaks geben damit Auskunft über den Ionisierungsmechanismus. Die Ionisierung erfolgt bei den Baysilone-Emulgatoren unter Anlagerung von Natrium (Na+) und Kalium (Na+) für die Haupt- respektive Nebenpeaks (Massendifferenz K+-Na+ = + 16 amu). Teilweise sind auch schwache Nebenpeaks mit einer Massedifferenz von -16 amu sichtbar.
Bei der Dow Corning Fraktion ließ sich dieses Verhalten nur schwach beobachten. Grundsätzlich kommt aber ebenfalls eine Ionisierung durch Na+- bzw. K+-Anlagerung in Betracht. Die Vergrößerung des Bereiches zwischen m/z 1100 und 1400 zeigt, daß sich hier beide Serien überlagern. Die zweite Serie, die ebenfalls eine Massendifferenz von 44 amu aufweist (weiß auf schwarzem Grund) nimmt stetig an Intensität zu.
Abb. 118 MALDI-TOF Spektrum der Baysilone Emulgatorfraktion
Ausschnitt: Bereich zwischen m/z 1000 und 1300; Ionisierung durch Na+ und K+ ist gekennzeichnet
Die Anwesenheit von mehreren Serien läßt vermuten, daß in jedem Produkt zumindest zwei Emulgatorentypen vorhanden sind. Sicher ist auch, daß es keine Übereinstimmung zwischen
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den beiden Produkten gibt. Offensichtlich enthalten beide also völlig unterschiedliche Produkte.Es wurden anschließend unter Zugrundelegung der allgemeinen Formeln in 13.2 Molekülmassen für wechselnde Anteile an PEG-Seitengruppen berechnet und mit den Massenzahlen aus den einzelnen Verteilungen verglichen.
Dies fand unter der Voraussetzung statt, daß jeweils Natrium- oder Kaliumanlagerungen vorliegen. Zur jeweiligen Massensumme eines Grundmoleküls wurden daher 23 oder 39 amu addiert. Mögliche variable Fettsäuren oder Fettalkohole wurden aus Literaturübersichten von gängigen pharmazeutisch verwendeten Emulgatoren entnommen [ 254 ].
Für die Sorbitanester wurden als variable Molekülteile die Fettsäuren Laurin-, Palmitin-, Stearin- und Ölsäure entsprechend Polysorbat-20,-40,-60 und -80 eingesetzt.
Als variabler Fettsäureteil der Poloxyethylen-Triglyceride wurde die Ricinol- und Hydroxystearinsäure angenommen. Im Falle der Fettalkoholether wurde als aliphatischer Alkohol der Lauryl-, Cetyl-, Stearyl- und Oleylalkohol eingesetzt.
Abb. 119 MALDI-TOF Spektrum der Dow Corning Emulgatorfraktion
Ausschnitt: Überschneidungsbereich der Serien 1 und 2
Im nächsten Schritt wurde zu den vorstehend beschrieben Massen eine variable Anzahl von Ethylenglycoleinheiten addiert (= Masse des Grundkörpers + 23 oder 39 + n x 44; n = 1-30), um homologe Molekülmassen zu erhalten.
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Der Vergleich der berechneten Massen mit den aus den Spektren erhaltenen führte im Falle von Dow Corning zur Identifizierung von zwei Substanzen. Die erste Serie stimmte mit den berechneten Massen von Na+-Komplexen eines Polyoxyethylen-t-Octylphenols (Triton-X-Typ) überein. Die zweite Serie war deckungsgleich mit dem polyethoxylierten Sorbitan-Laurat (Tween 20®).Auch für den Baysilone-Emulgatorextrakt konnte eine Zuordnung gefunden werden.
Die zweite, sehr breite Serie konnte als Polyoxyethylen-Oleylether identifiziert werden. Die Anzahl der PEG Einheiten erstreckt sich dabei über einen breiten Bereich von n = 15 bis n = 65. Die schwach abgebildete dritte Serie deckt sich mit den Massenzahlen eines Polyoxyethylen-triglycerids (z.B. Macrogol-1500-Glyceroltriricinoleat DAC oder Polyoxyl-35 Castor oil NF). Die Anzahl der PEG-Einheiten beträgt n = 70-80.
Bei der Serie 1 handelt es sich um die doppelt positiv geladenen Ionen der Serie 2 unter Anlagerung von jeweils zwei Na+- oder K+-Ionen.
