3 Ergebnisse

3.1  Klinische Befunde des Patientenkollektivs

Das Patientenkollektiv bestand aus 46 DCM-Patienten, 38 männlichen und 8 weiblichen Personen im Alter von 12 bis 45 Jahren. Das Durchschnittsalter betrug 34,5 ± 7,6 Jahre, das Alter zum Zeitpunkt der Diagnose lag bei 29,5 ± 7,9 Jahren. Die klinischen Daten dieser Patienten sind in Tabelle 3-1 zusammengefasst.

Tabelle 3-1: Klinische Daten der 46 Patienten

Die Daten sind als Mittelwerte und Standardabweichung oder als relative (%) und absolute Werte (n) angegeben. Abkürzungen: NYHA = New York Heart Association, ICD = implantierbarer Cardioverter-Defibrillator, LVEDD = linksventrikulärer enddiastolischer Durchmesser, LVESD = linksventrikulärer endsystolischer Durchmesser, LVEF = linksventrikuläre Ejektionsfraktion, VF = Verkürzungsfraktion, PAPm = mittlerer Pulmonalarteriendruck.

Bei allen Patienten wurde die Krankheit echokardiographisch diagnostiziert. Der LVEDD war größer als 117 % des für das Alter und für die Körperoberfläche entsprechenden Normwertes und bei allen Patienten waren die LVEF kleiner als 45 % und / oder die VF kleiner als 25 %. Auch eine hypertrophe Kardiomyopathie wurde bei allen Patienten echokardiographisch ausgeschlossen.
Zum Zeitpunkt der Studie waren bereits sieben Patienten verstorben, sechs Patienten hatten bereits ein Herztransplantat erhalten, 13 sind Träger eines implantierbaren Cardioverter-Defibrillators (ICD).

Bei 46 nicht verwandten Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie wurde eine systematische Mutationssuche im β-MHC-Gen durchgeführt. Es wurden die Exone 3 bis 23 untersucht sowie die Exon-flankierenden Intronbereiche. Insgesamt konnten zehn Varianten festgestellt werden (Tab. 3-2). Die Bezeichnung der Varianten entspricht den Empfehlungen von Dunnen et al. und der Human Genome Variation Society [97,98]. Als Referenz-Sequenz wurde eine genomische DNA-Sequenz verwendet (GenBank Accession Number M57965.1). Den Nukleotidpositionen ist daher ein „g.“ vorangestellt.
Es wurden zwei potentiell krankheitsrelevante Mutationen ermittelt, die jeweils eine Aminosäuresubstitution zur Folge haben. In Exon 8 führt eine Nukleotidsubstitution von Guanin zu Adenin an Nukleotidposition g.7799 zu einem Austausch der Aminosäure Alanin zu Threonin in Kodon 223 (Ala223Thr). Eine Transition von Cytosin zu Thymin in Exon 17 (g.12164) hat den Austausch von Serin gegen Leucin im Kodon 642 zur Folge (Ser642Leu). Beide Mutationen konnten in einer Kontrollgruppe aus 88 gesunden Blutspendern nicht gefunden werden.

Tabelle 3-2: Identifizierte Mutationen und Polymorphismen im β-MHC-Gen

Kodon- und Nukleotidposition sind nach Jaenicke et al. (GenBank Accession Number M57965.1) angegeben. g. = genomische DNA.

Des Weiteren fanden sich eine Mutation in Intron 11 und eine synonyme Mutation in Exon 12. In Intron 11 liegt die Mutation IVS11+23A>T (g.8914A>T) außerhalb von Spleiß-Konsensussequenzen, ein Einfluss auf das Spleißen der mRNA ist daher unwahrscheinlich. Die Mutation Asp376Asp (g.9666C>T) in Exon 12 ist synonym, GAC wird gegen GAT ausgetauscht, so dass die Aminosäure Aspartat erhalten bleibt.
Neben den beschriebenen seltenen Varianten wurden sechs Polymorphismen identifiziert. Alle werden durch den Austausch eines einzelnen Nukleotids verursacht: in Intron 2 IVS2-25G>T (g.5688G>T), in Exon 3 Thr63Thr (g.5909G>T), in Exon 8 Phe244Phe (g.7864C>T), in Exon 11 Asp325Asp (g.8867C>T) und in Exon 12 Gly354Gly (g.9600C>T) und Lys365Lys (g.9633G>A). Bei keinem der Polymorphismen kommt es zu einer Änderung der Aminosäuresequenz.
Bei allen sechs Polymorphismen wurden die Genotypen der 46 DCM-Patienten bestimmt. Dadurch konnten jeweils die Allelfrequenz und die nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz erwarteten Genotyp-Häufigkeiten berechnet werden. Schließlich wurde mittels des Chi²-Tests das Abweichen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht überprüft. Als Kontrollkollektiv wurden bereits genotypisierte HCM-Patienten aus der DNA-Datenbank des Deutschen Herzzentrums Berlin herangezogen.
Die Lokalisation der identifizierten genetischen Varianten ist in der Intron-Exon-Struktur des β-MHC-Gens dargestellt (Abb. 3-1).

