2 Material und Methoden

2.1  Patientenkollektiv

Für diese Studie wurden 46 Patienten ausgewählt, die aufgrund einer dilatativen Kardiomyopathie im Deutschen Herzzentrum Berlin in Behandlung waren. Neben der detaillierten Anamnese und der ausführlichen körperlichen Untersuchung war die Echokardiographie Grundlage für die Diagnose der DCM. Diese umfasste die Standard-Messungen des linksventrikulären enddiastolischen Durchmessers (LVEDD), des linksventrikulären endsystolischen Durchmessers (LVESD) und der linksventrikulären Ejektionsfraktion (LVEF). Die Verkürzungsfraktion (VF) wurde mit der Formel [(LVEDD - LVESD) / LVEDD] x 100 berechnet. Der LVEDD wurde entsprechend Henry et al. in bezug auf Alter und die Körperoberfläche (KO) nach der Gleichung (LVEDD / 45,3 x KO^1/3 - 0,03 x Alter - 7,2) x 100 korrigiert [82].
Für die Aufnahme in die Studie mussten die beiden folgenden diagnostischen Kriterien erfüllt sein:

1. eine linksventrikuläre Ejektionsfraktion unter 45 % und / oder eine Verkürzungsfraktion unter 25 %.
2. ein linksventrikulärer enddiastolischer Durchmesser über 117 % des für das Alter und die Körperoberfläche entsprechenden Normwertes.

Bei allen Patienten wurden andere Ursachen der DCM wie koronare Herzkrankheit, arterielle Hypertonie, Herzklappenerkrankungen und Myokarditis durch Untersuchungen wie Koronarangiographie und in Verdachtsfällen Endomyokardbiopsie ausgeschlossen.
Auch eine hypertrophe Kardiomyopathie wurde bei allen Patienten echokardiographisch ausgeschlossen. Die 46 Patienten waren nicht miteinander verwandt.
Die in die Studie aufgenommenen Patienten wurden vor der Blutentnahme über die geplante molekulargenetische Untersuchung aufgeklärt und gaben ihr schriftliches Einverständnis zur Verwendung ihrer DNA für diese Untersuchung. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Humboldt-Universität zu Berlin geprüft und genehmigt.
Um auszuschließen, dass die gefundenen Mutationen nur Polymorphismen sind, wurde ein Kontrollkollektiv auf das Vorhandensein dieser Mutationen untersucht. Diese Kontrollgruppe bestand aus 88 klinisch gesunden Blutspendern aus der Blutbank des Universitätsklinikums Charité der Humboldt-Universität zu Berlin.

2.2.1  Geräte

2.3.1  Experimentelle Strategie

Die systematische Mutationssuche im β-MHC- und Troponin T-Gen umfasste 46 nicht verwandte Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie. Das Troponin T-Gen wurde im gesamten kodierenden Bereich (Exon 2-16), das β-MHC-Gen ausschließlich im für den Kopfteil des Proteins kodierenden Bereich (Exon 3-23) untersucht.
Die DNA der Patienten wurde aus Leukozyten isoliert, anschließend eine PCR durchgeführt.Die Primer waren so gewählt, dass sowohl die einzelnen Exone als auch die sie umgebenden Intronbereiche amplifiziert werden konnten. So wurden die Spleiß-Konsensus-Sequenzen zusätzlich erfasst. Im Anschluss daran erfolgte eine SSCP-Analyse der einzelnen Fragmente bei Raumtemperatur und 4° C. Nach SYBR^®-Gold-Färbung wurden die Gele auf Laufmusterabweichungen hin untersucht.
Proben mit abweichendem Bandenmuster wurden nach der Methode von Sanger sequenziert. Als zusätzliche Bestätigung der Varianten wurde entweder eine Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen-Analyse, eine Heteroduplexanalyse oder eine erneute Sequenzierung eines unabhängigen PCR-Produkts angewandt.