Abb. 120 500 MHz 1H-NMR-Spektrum von zwei nichtionischen Emulgatoren
Es wurde damit festgestellt, daß die Silikonölemulsionen folgende Emulgatoren enthalten:
Als Bestätigung der MALDI-Strukturanalyse wurden zum Vergleich Spektren der zwei identifizierten Emulgatoren aus der Dow Corning Emulsion aufgezeichnet ( Abb. 120 ).
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In den Spektren finden sich viele charakteristische Resonanzsignale, die sich auch im Spektrum der entwässerten DC-Emulsion ( Abb. 115 ) identifizieren lassen.Die stärksten Signale gehen bei Triton-X-100® ( Abb. 120 ) von den Methylenprotonen der Polyethylenglycolanteile (11), von der tertiär-Octylgruppe (1,4,6) und von den aromatischen Protonen (19,20) aus.
Auch bei Polysorbat-20 resultiert die stärkste Resonanz von den Methylenprotonen der PEG-Seitenketten (11). Weitere Signale stammen von den OH-Endgruppen (7-10), von den Methyl- und Methylenprotonen (2,3,5) der Fettsäure und den Protonen am Sorbitangerüst (12-15).
Nach Charakterisierung der in kommerziellen Silikonölemulsionen enthaltenen Emulgatoren und Entwicklung der beschriebenen Modelle wurden die eingebrannten Silikonöle aus einbrennsilikonisierten Behältnissen extrahiert und analoge Analysen damit durchgeführt.
Für diesen wichtigen Analysenteil wurden entsprechende Kontrollproben mit nicht silikonisierten Glasbehältnissen präpariert, um Substanzen erkennen zu können, die möglicherweise durch die Probenaufarbeitung eingeschleppt werden. Erst dieser Vergleich erlaubt es, die Herkunft von entsprechend detektierten Resonanzsignalen zu differenzieren.
In den normal aufgenommenen Spektren ( Abb. 121 ) waren keine Signale außer den Resonanzen von PDMS bei der silikonisierten Probe und den CDCl3/H2O-peaks sichtbar. Nach der Langzeitmessung mit Unterdrückung dieser drei bzw. zwei Signale sind nun zwei weitere peaks (2,3) im Spektrum zu erkennen.
Allerdings bemerkt man gleich, daß beide Resonanzen im Proben- wie auch im Kontrollspektrum enthalten sind. Es handelt sich dabei also nicht um tatsächlich aus dem Silikonextrakt stammende Substanzen, sondern um aus der Probenvorbereitung resultierende Spurenverunreinigungen. Negative peaks resultieren immer aus der Puls-Einstrahlung zur Signalunterdrückung.
Im Vergleich mit dem Spektrum der dehydratisierten Silikonölemulsion des zur Silikonisierung verwendeten Ausgangsproduktes wird festgestellt, daß keine Signale der für die verschiedenen Emulgatoren und Konservierungsstoffen charakteristischen Gruppen detektiert werden.
Die Anwesenheit von Emulgatorspuren im eingebrannten DC-Silikonöl kann damit ausgeschlossen werden.
Die Einbrennsimulation einer Emulsion in einem Glasvial hinterließ unter den gegebenen Bedingungen noch identifizierbare Spuren von Detergentien ( Abb. 115 ). Es ist aber zu bemerken, daß die Bedingungen für diese Simulation stark von der realen Silikonisierung abweichen. Beim Aufziehen eines Silikonölfilmes auf eine Behältnisinnenfläche entsteht eine wesentlich größere Oberfläche, welche die Zersetzungsprozesse stark beschleunigt.
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Abb. 121 500 MHz 1H-NMR Spektrum einer eingebrannten Dow Corning Silikonölemulsion
Der äußerst schwache peak bei 2.1 ppm findet sich auch im Spektrum der hocherhitzten DC-Silikonölemulsion wieder. Es ist daher möglich, daß dieses Signal von Spuren eines Zersetzungsproduktes verursacht wird, auf Grund seiner schwachen Intensität ist es aber zu vernachlässigen.
Unter identischen Bedingungen wurden auch die extrahierten, eingebrannten Silikonöle einer weiteren Behältnisart analysiert. Die Gläser werden in diesem Fall mit einer anderen Silikonölemulsion behandelt, die auch andere Emulgatoren enthält (siehe 13.4.1 ).