	Abbildung 3-1: Lokalisation der Varianten im β-MHC-Gen
	Schematische Darstellung des β-MHC-Gens. Die senkrechten Balken repräsentieren die Exone, die Zwischenräume die Introne. Die in dieser Arbeit identifizierten Varianten sind rot (Missense-Mutationen), grün (seltene genetische Varianten) und blau (Polymorphismen) eingezeichnet. ATG und TAG sind Start- und Stoppkodons der Translation. Die Hauptstrukturkomponenten des Myosins sind Subfragment S1 (Kopf) und Subfragment S2 + Light Meromyosin LMM (Schwanz). Funktionell relevante Regionen sind ATP: ATP-Bindung, Aktin: Aktin-Interaktion und MLC: Bindung von leichten Ketten.

3.2.1  Missense-Mutationen

3.2.1.1  Ala223Thr (g.7799G>A)

In Exon 8 des β-MHC-Gens konnte in der SSCP-Analyse bei Raumtemperatur eine Laufmusterabweichung bei Indexpatient 1745 identifiziert werden (Abb. 3-2A). Durch die DNA-Sequenzierung des aberranten PCR-Fragments wurde eine G>A Substitution an Nukleotidposition g.7799 ermittelt (Abb. 3-2B). Aufgrund dieser Transition kommt es in Kodon 223 zum Austausch der unpolaren Aminosäure Alanin (GCC) gegen die polare Aminosäure Threonin (ACC).

	Abbildung 3-2: Variante Ala223Thr (g.7799G>A)
	A) SSCP-Analyse von Exon 8 bei Raumtemperatur. Die mittlere Spur zeigt das aberrante Laufmuster des DNA-Fragments des Mutationsträgers. B) Die DNA-Sequenzierung dieses Fragments ergab eine Nukleotidsubstitution von Guanin zu Adenin an Position g.7799 (Pfeil).

Da die Nukleotidposition g.7799 nicht in der Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms liegt, konnte keine RFLP-Analyse etabliert werden. Zur Bestätigung der Mutation wurden deshalb mehrere unabhängige PCR-Amplifikate sequenziert. Darüber hinaus wurden 88 Kontrollproben gesunder Blutspender und 136 Proben von HCM-Patienten mittels SSCP-Analyse auf diese Variante untersucht, in keiner der Proben war die Mutation in Exon 8 vorhanden.
Die Aminosäure Alanin an Position 223 ist evolutionär konserviert, man findet sie bei Mensch, Schwein, Ratte, Huhn und Kammmuschel. Drosophila melanogaster hat an dieser Position bereits die Aminosäure Threonin (Abb. 3-3).

	Abbildung 3-3: Alignment β-MHC Ala223
	Homologievergleich der Proteinsequenz verschiedener Spezies im Bereich der Mutation Ala223Thr. Identische Aminosäuren sind als Punkte angegeben. Der Kasten markiert die Position 223 der Proteinsequenz von β-MHC. Alanin ist an dieser Position evolutionär konserviert, lediglich Drosophila melanogaster weist dort die Aminosäure Threonin auf. GenBank Accession Number in Klammern.

Der klinische Befund des Patienten ist typisch für das Bild einer dilatativen Kardiomyopathie. Echokardiographisch stellte sich ein LVEDD von 82 mm, ein LVESD von 70 mm, eine LVEF von 10 % und eine VF von 15 % dar. In der Herzkatheteruntersuchung wurde ein mittlerer Pulmonalarteriendruck von 33 mmHg gemessen. Die medikamentöse Therapie umfasste ACE-Hemmer, Diuretikum, Aldosteron-Antagonist, Digitalis und β-Blocker, er ist Träger eines implantierbaren Cardioverter-Defibrillators. Unter den therapeutischen Maßnahmen hat der Patient einen Sinusrhythmus, das Stadium der Herzinsuffizienz entspricht NYHA II. Da der Patient aus Bosnien stammt und sich nur vorübergehend in Deutschland aufhielt, konnte nicht geklärt werden, ob weitere Familienmitglieder an einer dilatativen Kardiomyopathie erkrankt sind.

Mittels SSCP-Analyse von Exon 17 bei Raumtemperatur wurde bei Indexpatient 474 eine Laufmusterabweichung festgestellt (Abb. 3-4A). Die Sequenzierung des abweichenden PCR-Fragments ergab eine C>T Transition an Nukleotidposition g.12164 (Abb. 3-4B). Diese Substitution führt zu einem Austausch der polaren Aminosäure Serin (TCG) zu der unpolaren Aminosäure Leucin (TTG) in Kodon 642. Die Mutation wurde durch mehrmaliges Sequenzieren neuer unabhängiger PCR-Fragmente bestätigt, da die Variante nicht im Bereich einer Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms liegt. Zur weiteren Bestätigung wurden 88 Kontrollproben gesunder Blutspender mittels SSCP-Analyse untersucht, bei keinem der Blutspender wurde die Mutation gefunden. Auch bei 136 HCM-Patienten aus dem Patientenkollektiv des Deutschen Herzzentrums Berlin war die Mutation nicht vorhanden.