Die genomische DNA wurde aus Leukozyten von frischem oder eingefrorenem EDTA-Blut isoliert. Die Aufarbeitung der DNA wurde nach folgendem Standardprotokoll, modifiziert nach Miller, durchgeführt [83].

1. 10 ml Blut wurden mit 30 ml Frischlysispuffer (155 mM Natrium-Perchlorat-Monohydrat + 10 mM Kaliumhydrogencarbonat + 0,1 mM EDTA) gemischt, 15 Minuten auf Eis lysiert und 10 Minuten bei 3.000 rpm und 4° C zentrifugiert.
2. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen, das entstandene Leukozytenpellet mit 2 ml Frischlysispuffer gespült und in 8 ml Lösung B (400 mM Tris-HCl + 60 mM EDTA + 150 mM Natriumchlorid + 1 % SDS) vollständig gelöst.
3. 2,7 ml Lösung C (3,6 M Na-Perchlorat) wurden mit dem gelösten Pellet gemischt und nach Zugabe von 8 ml Chloroform 5 Minuten bei 3.000 rpm zentrifugiert.
4. Nach Abnehmen der oberen Phase wurde die gewonnene Lösung zur Präzipitation der DNA mit 1 Volumen gekühltem Isopropanol überschichtet.
5. Im Anschluss wurde der DNA-Faden entnommen, in 70 %igem Ethanol gewaschen und in 400 µl TE-Puffer (10 mM Tris + 1 mM EDTA) gelöst.
6. Die Bestimmung der Konzentration und der Reinheit der isolierten DNA erfolgte durch photometrische Messung bei Wellenlängen von 260 nm und 280 nm.

Durch die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) nach Mullis können Nukleotidsequenzen in vitro exponentiell vervielfältigt werden und so weiteren molekulargenetischen Methoden zugänglich gemacht werden [84]. Bei diesem zyklischen Verfahren lässt sich ein beliebiger DNA-Abschnitt von bis zu 20.000 Basenpaaren amplifizieren, wobei ca. 10⁷ Kopien der DNA-Zielsequenz entstehen [85]. Man benötigt dafür zwei Oligonukleotide (Primer), die die DNA-Fragmente einrahmen und zum gegenüberliegenden Einzelstrang jeweils komplementär sind. Eine thermostabile Taq-DNA-Polymerase vervollständigt die benachbarten Einzelstränge durch Einbau von Nukleotiden (dNTPs).
Aus den veröffentlichten Sequenzen des β-MHC- und Troponin T-Gens wurden die Primer mittels des Programms „Primer“ (Version 5.0) ausgewählt. Zum Zeitpunkt des Primer-Designs lag die genomische DNA über die gesamte Länge des Gens nur für das β-MHC-Gen vor (GenBank Accession Number M57965.1). Für das Troponin T-Gen waren lediglich die Sequenzen der Exone und der angrenzenden Intronbereiche bekannt (GenBank Accession Number AF004409.1 - AF004422.1).
Die Primer wurden so gewählt, dass Spleiß-Stellen mit erfasst waren und PCR-Fragmente von 150 bis 300 bp Länge als optimale Fragmentgröße für die SSCP-Analyse entstehen. Deshalb wurden die Exone 16 und 22 des β-MHC-Gens in zwei überlappenden Fragmenten und die Exone 8 und 9 im β-MHC-Gen und die Exone 3 und 4 im Troponin T-Gen jeweils in einem Fragment amplifiziert. Als weitere Optimalwerte wurden eine geringe Sekundärstrukturbildung und 3’-Selbst-Komplementarität, eine Schmelztemperatur von 57 bis 63° C, eine Primerlänge von 18 bis 23 Nukleotiden und ein GC-Gehalt von 40 bis 60 % angestrebt.
Im Troponin T-Gen wurde nicht mit allen nach der Sequenz von Gerull et al. (GenBank Accession Number AF004409.1 - AF004422.1) synthetisierten Primern ein optimales Amplifikat erzielt. Die Sequenzen für die Primer 10R, 11R, 13R und 14F wurden durch Sequenzierung von drei Fragmenten bestimmt, die durch die Amplifikation mit den Primern 13F und 14R, 11F und 12R und anschließend 10F und 11R gewonnen wurden.