Neben dem Silikonanteil sind im extrahierten Silikonöl aus Injektionsflaschen einige weitere Protonen-Resonanzen zu erkennen. Die peaks des CDCl3 7.0 und 7.6 ppm sind nicht markiert (es handelt sich hier um die 13C-Satelliten des Lösemittelsignals, welche durch die entsprechende Pulsunterdrückung nicht erfaßt werden (gleicher Effekt bei PDMS).
Genau wie auch bei der Untersuchung der Dow Corning Emulsion kann festgestellt werden, daß alle nicht-Silikon-peaks in der Probe wie auch in der Kontrollprobe auftauchen. Es handelt sich daher um nicht verwertbare Signale eingeschleppter Substanzspuren aus der Probenvorbereitung.
Die Ergebnisse aus der Kernresonanzspektroskopie zeigen damit, daß unter den gegebenen Bedingungen keine Überreste von Emulgatoren im eingebrannten Silikonöl zu finden sind. Die Überprüfung der Richtigkeit des Verfahrens erfolgte durch Modellberechnungen und durch Mitführung von Kontrollproben.
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Abb. 122 500 MHz 1H-NMR Spektrum einer eingebrannten Baysilone Silikonölemulsion
In der entwässerten Emulsion konnten auch peaks von Konservierungsstoffen identifiziert werden. Alle Signale dieser Substanzen sind nach der Einbrennsilikonisierung ebenfalls verschwunden und bestätigen daher deren Entfernung aus der Emulsion. Die Betrachtung physikalischer Daten wie Schmelz- und Siedepunkten z.B. von PHB-Estern und Benzoesäure (alle unter 300° C) sowie die Erwägung ihrer Hydrolyseempfindlichkeit bestätigt die experimentell gewonnenen Daten.
Für alle IR-Untersuchungen wurden dieselben Lösungen verwendet, die zuvor mit Kernresonanzspektroskopie analysiert worden waren. Dazu wurde eine definierte Menge auf einen leeren KBr-Preßling aufgetropft und nach Verdunsten des Lösemittels (CDCl3) das Spektrum aufgezeichnet. Es werden im folgenden die analogen Ergebnisse gezeigt.
Von den reinen Emulgatoren (nur für Dow Corning: Triton-X-100® und Polysorbat-20) wurden Vergleichsspektren aufgezeichnet, um typische Schwingungen aufzufinden. Darin befinden sich zahlreiche Absorptionsbanden, die in Abb. 124 mit den entsprechenden Wellenzahlen gekennzeichnet sind. Einige lassen sich bestimmten Strukturelementen zuordnen.
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Abb. 123 FTIR-Spektren von nichtionischen Emulgaoren
a) Triton-X-100® ; b) Polysorbat-20
Die breite Bande bei ca. 3500 cm-1 wird von den endständigen OH-Gruppen verursacht. Daneben finden sich die CH-Valenzschwingungen, die von den aliphatischen CH-Gruppen der PEG-Anteile und z.B. den Fettsäureketten hervorgerufen werden. Diese haben bei den beiden Emulgatortypen verschiedene Maxima. Die Bande der aromatischen CH-Schwingung beim Alkylphenol (3050 cm-1) tritt nur äußerst schwach auf. Im Spektrum des Polysorbates ist typischerweise eine Esterbande bei 1736 cm-1 zu finden.
Wichtig ist noch die Absorption bei 1351 cm-1, die auf die Methylengruppen der PEG-Ketten zurückgeht. Diese C-H Defomationsschwingung kann auch als Doppelbande wie bei Triton-X-100® auftreten.
Die sehr starke Bande bei 1108 cm-1 stammt von den Ether (C-O-C)-gruppen. Die Bande bei 1610 cm-1 im Spektrum von Triton-X-100® ist eine aromatische C=C -Schwingung.
Die Spektren stimmen in allen Bereichen mit Literaturspektren [ 255 ] überein. Eine detaillierte IR-spektroskopische Charakterisierung nichtionischer Detergentien kann bei Nadeau [ 244 ] nachgelesen werden. Dort sind weitere Schwingungen des Fingerprintbereiches aufgeführt.
Bei Longman und Walz et al. [ 242 , 245 ] wird ebenfalls die Anwendung der IR-Methodik zur Analyse von entsprechenden Emulgatoren diskutiert.
Es wurden die Spektren der eingetrockneten und der hocherhitzten Silikonölemulsion mit Spektren der Emulgatoren verglichen, um herauszufinden, welche Absorptionsbanden zur Auswertung geeignet sind.