	Abbildung 3-4: Variante Ser642Leu (g.12164C>T)
	A) SSCP-Analyse von Exon 17 bei Raumtemperatur. Die erste Spur zeigt das abweichende Laufmuster. B) DNA-Sequenzierung diese Fragments mit einem Austausch von Cytosin (blau) zu Thymin (rot).

Die Aminosäure Serin an Position 642 ist in verschiedenen Spezies konserviert, bei Drosophila melanogaster befindet sich Glycin an dieser Position (Abb. 3-5).

	Abbildung 3-5: Alignment Ser642
	Homologievergleich der Proteinsequenz verschiedener Spezies im Bereich der Mutation Ser642Leu. Identische Aminosäuren sind als Punkte angegeben. Der Kasten markiert die Position 642 der Proteinsequenz von β-MHC. Serin ist an dieser Position evolutionär konserviert. In Klammern ist die jeweilige GenBank Accession Number angegeben.

Phänotypisch zeigt der Patient das typische Bild der DCM. Im Echokardiogramm wurden folgende Werte gemessen: LVEDD 70 mm, LVESD 55 mm, LVEF 10 % und VF 14 %. In der Herzkatheteruntersuchung wurde ein mittlerer Pulmonalarteriendruck von 33 mmHg ermittelt. Unter der Therapie von ACE-Hemmer, Diuretikum, Aldosteron-Antagonist, Digitalis, β-Blocker, Antiarrhythmikum und ICD weist der Patient einen Sinusrhythmus auf. Die Herzinsuffizienz entspricht nach NYHA dem Stadium II. Auch bei diesem Patienten konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden, ob weitere Familienmitglieder an einer DCM leiden.

Die beiden Missense-Mutationen Ala223Thr und Ser642Leu wurden von der Arbeitsgruppe Frömmel an der Charité mit dem STRAP-Programm (Editor for Structural Alignment of Proteins) auf die Proteinstruktur des Myosins projiziert (Abb. 3-6). Da die Struktur des kardialen Proteins nicht zur Verfügung stand, wurden die Mutationen auf das Myosin der quergestreiften Muskulatur projiziert. Dadurch konnten die in dieser Arbeit gefundenen neben bereits bekannten Mutationen in der dreidimensionalen Struktur des Proteins dargestellt werden.
Die Mutation Ala223Thr liegt in der Nähe der ATP-Bindungsstelle, in der oberen 50 kDa Domäne des β-MHC. Die Projektion der Mutation Ser642Leu auf die Proteinstruktur zeigt, dass diese in einer Schleife des Myosins liegt, die direkt mit Aktin interagiert und so die Aktin-Myosin-Interaktion beeinflussen könnte.

	Abbildung 3-6: STRAP-Analyse der Mutationen im β-MHC-Gen
	Mutationen im β-MHC-Gen sind auf die Proteinstruktur des Myosins projiziert, dabei sind HCM-assoziierte Mutationen grau dargestellt und DCM-assoziierte Mutationen gelb. Dies sind die beiden in dieser Arbeit identifizierten Mutationen Ala223Thr und Ser642Leu, und die bereits bekannten Ser532Pro und Phe764Leu. Ser532Pro und Ser642Leu befinden sich in der Aktin-Bindungsregion.

3.2.2.1  IVS11+23A>T (g.8914A>T)

In der SSCP-Analyse von Exon 11 wurde zunächst ein Polymorphismus in Kodon 325 beobachtet (siehe 3.2.3.4). Die DNA-Sequenzierung der vier aberranten Laufmuster-Proben ergab bei Indexpatient 466 jedoch zusätzlich eine Nukleotidsubstitution Adenin zu Thymin an Position g.8914 (Abb. 3-7). Die Variante liegt in Intron 11 außerhalb von Spleiß-Konsensussequenzen, ein Einfluss auf das Spleißen der mRNA ist daher unwahrscheinlich. Es kommt also nicht zu einer Änderung der Aminosäuresequenz.
Der Nukleotidaustausch zerstört eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym PfIM I. Der Restriktionsverdau konnte jedoch nicht optimiert werden, so dass die Mutation durch erneute Sequenzierung eines unabhängigen PCR-Produkts bestätigt wurde.

	Abbildung 3-7: DNA-Sequenzierung der Variante IVS11+23A>T (g.8914A>T)
	Der Pfeil markiert die Position +23 im Intron 11. Hier kommt es zu einem Austausch von Adenin (grün) zu Thymin (rot).

In Exon 12 war eine Variante bei Indexpatient 474 erkennbar. Dieser Patient trägt außerdem die bereits beschriebene Mutation Ala223Thr in Exon 8 (siehe 3.2.1.1). Die Laufmusterabweichung war weder bei Raumtemperatur noch bei 4° C eindeutig sichtbar (Abb. 3-8A). Durch die mehrfach unabhängige DNA-Sequenzierung des auffälligen PCR-Fragments konnte die Mutation in Exon 12 jedoch bestätigt werden (Abb. 3-8B). Eine RFLP-Analyse schied hier aus, da kein passendes Restriktionsenzym vorhanden war. An Nukleotidposition g.9666 kommt es zu einem Basenaustausch C>T. Die Aminosäure Aspartat an Kodon-Position 376 bleibt erhalten (GAC>GAT).

