Aus dem
Deutschen Herzzentrum Berlin
und dem
Center for Cardiovascular Research
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Mutationen und Polymorphismen
im β-MHC- und Troponin T-Gen
bei Patienten mit dilatativer
Kardiomyopathie

zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité –
Universitätsmedizin Berlin

von
Steffen Dähmlow
aus Ulm

Gutachter:
1. Prof. Dr. Vera Regitz-Zagrosek
2. Prof. Dr. Monika Stoll
3. PD Dr. Eric Schulze-Bahr

Datum der Promotion: 07.04.2006

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1  Definition der Kardiomyopathien
  • 1.2 Epidemiologie der DCM
  • 1.3 Pathophysiologie der DCM
  • 1.4 Klinik und Diagnostik der DCM
  • 1.5 Therapie der DCM
  • 1.6 Genetik der DCM
    • 1.6.1  Zytoskelett, Intermediärfilament und Kernmembran
    • 1.6.2 Sarkomer
    • 1.6.3 Sarkomer-assoziiertes Protein und Z-Scheibe
    • 1.6.4 Ionenkanäle
    • 1.6.5 Einzelne Gene
  • 1.7 Zielsetzung der Arbeit
• 2 Material und Methoden
  • 2.1  Patientenkollektiv
  • 2.2 Material
    • 2.2.1  Geräte
    • 2.2.2 Chemikalien
  • 2.3 Methoden
    • 2.3.1  Experimentelle Strategie
    • 2.3.2 Isolierung und Aufarbeitung menschlicher DNA
    • 2.3.3 Polymerase-Ketten-Reaktion
    • 2.3.4 Agarosegel-Elektrophorese
    • 2.3.5 Single-Strand-Conformation-Polymorphism-Analyse (SSCP-Analyse)
    • 2.3.6 SYBR^®-Gold-Färbung
    • 2.3.7 DNA-Sequenzierung
    • 2.3.8 Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen-Analyse (RFLP-Analyse)
    • 2.3.9 Heteroduplexanalyse
  • 2.4 Statistik
    • 2.4.1  Berechnung der Allelfrequenzen
    • 2.4.2 Hardy-Weinberg-Gleichgewicht
    • 2.4.3 Chi²-Test und Fisher’s exakter Test
• 3 Ergebnisse
  • 3.1  Klinische Befunde des Patientenkollektivs
  • 3.2 β-MHC
    • 3.2.1  Missense-Mutationen
      • 3.2.1.1  Ala223Thr (g.7799G>A)
      • 3.2.1.2 Ser642Leu (g.12164C>T)
      • 3.2.1.3 STRAP-Analyse der Mutationen Ala223Thr und Ser642Leu
    • 3.2.2 Seltene genetische Varianten mit unklarer funktioneller Relevanz
      • 3.2.2.1  IVS11+23A>T (g.8914A>T)
      • 3.2.2.2 Asp376Asp (g.9666C>T)
    • 3.2.3 Polymorphismen
      • 3.2.3.1  IVS2-25G>T (g.5688G>T)
      • 3.2.3.2 Thr63Thr (g.5909C>T)
      • 3.2.3.3 Phe244Phe (g.7864C>T)
      • 3.2.3.4 Asp325Asp (g.8867C>T)
      • 3.2.3.5 Gly354Gly (g.9600C>T)
      • 3.2.3.6 Lys365Lys (g.9633G>A)
    • 3.2.4 Statistische Auswertung der Polymorphismen im β-MHC-Gen
  • 3.3 Troponin T
    • 3.3.1  Polymorphismen
      • 3.3.1.1  IVS3-11_IVS3-7dupCTTCT (g.6361_6365dupCTTCT)
      • 3.3.1.2 IVS5-50G>A (g.10553G>A)
      • 3.3.1.3 Ser69Ser (g.12739G>A)
      • 3.3.1.4 Ile106Ile (g.13150T>C)
      • 3.3.1.5 IVS11-32C>A (g.15978C>A)
      • 3.3.1.6 IVS14-33C>T (g.18708C>T)
    • 3.3.2 Statistische Auswertung der Polymorphismen im Troponin T-Gen
• 4 Diskussion
  • 4.1  Bewertung des Patientenkollektivs und der Methoden
  • 4.2 Bedeutung von seltenen genetischen Varianten und Polymorphismen
  • 4.3 Genotyp-Phänotyp-Korrelation
  • 4.4 Molekularbiologischer Krankheitsmechanismus
  • 4.5 Phänotyp bei Mutationen in Sarkomerprotein-Genen
  • 4.6 Mögliche funktionelle Effekte der Mutationen Ala223Thr und Ser642Leu
  • 4.7 Bedeutung der molekulargenetischen Diagnostik von DCM
• 5 Zusammenfassung
• Literatur
• Abkürzungen
• Danksagung
• Lebenslauf
• Publikationen
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1-1: Bekannte Gene der dilatativen Kardiomyopathie
• Tabelle 2-1: Primerpaare für die Mutationssuche im β-MHC-Gen
• Tabelle 2-2: Primerpaare für die Mutationssuche im Troponin T-Gen
• Tabelle 2-3: Standard-Protokoll für die PCR-Reaktion
• Tabelle 2-4: Standard-Protokoll für die Sequenzierungsreaktion
• Tabelle 2-5: Restriktionsendonukleasen für die RFLP-Analyse
• Tabelle 3-1: Klinische Daten der 46 Patienten
• Tabelle 3-2: Identifizierte Mutationen und Polymorphismen im β-MHC-Gen
• Tabelle 3-3: β-MHC-Gen: Hardy-Weinberg-Gleichgewicht des DCM-Kollektivs (n = 46)
• Tabelle 3-4: β-MHC-Gen: Vergleich der Allel- und Genotypfrequenzen bei DCM und HCM
• Tabelle 3-5: Identifizierte Polymorphismen im Troponin T-Gen
• Tabelle 3-6: Troponin T-Gen: Hardy-Weinberg-Gleichgewicht des DCM-Kollektivs (n = 46)
• Tabelle 3-7: Troponin T-Gen: Vergleich der Allel- und Genotypfrequenzen bei DCM und HCM
• Tabelle 4-1: Codon usage der stummen Varianten im β-MHC- und Troponin T-Gen
• Tabelle 4-2: Alle bekannten DCM-Mutationen in Sarkomerprotein-Genen