Tabelle 2-1: Primerpaare für die Mutationssuche im β-MHC-Gen

Die Nukleotidposition gibt die Position des Primers auf der von Jaenicke et al. [51] publizierten DNA-Sequenz des β-MHC-Gens an (GenBank Accession Number M57965.1). F = forward, R = reverse.

Tabelle 2-2: Primerpaare für die Mutationssuche im Troponin T-Gen

Die angegebene Nukleotidposition gibt die Position des Primers auf der DNA-Sequenz des Troponin T-Gens nach Gerull et al. an (Exon 2 - 16: GenBank Accession Number AF004409.1 - AF004422.1). Die Primer 10R, 11R, 13R und 14F wurden anhand eigener Sequenzierung bestimmt. F = forward, R = reverse.

Der PCR-Standardansatz mit einem Gesamtvolumen von 25 µl enthielt folgende Reagenzien:

Die PCR-Reaktion erfolgte standardisiert nach dem in Tabelle 2-3 aufgeführten Thermoprofil in einem Thermocycler des Typs GeneAmp 9600 von Perkin Elmer.

Tabelle 2-3: Standard-Protokoll für die PCR-Reaktion

Für ein optimales PCR-Ergebnis wurde die Annealing-Temperatur der einzelnen Primerpaare in einem Gradientencycler systematisch variiert, die optimalen Temperaturen sind in Tabelle 2 1 und Tabelle 2 2. Zur Optimierung des Fragments „Troponin T-Exon 12“ war ein Zusatz von 3 %igem DMSO notwendig. DMSO führt zu einer Unterbrechung der Wasserstoffbrückenbindungen des Doppelstranges, wodurch die anschließende Primerhybridisierung erleichtert wird. Um Kontaminationen auszuschließen, wurde stets eine Negativkontrolle (Aqua ad injectabilia statt DNA) amplifiziert.

Zum Nachweis von Spezifität und Quantität der PCR-Produkte wurden diese auf einem Agarosegel in einer Gibco BRL Horizon 58 Elektrophoresekammer aufgetrennt. Das eingesetzte Gel war 1,14 %ig: 0,4 g Agarose, 35 ml 1-fach TBE (0,1 M Tris Base + 0,1 M Borsäure + 0,002 M Titriplex III), 2 µl Ethidiumbromid (0,7 µg/µl).
4 µl des Amplifikats wurden mit 2 µl Agaroseladepuffer (20 ml 5-fach TBE [0,5 M Tris Base, 0,5 M Borsäure, 0,01 M Titriplex III] + 40 ml Ficoll 400 (20 %) + 10 ml Bromphenolblau (0,1 %) + 30 ml Aqua destillata) versetzt und zusammen mit einem 100 bp DNA-Längenstandard aufgetragen. Die Proben wurden in einem Spannungsfeld von 120 Volt und einer Laufzeit von 20 Minuten elektrophoretisch aufgetrennt. Als Laufpuffer diente 1-fach TBE (0,1 M Tris Base + 0,1 M Borsäure + 0,002 M Titriplex III). Das mit Ethidiumbromid gefärbte Amplifikat wurde durch Fluoreszenz in ultraviolettem Licht sichtbar gemacht und mittels einer Videodokumentationsanlage der Firma Biometra dokumentiert.