	Abbildung 3-8: Variante Asp376Asp (g.9666C>T)
	A) SSCP-Analyse bei 4° C. Ein abweichendes Muster ist in der ersten Spur im Vergleich zu den benachbarten Spuren nur angedeutet. B) Die DNA-Sequenzierung dieses Fragments identifizierte die Variante Asp376Asp mit einem Austausch von GAC zu GAT.

3.2.3.1  IVS2-25G>T (g.5688G>T)

Bei der SSCP-Analyse von Exon 3 war erkennbar, dass es sich in diesem Fragment um zwei unabhängige Polymorphismen handelt. Es konnten die in Abbildung 3-9A dargestellten Bandenmuster beobachtet werden. Die DNA-Sequenzierung der ausgewählten PCR-Fragmente zeigte einen Polymorphismus an Nukleotidposition g.5688, hier kommt es zu einer G>T Transversion (Abb. 3-10). Dies führt nicht zu einem Aminosäureaustausch, weil die Substitution in Intron 2 an Stelle -25 liegt.

	Abbildung 3-9: Variante IVS2-25G>T (g.5688G>T)
	A) SSCP-Analyse bei Raumtemperatur. Dargestellt sind die verschiedenen Bandenmuster der drei Genotypen. B) Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte von Exon 3 nach enzymatischer Spaltung mit Bsg I. Je nach Genotyp entstehen Fragmente mit einer Länge von 313 bp, 258 bp und 55 bp (Pfeile), M = 100 bp-DNA-Ladder. C) Restriktionsfragment-Längen der drei Genotypen.

	Abbildung 3-10: DNA-Sequenzierung der Variante IVS2-25G>T (g.5688G>T)
	Im Patientenkollektiv waren alle drei Genotypen vorhanden: A) Wildtyp homozygot (GG), B) heterozygot (GT), C) Mutante homozygot (TT).

Durch den Nukleotidaustausch entsteht eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym Bsg I (gtgcag(n)₁₆). Die Amplifikation mit den Primern β-MHC-Exon 3F/R ergibt ein Fragment von 313 Basenpaaren. Beim Restriktionsverdau des homozygoten Wildtyps (GG) behält das Fragment seine volle Länge, die Mutante (TT) wird in zwei Teilstücke von 258 bp und 55 bp geschnitten, der heterozygote Genotyp weist nach enzymatischer Spaltung alle drei Fragmentlängen auf. Anhand der gelelektrophoretischen Auftrennung der Restriktionsfragmente (Abb. 3-9B) wurde der jeweilige Genotyp von allen 46 DCM-Patienten bestimmt.

In der SSCP-Analyse von Exon 3 war neben der Variante IVS2-25G>T noch ein weiterer Polymorphismus sichtbar (Abb. 3-11A). Die DNA-Sequenzierung ergab die Transition C>T an Nukleotidposition g.5909. Dieser Basenaustausch in Kodon 63 führt nicht zu einer Änderung der Aminosäuresequenz, da sowohl das Kodon ACC als auch das Triplett ACT für die Aminosäure Threonin kodieren (Abb. 3-12).
Die Nukleotidsubstitution Thr63Thr (g.5909C>T) liefert eine Schnittstelle für das Enzym Dde I (c/tnag). Die DNA-Proben aller 46 Patienten wurden mit den Primern β-MHC-Exon 3F/R amplifiziert und mit Dde I verdaut, um so die Genotypen bestimmen zu können. Das Enzym schneidet das Amplifikat in zwei Teile von 255 bp und 58 bp. Damit sind Wildtyp, Mutante und heterozygoter Genotyp in der gelelektrophoretischen Auftrennung der Restriktionsfragmente eindeutig differenzierbar (Abb. 3-11B).

	Abbildung 3-11: Variante Thr63Thr (g.5909C>T)
	A) SSCP-Analyse bei Raumtemperatur. Die verschiedenen Bandenmuster der drei Genotypen sind deutlich erkennbar. B) Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte von Exon 3 nach enzymatischer Spaltung mit Dde I, M = 100 bp-DNA-Ladder. C) Restriktionsfragment-Längen der drei Genotypen.

	Abbildung 3-12: DNA-Sequenzierung der Variante Thr63Thr (g.5909C>T)
	Die DNA-Sequenzierung von drei Proben mit unterschiedlichem Laufmuster in der SSCP-Analyse lieferte die Sequenz der drei Genotypen: A) Wildtyp homozygot (CC), B) heterozygot (CT), C) Mutante homozygot (TT).

Anhand der SSCP-Analyse von Exon 8 konnte das in Abbildung 3-13 dargestellte auffällige Bandenmuster bei mehreren Patienten identifiziert werden. Die DNA-Sequenzierung ergab eine Nukleotidsubstitution C>T an Position g.7864. In Kodon 244 wird TTC gegen TTT ausgetauscht, dies führt nicht zu einem Austausch der Aminosäure Phenylalanin (Abb. 3-14).
Da der Austausch weder zu einer Neubildung noch zu einer Zerstörung von Restriktionsstellen führt, wurde der Polymorphismus durch wiederholte Sequenzierung von unabhängigen PCR-Produkten bestätigt.