Bilder

• Abbildung 1-1: Schematische Darstellung der involvierten Proteine bei DCM
• Abbildung 1-2: Schematische Darstellung des Sarkomers
• Abbildung 3-1: Lokalisation der Varianten im β-MHC-Gen
• Abbildung 3-2: Variante Ala223Thr (g.7799G>A)
• Abbildung 3-3: Alignment β-MHC Ala223
• Abbildung 3-4: Variante Ser642Leu (g.12164C>T)
• Abbildung 3-5: Alignment Ser642
• Abbildung 3-6: STRAP-Analyse der Mutationen im β-MHC-Gen
• Abbildung 3-7: DNA-Sequenzierung der Variante IVS11+23A>T (g.8914A>T)
• Abbildung 3-8: Variante Asp376Asp (g.9666C>T)
• Abbildung 3-9: Variante IVS2-25G>T (g.5688G>T)
• Abbildung 3-10: DNA-Sequenzierung der Variante IVS2-25G>T (g.5688G>T)
• Abbildung 3-11: Variante Thr63Thr (g.5909C>T)
• Abbildung 3-12: DNA-Sequenzierung der Variante Thr63Thr (g.5909C>T)
• Abbildung 3-13: Variante Phe244Phe (g.7864C>T)
• Abbildung 3-14: DNA-Sequenzierung der Variante Phe244Phe (g.7864C>T)
• Abbildung 3-15: Variante Asp325Asp (g.8867C>T)
• Abbildung 3-16: Variante Gly354Gly (g.9600C>T)
• Abbildung 3-17: RFLP-Analyse der Variante Gly354Gly (g.9600C>T)
• Abbildung 3-18: Variante Lys365Lys (g.9633G>A)
• Abbildung 3-19: Lokalisation der Polymorphismen im Troponin T-Gen
• Abbildung 3-20: Variante IVS3-11_IVS3-7dupCTTCT (g.6361_6365dupCTTCT)
• Abbildung 3-21: DNA-Sequenzierung der Variante IVS3-11_IVS3-7dupCTTCT
• Abbildung 3-22: Variante IVS5-50G>A (g.10553G>A)
• Abbildung 3-23: DNA-Sequenzierung der Variante IVS5-50G>A (g.10553G>A)
• Abbildung 3-24: Variante Ser69Ser (g.12739G>A)
• Abbildung 3-25: Variante Ile106Ile (g.13150T>C)
• Abbildung 3-26: DNA-Sequenzierung der Variante Ile106Ile (g.13150T>C)
• Abbildung 3-27: Variante IVS11-32C>A (g.15978C>A)
• Abbildung 3-28: DNA-Sequenzierung der Variante IVS11-32C>A (g.15978C>A)
• Abbildung 3-29: Variante IVS14-33C>T (g.18708C>T)
• Abbildung 3-30: RFLP-Analyse der Variante IVS14-33C>T (g.18708C>T)