Die SSCP-Analyse beruht auf der Beobachtung, dass einzelsträngige DNA-Fragmente eine sequenzspezifische Konformation einnehmen und bei elektrophoretischer Auftrennung in einem nicht-denaturierenden Gel ein spezifisches Laufverhalten aufweisen. Bereits bei einem Austausch von nur einer Base ändert sich die Laufgeschwindigkeit des Einzelstrangs, da die DNA durch ihre veränderte Basensequenz eine andere Sekundärstruktur einnimmt [86,87,88,89].
Der entscheidende Vorteil der SSCP-Analyse gegenüber anderen Mutationsdetektionsverfahren liegt in der schnellen, einfachen und kostengünstigen Durchführung. Einschränkend ist die Länge der Fragmente, jedoch lassen sich bei einer Fragmentlänge von 150 bis 300 bp unter Einsatz geeigneter Elektrophoresebedingungen Detektionsraten von 70 bis 90 % der Mutationen erreichen [90,91]. Jedes PCR-Amplifikat wurde unter zwei verschiedenen Elektrophoresebedingungen aufgetrennt, um eine möglichst hohe Sensitivität zu erreichen. Die Analyse erfolgte sowohl bei Raumtemperatur und einer Spannung von 60 Volt als auch bei 4° C und 70 Volt. Die Laufzeit der Gele betrug jeweils ca. 16 Stunden.

Durchführung der SSCP-Analyse:

1. Die durch PCR gewonnenen DNA-Fragmente wurden auf 10 %igem Polyacrylamidgel aufgetrennt (Acrylamid : Bisacrylamid, 49 : 1). Durch die Zugabe von Tetramethylendiam (TEMED) wurde die Polymerisation der Gele katalysiert und durch Ammoniumpersulfat (APS) gestartet. Die verwendete Polyacrylamid-Lösung für ein Gel wurde wie folgt hergestellt:

2. Für jedes Gel wurden 20 ml Polyacrylamid-Lösung mit 300 µl einer 10 %igen APS-Lösung gemischt und in das Glasplattensystem Multigel-Long der Firma Biometra gegossen. Nach ca. 20 Minuten war die Polymerisation der Gele abgeschlossen.

3. 8 µl des PCR-Produkts wurden mit 12 µl eines Gelladepuffers gemischt. Dieser SSCP-Ladepuffer bestand im Verhältnis 7 : 1 aus Formamid und Agaroseladepuffer (20 ml 5-fach TBE [0,5 M Tris Base, 0,5 M Borsäure, 0,01 M Titriplex III] + 40 ml Ficoll 400 (20 %) + 10 ml Bromphenolblau (0,1 %) + 30 ml Aqua destillata). Die Proben wurden 5 Minuten bei 95° C denaturiert und anschließend auf Eis gelagert, um eine Renaturierung zu verhindern. Jeweils 8 µl wurden auf die Gele aufgetragen.

4. Als Elektrophorese-Laufpuffer diente 0,5-fach TBE (0,05 M Tris Base + 0,05 M Borsäure + 0,001 M Titriplex III).

Zur Visualisierung der aufgetrennten Einzelstränge aus der SSCP-Analyse wurden die Polyacrylamidgele mit SYBR^®-Gold gefärbt. Dieses interkaliert in DNA-Fragmente und hat fluoreszierende Eigenschaften. Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Einzelstränge wurde jedes Gel mit 3 bis 5 ml SYBR^®-Gold-Lösung (5 µl SYBR^®-Gold ad 50 ml Aqua destillata) gleichmäßig benetzt und 10 bis 20 Minuten inkubiert.
Das fluoreszenzgefärbte Gel wurde in einem FluorImager^TM SI System mit ultraviolettem Licht bestrahlt und dadurch zur langwelligen Sekundärstrahlung angeregt. Im FluorImager^TM SI System wurde diese Sekundärstrahlung gefiltert (530 nm), quantitativ erfasst und Punkt für Punkt zu einem Bild umgesetzt.