	Abbildung 3-13: Variante Phe244Phe (g.7864C>T)
	SSCP-Analyse bei 4° C. Die rechte Spur zeigt im Vergleich zu den benachbarten Spuren eine zusätzliche Bande (Pfeil).

	Abbildung 3-14: DNA-Sequenzierung der Variante Phe244Phe (g.7864C>T)
	An Nukleotidposition g.7864 wurde ein Polymorphismus C>T identifiziert: A) Wildtyp homozygot (CC), B) heterozygot (CT), C) Mutante homozygot (TT).

Die Genotypisierung erfolgte anhand des SSCP-Gels bei Raumtemperatur. Auffällig ist, dass nur ein Patient homozygot für das T-Allel ist, wobei dieser gleichzeitig Träger der Mutation Ala223Thr in Exon 8 ist (siehe 3.2.1.1).

Nach der SSCP-Analyse von Exon 11 wurde bei vier Patienten ein auffälliges Laufmuster beobachtet (Abb. 3-15A). Die DNA-Sequenzierung (Abb. 3-15B/C) zeigte eine Nukleotidsubstitution C>T an Position g.8867. Die Aminosäure Aspartat an Kodon-Position 325 bleibt erhalten (GAC>GAT).

	Abbildung 3-15: Variante Asp325Asp (g.8867C>T)
	A) SSCP-Analyse bei Raumtemperatur. In der zweiten Spur ist ein aberrantes Bandenmuster erkennbar, lediglich vier Patienten des Kollektivs zeigten dieses Muster. B) DNA-Sequenzierung, Wildtyp homozygot (CC), C) heterozygot (CT).

Die SSCP-Analyse von Exon 12 zeigte zwei unabhängige polymorphe Laufmusterabweichungen bei zahlreichen Proben. Das Bandenmuster des einen Polymorphismus ist in Abbildung 3-16A dargestellt. Durch die DNA-Sequenzierung (Abb. 3-16B/C) konnte die Transition C>T an Nukleotidposition g.9600 identifiziert werden, wodurch an Kodon-Position 354 das Triplett GGC durch GGT ersetzt wird. Beide Tripletts kodieren für die Aminosäure Glycin.

	Abbildung 3-16: Variante Gly354Gly (g.9600C>T)
	A) SSCP-Analyse bei 4° C. Die erste Spur zeigt einen heterozygoten Genotyp. B) DNA-Sequenzierung, Wildtyp homozygot (CC), C) heterozygot (CT).

Durch den enzymatischen Verdau mit der Restriktionsendonuklease Hin6 I (g/cgc) wurde der Polymorphismus Gly354Gly (g.9600C>T) bestätigt, da die Nukleotidsubstitution eine Erkennungssequenz des Enzyms zerstört. In der gelelektrophoretischen Auftrennung konnte der Genotyp nach folgendem Schema bestimmt werden: CC 114 bp/112 bp; TT 226 bp; CT 226 bp/114 bp/112 bp (Abb. 3-17).

	Abbildung 3-17: RFLP-Analyse der Variante Gly354Gly (g.9600C>T)
	A) Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte von Exon 12 nach enzymatischer Spaltung mit Hin6 I. Im Patientenkollektiv waren nur der homozygote Wildtyp und der heterozygote Genotyp vertreten, M = 100 bp-DNA-Ladder. B) Restriktionsfragment-Längen der Genotypen.

Der zweite Polymorphismus in Exon 12 zeigte in der SSCP-Analyse bei 4° C das in Abbildung 3-18A dargestellte Bandenmuster. Die DNA-Sequenzierung ergab die Transition G>A an Nukleotidposition g.9633 (Abb. 3-18B/C). Hier ändert sich das Triplett von AAG zu AAA, die Aminosäure Lysin an Kodon-Position 365 bleibt erhalten.

	Abbildung 3-18: Variante Lys365Lys (g.9633G>A)
	A) SSCP-Analyse bei 4° C. In der ersten Spur ist eine zusätzliche Bande sichtbar. B) Die DNA-Sequenzierung zeigt den homozygoten Wildtyp (GG) und C) den heterozygoten Genotyp (AG).

Die G>A Transition der Variante Lys365Lys zerstört eine Schnittstelle des Enzyms Alu I (ag/ct). Da die Erkennungssequenz dieses Enzyms unspezifisch ist, hat das PCR-Fragment des Wildtyps drei Schnittstellen, was nach enzymatischer Spaltung zu vier Banden in der gelelektrophoretischen Auftrennung führt. Der heterozygote Genotyp ist mit seinen fünf Banden nicht sicher vom Wildtyp zu unterscheiden, so dass auf die RFLP-Analyse verzichtet wurde. Die Bestätigung der Variante erfolgte durch wiederholte Sequenzierung unabhängiger PCR-Produkte. Die 46 DCM-Patienten wurden anhand des SSCP-Gels bei 4° C genotypisiert.