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In Abb. 124 ist nur der vergrößerte Spektrenbereich zwischen 4000 und 1300 cm-1 dargestellt. Im übrigen Bereich waren durch die starke Dominanz des Silikonöls keine Überlagerungen festzustellen. Man sieht gleich, daß diese Methodik dem NMR-Verfahren hinsichtlich der Nachweisgrenze stark unterlegen ist, da eine kleine Emulgatormenge neben sehr viel Silikonöl nur schwache Absorptionsbanden ergibt. Abb. 124 FTIR-Spektren von Emulgatoren und thermisch behandelter DC 365 Emulsion
a) TX-100; b) PS-20; c) DC-365 (dehydratisiert); d) DC-365 (hocherhitzt)
Diese werden überhaupt nur dort sichtbar, wo keine Banden des Polydimethylsiloxans liegen. Identifiziert werden können Emulgator-Banden bei 1350, 1512, 1610, 1945, 2800 und 2870 cm-1, die durch entsprechende Pfeile kenntlich gemacht werden. Im Spektrum der hocherhitzten Emulsion sind diese Banden sämtlich nicht mehr zu erkennen.
Am deutlichsten treten insgesamt betrachtet die Methylenschwingung bei 1350 cm-1 und die Bande bei 1512 cm-1 hervor.
Entsprechend schwach fallen auch die Vergleiche mit den extrahierten Silikonölen aus ( Abb. 125 ). Dies wird am Beispiel der Baysilone-Emulsion bzw. dem Extrakt aus 20 ml Vials erläutert.
Während in der bei 105° C eingetrockneten Silikonölemulsion noch schwache Banden der Emulgatoren identifiziert werden konnten, finden sich im Spektrum der erhitzten Modellprobe, der Kontrollprobe und dem extrahierten, eingebrannten Silikonöl keine dieser Banden.
Die Schultern im C-H Valenzbereich (2848 und 2800 cm-1) zu niedrigeren Wellenzahlen hin sind zwar auch im eingebrannten Silikonöl zu bemerken, jedoch finden sich auch schwache Absorptionen im Spektrum der unsilikonisierten Kontrollprobe.
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Einzig bei 1948 cm-1 tritt in allen Silikonöl-haltigen Spektren eine schwache, breite Bande auf, die in der Kontrollprobe nicht enthalten zu sein scheint. Dieser Effekt ist als Interpretationsgrundlage jedoch zu schwach. Schwache OH- Banden finden sich in allen Spektren, diese resultieren jedoch aus den KBr-Preßlingen, die bei den Analysen immer etwas Wasser aufnehmen. Abb. 125 FTIR-Spektren thermisch behandelter Silikonölemulsionen
a) Baysilone-Ölemulsion-H (dehydratisiert); b) Baysilone-Ölemulsion-H (hocherhitzt)
c) Extrakt aus einbrennsilikonisiertem Vial d) Extrakt aus unsilikonisiertem Vial
Die Bande bei 1741 cm-1 stammt aus Verunreinigungen, da sie in Proben- und Kontrollspektren gleichermaßen auftritt.
Die einzige Bande, die einen klaren Hinweis geben könnte, ist die CH-Schwingung bei 1350 cm-1. Diese ist im Spektrum der silikonisierten Probe jedoch nicht zu identifizieren.
Qualitativ das gleiche Ergebnis zeigt auch die Auswertung der Dow Corning Produkte, die daher nicht dargestellt sind. Auch hier fehlen charakteristische Banden, die auf eine Anwesenheit von Emulgatoren hindeuten könnten. Verunreinigungen sind dort geringer ausgeprägt, aber an Hand der Kontrollprobe ebenfalls klar zu identifizieren.
Basierend auf den mit Infrarot-Spektroskopie erhaltenen Ergebnissen bei der Analyse derselben Lösungen, die auch für NMR-Analysen verwendet wurden, gelangt man auch hier zu der Feststellung, daß keine Emulgatorbestandteile in den eingebrannten Silikonölextrakten zu identifizieren sind.
Alle beschriebenen Analysen wurden in einem zweiten Versuchsblock auch mit dem für Emulgatoren besser geeigneten Lösemittel Methanol (PDMS: schwer löslich) durchgeführt. Sowohl bei den Modellversuchen als auch bei der Analyse von Behältnisextrakten und Kontrollproben wurden gleiche Ergebnisse erhalten.