Auffällige DNA-Proben aus der SSCP-Analyse wurden in einem ABI Prism^TM 310 Kapillarsequenzer nach der enzymatischen Methode von Sanger sequenziert [92].
Bei dieser Methode wird einzelsträngige DNA von einem Startpunkt aus mit Hilfe einer DNA-Polymerase durch einen komplementären Strang zum Doppelstrang ergänzt. Neben den üblicherweise verwendeten Desoxy-Nukleotidtriphosphaten (dNTP) werden auch 2’,3’-Didesoxy-Nukleotidtriphosphate (ddNTP) zugegeben, die zusätzlich am 3’-Ende der Desoxyribose desoxygeniert sind, so dass die Elongation beim Einbau der ddNTP abbricht. Zusätzlich ist jedes ddNTP mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert, der ein spezifisches Emissions- und Absorptionsspektrum besitzt. Bei der Synthese der Doppelstränge entstehen auf diese Weise unterschiedlich lange DNA-Fragmente in einem Größenbereich von einem bis mehreren hundert Nukleotiden.
Nach elektrophoretischer Auftrennung der Fragmente in einer Gelkapillare werden die unterschiedlichen, basenspezifischen Fluoreszenzfarbstoffe mittels Laser zur Sekundärstrahlung angeregt. Anhand des Fluoreszenzmusters wird die Nukleotidsequenz des DNA-Produkts durch das ABI Prism^TM Sequencing System analysiert und in einem Elektropherogramm dargestellt.

Aufreinigung der PCR-Produkte:
Das zu sequenzierende PCR-Produkt wurde zuvor mit dem Invisorb Spin PCRapid Kit von InViTek nach Herstellerangaben aufgereinigt. Mit diesem Kit werden PCR-Amplifikate von Puffer, Salzen, Nukleotiden, Primern und Polymerasen gereinigt.

Durchführung der Sequenzierung:
Die Sequenzierungsreaktion wurde mit einem BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit der Firma Perkin Elmer durchgeführt und enthielt pro Ansatz:

Die Reaktion erfolgte in einem Thermocycler GeneAmp 9600 der Firma Perkin Elmer nach folgendem Thermoprofil.

Tabelle 2-4: Standard-Protokoll für die Sequenzierungsreaktion

Anschließend wurde das Produkt in einer Sephadex^TM G-50 Säule gereinigt, um überschüssige ddNTPs zu entfernen, da diese durch ihre Fluoreszenzmarkierung zu einer Verfälschung des Signalbildes führen würden. In einem ABI Prism^TM 310 Kapillarsequenzer wurden die entstandenen Fragmente elektrophoretisch aufgetrennt, und anhand des unterschiedlichen Fluoreszenzmusters konnte nun die genaue Sequenz des DNA-Abschnitts ermittelt werden.

Nach der Identifikation einer Variante in SSCP-Analyse und Sequenzierung lässt sich diese sicher und schnell durch eine RFLP-Analyse unabhängig bestätigen [93].
Grundlage dieser Methode ist die Tatsache, dass durch eine Variante eine Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuklease neu entsteht oder zerstört wird. Restriktionsendonukleasen schneiden doppelsträngige DNA an einer bestimmten Stelle innerhalb einer spezifischen Erkennungssequenz oder in einem bestimmten Abstand zu ihr. Je nach Vorhandensein der Variante ändert sich das Schnittmuster, was zu Restriktionsfragmenten unterschiedlicher Länge führt. Die Auswahl möglicher Restriktionsenzyme erfolgte mit Hilfe der Datenbank Webcutter 2.0 [94].

Ansatz für den Restriktionsverdau:

Je nach Herstellerangaben wurden zusätzlich S-adenosylmethionin oder bovines Serumalbumin (BSA) in der entsprechenden Menge dazu gegeben. Der Reaktionsansatz wurde gemischt und bei optimaler Temperatur ca. 16 Stunden im Wasserbad inkubiert (Tab. 2-5). Die verschiedenen Restriktionsfragmente wurden über 2 Stunden bei 120 Volt auf einem 10 %igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und durch SYBR^®-Gold-Färbung sichtbar gemacht. Anhand des Bandenmusters konnte der Genotyp jeder Probe bestimmt werden.