Die sechs identifizierten Polymorphismen im β-MHC-Gen wurden mit Hilfe des Chi²-Tests statistisch analysiert, um ein Abweichen der Genotypen des Kollektivs vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht zu überprüfen (Tab. 3-3).

Tabelle 3-3: β-MHC-Gen: Hardy-Weinberg-Gleichgewicht des DCM-Kollektivs (n = 46)

Gegenüberstellung der beobachteten und nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz erwarteten Genotyp-Häufigkeiten. Der Chi²-Test zeigt bei allen sechs Varianten keinen signifikanten Unterschied.

Bei allen Polymorphismen weisen beobachtete und nach dem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht erwartete Häufigkeit der Genotypen keinen signifikanten Unterschied auf. Die p-Werte sind jeweils >0,05.
Um zu überprüfen, ob ein Allel oder Genotyp bei DCM oder HCM bevorzugt auftritt, wurden die jeweiligen Allel- und Genotypfrequenzen mit denen eines HCM-Kollektivs bereits genotypisierter Patienten aus dem Deutschen Herzzentrum Berlin verglichen. Die Analyse mit Hilfe des Chi²-Unabhängigkeitstests bzw. des exakten Tests nach Fisher ergab auf dem Niveau von p = 0,05 keinen signifikanten Unterschied in der Allel- und Genotypfrequenz des jeweiligen Polymorphismus (Tab. 3-4).

Tabelle 3-4: β-MHC-Gen: Vergleich der Allel- und Genotypfrequenzen bei DCM und HCM

Bei fünf Polymorphismen wurden die Allel- und Genotypfrequenzen des DCM-Kollektivs mit den entsprechenden Frequenzen eines HCM-Kollektivs verglichen. Die statistische Analyse zeigt jeweils keinen signifikanten Unterschied. Für den Polymorphismus IVS2-25G>T waren keine genotypisierten HCM-Patienten verfügbar. * Fisher’s exakter Test

Im Troponin T-Gen wurde bei den gleichen 46 DCM-Patienten, die auch im β-MHC-Gen untersucht wurden, ein systematisches Mutationsscreening der Exone 2 bis 16 mit den Exon-flankierenden Intronbereichen durchgeführt. Es wurden keine Mutationen identifiziert, jedoch zeigte die Analyse sechs Polymorphismen (Tab. 3-5).

Tabelle 3-5: Identifizierte Polymorphismen im Troponin T-Gen

Kodon- und Nukleotidposition sind nach der GenBank Accession Number AY044273.1 angegeben.
g. = genomische DNA.

Die Bezeichnung der Varianten wurde anhand der GenBank Accession Number AY044273.1 durchgeführt. Sie enthält die genomische Sequenz des gesamten Gens. Den Nukleotidpositionen ist daher ein „g.“ vorangestellt.Die Bezeichnung der Varianten entspricht den Empfehlungen von Dunnen et al. und der Human Genome Variation Society [97,98].
In Intron 3 war eine Duplikation der fünf Basen CTTCT zu beobachten, IVS3-11_IVS3-7dupCTTCT (g.6361_6365dupCTTCT). Die anderen fünf Polymorphismen sind durch Nukleotidsubstitutionen gekennzeichnet, die nicht zu einer Änderung der Aminosäuresequenz führen. Im Einzelnen sind dies: IVS5-50G>A (g.10553G>A) in Intron 5, Ser69Ser (g.12739G>A) in Exon 8, Ile106Ile (g.13150T>C) in Exon 9, IVS11-32C>A (g.15978C>A) in Intron 11 und IVS14-33C>T (g.18708C>T) in Intron 14. Die Lokalisation der identifizierten genetischen Varianten ist in der Intron-Exon-Struktur des Troponin T-Gens dargestellt (Abb. 3-19).
Auch hier wurden bei allen sechs Polymorphismen die Genotypen der 46 DCM-Patienten bestimmt. Es konnte jeweils die Allelfrequenz und die nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz erwartete Häufigkeit berechnet und schließlich mittels des Chi²-Tests ein Abweichen vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht überprüft werden. Wie bei der Analyse des β-MHC-Gens dienten als Kontrollkollektiv genotypisierte HCM-Patienten des Deutschen Herzzentrums Berlin.

	Abbildung 3-19: Lokalisation der Polymorphismen im Troponin T-Gen
	Schematische Darstellung des Troponin T-Gens. Die senkrechten Balken repräsentieren die Exone, die Zwischenräume die Introne. Die Nummerierung der Exone ist nach GenBank Accession Number AY044273.1 angegeben. ATG und TAG sind Start- und Stoppkodons der Translation.

3.3.1  Polymorphismen

3.3.1.1  IVS3-11_IVS3-7dupCTTCT (g.6361_6365dupCTTCT)

Bei der SSCP-Analyse (Raumtemperatur und 4° C) von Exon 3 und 4 waren bei den 46 Patienten drei unterschiedliche Laufmuster vorhanden (Abb. 20A). Die DNA-Sequenzierung ergab einen Polymorphismus mit einer Duplikation der fünf Nukleotide CTTCT an den Nukleotidpositionen g.6361 bis g.6365 (Abb. 3-21).