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Da durch Methanol nur wenig Silikonöl gelöst wird, besteht grundsätzlich sogar die Möglichkeit einer selektiven Ablösung von silikonfremden Stoffen, die v.a. bei Verwendung der IR-Spektroskopie nützlich sein könnte, da es dort wesentlich schwieriger ist, kleine Mengen Fremdstoffe neben einem sehr großen Silikonanteil nachzuweisen. Allerdings ist hierbei der Nachteil zu beachten, daß durch die kaum stattfindende Lösung des Silikonöls auch darin eingeschlossene Fremdstoffe wie Emulgatoren durch das Lösemittel vermutlich nicht erreicht werden.In den NMR-Spektren ist das PDMS-Signal bei 0.05 ppm bei den MeOH-Extrakten nur sehr schwach zu sehen, alle Resonanzen der Emulgatoren stellen sich aber genauso dar wie auch bei Verwendung von CDCl3.
In einer spektroskopischen Studie wurde die Frage bearbeitet, inwieweit nach der Einbrennsilikonisierung neben dem Silikonöl noch Hilfsstoffe (im wesentlichen Emulgatoren) aus den eingesetzten Silikonölemulsionen nachweisbar sind.
Dazu wurden die kernmagnetische Resonanzspektroskopie und die FT-IR-Spektroskopie eingesetzt und auf dieselben Prüflösungen angewendet.
Zunächst wurden die enthaltenen Emulgatoren näher charakterisiert. Dazu wurden NMR-Spektren von entwässerten Emulsionen und Spektren von handelsüblichen nichtionischen Detergentien aufgenommen. Durch Vergleich mit ausgewählten Reinsubstanz- und Literaturspektren konnte die chemische Gruppe der betreffenden Substanzen bestimmt werden.
In einer Berechnung wurde eine Nachweisgrenze von 100 µg pro Emulgator als Mindestkriterium festgesetzt. Die in diesen Mengen enthaltenen Substanzen verursachten starke und problemlos nachweisbare peaks im NMR-Spektrum.
Ohne weitere Maßnahmen ruft auch bei stark reduzierten Mengen im NMR auswertbare Signale hervor. Dies ist z.B. bei den hitzebehandelten Proben (Einbrennsimulation) der Fall.
Die Nachweisgrenze kann durch Unterdrückung der starken Lösemittel- und PDMS-Resonanzen weiter abgesenkt werden. Weitere Modellversuche mit stark verdünnten Silikonölemulsionen zeigten, daß mit der Methode insgesamt 1/100 der zunächst berechneten Emulgatormenge entsprechend einer Absolutmasse von 1 µg als limitierende Nachweisgrenze detektiert werden kann.
Bezogen auf eine absolute Masse von ca. 4 mg Silikon/Probe entspricht dieser Wert einer Konzentration von 250 ppm.
Dieselben Modellproben wurden auch IR-spektroskopisch untersucht. Dabei konnte zumindest an Hand der dehydratisierten Emulsionen gezeigt werden, daß die ursprünglich in der Emulsion enthaltenen Mengen von Emulgatoren gerade noch durch schwache spezifische Banden erkannt werden können. Bei der im Ofen erhitzten Emulsion zeigt sich dann die Unterlegenheit der IR-Methode gegenüber der NMR-Spektroskopie, welche problemlos die bereits stark reduzierten Emulgatormengen detektiert. Mit IR lassen sich hier durch die Abwesenheit von Fremdbanden keine Aussagen mehr treffen.
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In dem für die IR-Methode zugänglichen Meßbereich können also nur Beimengungen von Emulgatoren von ca. 2.5% erkannt werden. Das Verfahren ist daher in diesem Fall 100fach unempfindlicher gegenüber der NMR-Spektroskopie.Im Vergleich mit der NMR-Spektroskopie muß festgestellt werden, daß die FTIR Methodik spurenanalytisch wesentlich unempfindlicher ist. Die Modellversuche mit verschieden vorbehandelten Emulsionen zeigen, daß eine genauso starke Differenzierung von Silikon- und Fremdbestandteilen wie mit der NMR Spektroskopie im vorliegenden Fall nicht möglich ist.
Das Ergebnis der Zerstörung der Emulgatoren während der Einbrennsilikonisierung läßt sich auch im Zusammenhang von mit anderen Methoden erhaltenen Befunden diskutieren. Mit TG-MS konnte im Rahmen von Modell-Analysen z.B. die Hydrolyse von PEG-Anteilen aus Emulgatoren schon bei Temperaturen oberhalb von 100° C registriert werden
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