Tabelle 2-5: Restriktionsendonukleasen für die RFLP-Analyse

Durch die Heteroduplexanalyse können kleinere Deletionen, Insertionen und Einzelbasenaustausche identifiziert werden [95,96]. Dabei wird ein DNA-Doppelstrang durch Erhitzung in seine Einzelstränge aufgetrennt. Durch langsamen Temperaturabfall bis auf Raumtemperatur renaturieren die Einzelstränge wieder zu Doppelsträngen, hierbei entstehen bei heterozygoten Varianten Heteroduplexe, d.h. das mutierte Allel hybridisiert mit dem Wildtyp-Allel. Der neu entstandene Doppelstrang ist nicht mehr komplementär. Bei elektrophoretischer Auftrennung zeigen die Heteroduplexe aufgrund einer veränderten Sekundärstruktur ein anderes Laufverhalten.

Durchführung der Heteroduplexanalyse:
4 µl des PCR-Produkts wurden 5 Minuten bei 95° C denaturiert und anschließend langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Jede Probe wurde mit 5 µl Agaroseladepuffer (20 ml 5-fach TBE [0,5 M Tris Base, 0,5 M Borsäure, 0,01 M Titriplex III] + 40 ml Ficoll 400 (20 %) + 10 ml Bromphenolblau (0,1 %) + 30 ml Aqua destillata) gemischt und auf ein 10 %iges Polyacrylamidgel aufgetragen. Nach der Auftrennung bei 120 Volt über 3 bis 4 Stunden wurden die Gele mit SYBR^®-Gold gefärbt.

2.4.1  Berechnung der Allelfrequenzen

Als Allelfrequenz wird die Häufigkeit bezeichnet, mit der ein Allel (A oder B) an einem Genlocus innerhalb eines Kollektivs auftritt. Bei den in dieser Dissertation vorkommenden Polymorphismen wurde jeweils aus der beobachteten Häufigkeit der Genotypen (AA, AB, BB) der prozentuale Anteil der beiden Allele bestimmt.

In den Jahren 1908 und 1909 formulierten der englische Mathematiker Godfrey Harold Hardy und der deutsche Arzt Wilhelm Weinberg unabhängig voneinander ein Gesetz, das die Verteilung von Erbmerkmalen in Populationen beschreibt. In einer idealen Population bleiben die Allelfrequenz und die Allelverteilung, also die Häufigkeit von Homozygoten und Heterozygoten, über Generationen hinweg konstant, wenn sich die Population im Gleichgewicht befindet. Voraussetzungen dafür sind Panmixie, keine Selektion, keine Genwanderungen und dass die Population sehr groß ist.

Mit Hilfe des Hardy-Weinberg-Gesetzes kann die erwartete Häufigkeit der Allele berechnet werden. Bezeichnet man die Häufigkeit des Allels A mit p und die Häufigkeit des Allels B mit q, so gilt: p + q = 1 (100 %).
In der nachfolgenden Generation erscheinen dann die Genotypen (AA, AB, BB) mit definierten Häufigkeiten:

Gegenstand des Chi²-Test ist die Analyse von Häufigkeitsunterschieden von Merkmalen. Für den Vergleich der beobachteten mit der erwarteten Häufigkeit der Genotypen der jeweiligen Polymorphismen wurde der Chi²-Anpassungstest angewandt. Als Nullhypothese wurde die Gleichverteilung der Genotypen in Stichprobe und Grundgesamtheit formuliert. Bei einem p-Wert <0,05 muss die Nullhypothese verworfen werden.
Um die Allel- und Genotypfrequenzen der Polymorphismen des DCM-Kollektiv mit den entsprechenden Frequenzen eines HCM-Kollektivs zu vergleichen, wurde der Chi²-Unabhängigkeitstest benutzt. Bei einigen Allel- und Genotypfrequenzen wurde der exakte Test nach Fisher angewendet. Werte von p <0,05 als signifikant angesehen.
Die statistische Berechnung wurde unter Verwendung des Programms SPSS 11.0 durchgeführt.