	Abbildung 3-20: Variante IVS3-11_IVS3-7dupCTTCT (g.6361_6365dupCTTCT)
	A) In der SSCP-Analyse bei 4° C sind die unterschiedlichen Bandenmuster der drei Genotypen deutlich erkennbar. 1/1: keine Duplikation, 1/2: Duplikation in einem Allel, 2/2: Duplikation in beiden Allelen. B) Anhand einer Heteroduplexanalyse wurden die heterozygoten Merkmalsträger anhand der zusätzlichen Heteroduplexbanden identifiziert.

	Abbildung 3-21: DNA-Sequenzierung der Variante IVS3-11_IVS3-7dupCTTCT
	Die Sequenzierung identifizierte einen Polymorphismus mit einer Duplikation von fünf Basen. A) Der homozygote Wildtyp zeigt keine Duplikation. B) Der heterozygote Genotyp zeigt die Duplikation in nur einem Allel. In der Sequenzierung überlagern sich die beiden Allele, zur Verdeutlichung wurden die beiden Allelsequenzen nachträglich getrennt eingetragen. C) Die homozygote Mutante zeigt die Duplikation in beiden Allelen.

Die Variante liegt nicht im Bereich einer Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, so dass zur Bestätigung des Polymorphismus eine Heteroduplexanalyse durchgeführt wurde. Hier konnten bei allen heterozygoten Merkmalsträgern die Heteroduplexbanden nachgewiesen werden (Abb. 3-20B). Die Bestimmung der Genotypen erfolgte anhand des SSCP-Gels bei 4° C.

Die SSCP-Analyse von Exon 6 zeigte die in Abbildung 3-22 dargestellten drei verschiedenen Laufmuster. Dieser Polymorphismus konnte durch die DNA-Sequenzierung näher charakterisiert werden (Abb. 3-23). Es war die Transition G>A an Nukleotidposition g.10553 in Intron 5 ablesbar.

	Abbildung 3-22: Variante IVS5-50G>A (g.10553G>A)
	In der SSCP-Analyse bei 4° C sind die verschiedenen Bandenmuster der Genotypen deutlich sichtbar.

	Abbildung 3-23: DNA-Sequenzierung der Variante IVS5-50G>A (g.10553G>A)
	Die Sequenzierung bestätigte den Polymorphismus: A) Wildtyp homozygot (GG), B) heterozygot (AG) und C) Mutante homozygot (AA).

Da kein passendes Restriktionsenzym zur RFLP-Analyse vorhanden war, wurde der Polymorphismus durch mehrmalige unabhängige Sequenzierung ausgewählter Proben bestätigt. Die Genotypisierung wurde mittels des gut auswertbaren SSCP-Gels bei 4° C durchgeführt.

In der SSCP-Analyse von Exon 8 wurde bei 11 Patienten eine Laufmusterabweichung beobachtet. Diese war bei Raumtemperatur besser sichtbar als bei 4° C (Abb. 3-24A).

	Abbildung 3-24: Variante Ser69Ser (g.12739G>A)
	A) SSCP-Analyse bei Raumtemperatur. In den beiden mittleren Spuren fällt ein abweichendes Laufmuster auf. Die DNA-Sequenzierung bestätigte den Polymorphismus: B) Wildtyp homozygot (GG) und C) heterozygot (AG).

Die DNA-Sequenzierung zeigte eine Nukleotidsubstitution G>A an Position g.12739. Dadurch wird an Kodon-Position 69 TCG gegen TCA ausgetauscht (Abb. 3-24B/C), beide Tripletts kodieren für die Aminosäure Serin.
Der Polymorphismus wurde durch mehrmaliges Sequenzieren einzelner PCR-Fragmente bestätigt, da die Variante nicht im Bereich eines Restriktionsenzyms liegt. Alle 46 Patienten wurden anhand der SSCP-Analyse bei Raumtemperatur genotypisiert.

Die SSCP-Analyse von Exon 9 zeigte sowohl bei Raumtemperatur als auch bei 4° C drei verschiedene Laufmuster (Abb. 3-25A). Durch die DNA-Sequenzierung ausgewählter Proben wurde eine T>C Transition an Position g.13150 identifiziert (Abb. 3-26). Die Aminosäure Isoleucin an Kodon-Position 106 bleibt erhalten, ATT wird zu ATC.

	Abbildung 3-25: Variante Ile106Ile (g.13150T>C)
	A) In der SSCP-Analyse bei 4° C zeigen die drei Genotypen deutlich ein unterschiedliches Laufverhalten. B) Durch die gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte von Exon 9 nach enzymatischer Spaltung mit Taq I wurde der Polymorphismus bestätigt, M = 100 bp-DNA-Ladder. C) Dargestellt sind die erwarteten Restriktionsfragment-Längen der Genotypen.

Durch die Nukleotidsubstitution T>C entsteht eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym Taq I (t/cga). Die PCR mit den Primern Troponin T-Exon 9 F/R ergibt ein Amplifikat mit der Länge von 241 Basenpaaren. Werden diese Amplifikate mit der Restriktionsendonuklease Taq I verdaut, erhält man in Abhängigkeit vom Genotyp für jedes Allel charakteristische Restriktionsfragmente (Abb. 3-25C).
Die Genotypisierung erfolgte nach der elektrophoretischen Auftrennung dieser Fragmente in einem 10 %igem Polyacrylamidgel (Abb. 3-25B).

	Abbildung 3-26: DNA-Sequenzierung der Variante Ile106Ile (g.13150T>C)
	In den drei Sequenzierungsausschnitten sind die drei Genotypen sichtbar: A) Wildtyp homozygot (TT), B) heterozygot (CT) und C) Mutante homozygot (CC).

Die SSCP-Analyse von Exon 12 lieferte einen Polymorphismus mit drei unterschiedlichen Bandenmustern. Diese waren sowohl bei Raumtemperatur als auch bei 4° C gut sichtbar (Abb. 3-27).

	Abbildung 3-27: Variante IVS11-32C>A (g.15978C>A)
	SSCP-Analyse bei 4° C. Die drei Spuren zeigen die verschiedenen Laufmuster der drei Genotypen.

Die DNA-Sequenzierung ergab die in Abbildung 3-28 gezeigte Transversion C>A in Intron 11 an Nukleotidposition g.15978.
Da durch die Variante keine Schnittstelle entsteht oder zerstört wird, konnte keine RFLP-Analyse etabliert werden. Zur Genotypisierung des DCM-Kollektivs diente das sehr gut auswertbare SSCP-Gel bei 4° C.

	Abbildung 3-28: DNA-Sequenzierung der Variante IVS11-32C>A (g.15978C>A)
	Die Pfeile kennzeichnen die drei unterschiedlichen Genotypen: A) Wildtyp homozygot (CC), B) heterozygot (AC) und C) Mutante homozygot (AA).

Die SSCP-Analyse von Exon 15 zeigte bei zwölf Patienten die in Abbildung 3-29A dargestellte Laufmusterabweichung. Durch die DNA-Sequenzierung wurde eine Nukleotidsubstitution in Intron 14 an Position g.18708 identifiziert (Abb. 3-29B/C).

	Abbildung 3-29: Variante IVS14-33C>T (g.18708C>T)
	A) Die SSCP-Analyse bei Raumtemperatur zeigte ein aberrantes Bandenmuster (mittlere Spur). Die DNA-Sequenzierung bestätigte den Polymorphismus: B) Wildtyp homozygot (CC) und C) heterozygot (CT).

Durch die Nukleotidsubstitution C>T entsteht eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym TspR I (nncagtgnn). Die PCR mit den Primern Troponin T-Exon 15 F/R produziert ein Fragment von 195 Basenpaaren. Da der homozygote Wildtyp keine Schnittstelle für TspR I hat, behielt er in der Gelelektrophorese die volle PCR-Länge. Der heterozygote Genotyp zeigte zusätzlich zwei Banden von 131 bp und 64 bp. Die homozygote Mutante war im DCM-Kollektiv nicht vorhanden. Die Genotypenbestimmung erfolgte anhand der gelelektrophoretischen Auftrennung der verdauten Fragmente (Abb. 3-30A).

	Abbildung 3-30: RFLP-Analyse der Variante IVS14-33C>T (g.18708C>T)
	A) Der Polymorphismus konnte durch eine RFLP-Analyse mit TspR I nach gelelektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte zusätzlich bestätigt werden, M = 100 bp-DNA-Ladder. B) Das Schaubild zeigt die erwarteten Restriktionsfragment-Längen der drei möglichen Genotypen.

Die sechs identifizierten Polymorphismen im Troponin T-Gen wurden mit Hilfe des Chi²-Tests statistisch analysiert, um ein Abweichen der Genotypen des Kollektivs vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht zu überprüfen (Tab. 3-6).

Bei allen Polymorphismen sind die p-Werte jeweils >0,05. Beobachtete und erwartete Häufigkeit weisen also keinen signifikanten Unterschied auf. Um zu überprüfen, ob ein Allel oder Genotyp bei DCM oder HCM bevorzugt auftritt, wurden die jeweiligen Allel- und Genotypfrequenzen mit denen eines HCM-Kollektivs bereits genotypisierter Patienten aus dem Deutschen Herzzentrum Berlin verglichen. Die Analyse mit Hilfe des Chi²-Unabhängigkeitstests bzw. des exakten Tests nach Fisher ergab auf dem Niveau von p = 0,05 keinen signifikanten Unterschied in der Allel- und Genotypfrequenz des jeweiligen Polymorphismus (Tab. 3-7).

Tabelle 3-6: Troponin T-Gen: Hardy-Weinberg-Gleichgewicht des DCM-Kollektivs (n = 46)

Gegenüberstellung der in dieser Arbeit beobachteten und nach dem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht erwarteten Häufigkeiten. Der Chi²-Test zeigt jeweils keinen signifikanten Unterschied.

Tabelle 3-7: Troponin T-Gen: Vergleich der Allel- und Genotypfrequenzen bei DCM und HCM

Die statistische Analyse der Allel- und Genotypfrequenzen zeigt keinen signifikanten Unterschied zwischen dem DCM-Kollektiv und einem HCM-Kollektiv. * Fisher’s exakter Test