4 Diskussion

↓50

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde bei 46 nicht verwandten Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie eine systematische Mutationssuche in den Sarkomerprotein-Genen für β-MHC und Troponin T durchgeführt. Insgesamt wurden im β-MHC-Gen zehn Varianten identifiziert. Es wurden zwei Mutationen mit Aminosäureaustausch ermittelt, und zwar die Missense-Mutationen Ala223Thr (g.7799G>A) und Ser642Leu (g.12164C>T). Beide Mutationen sind bisher nicht beschrieben worden. Des Weiteren fanden sich zwei seltene genetische Varianten mit unklarer funktioneller Relevanz und sechs Polymorphismen, die in ihrer Allel- und Genotypfrequenz mit einem Kontrollkollektiv bereits genotypisierter HCM-Patienten aus der DNA-Datenbank des Deutschen Herzzentrums Berlin verglichen wurden [99].
Im Troponin T-Gen wurden keine Mutationen gefunden. Die Analyse zeigte sechs Polymorphismen, als Kontrollkollektiv dienten ebenfalls bereits genotypisierte HCM-Patienten [99].

4.1  Bewertung des Patientenkollektivs und der Methoden

Alle 46 Patienten erfüllten die Diagnosekriterien für DCM der Europäischen Arbeitsgruppe über familiäre Kardiomyopathien (Collaborative Research Group of the European Human and Capital Mobility Project on Familial Dilated Cardiomyopathy) [18]. Der LVEDD war größer als 117 % des für das Alter und für die Körperoberfläche entsprechenden Normwertes, und bei allen Patienten waren die LVEF kleiner als 45 % und/oder die VF kleiner als 25 %. Es wurden überwiegend junge Patienten in die Studie aufgenommen, um andere Ursachen für eine Dilatation des Herzens gering zu halten. Da mehrere Arbeitsgruppen von einem Übergang von HCM zu DCM berichten [100,101], wurden bei allen Patienten die typischen Merkmale einer HCM ausgeschlossen. Echokardiographisch war keine asymmetrische Hypertrophie des Kammerseptums und der linksventrikulären Hinterwand messbar, und die Myokardbiopsie zeigte keinen Verlust der regelmäßigen parallelen Anordnung der Myozyten (disarray) [4].

↓51

Zum Nachweis von unbekannten Mutationen steht eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung [90]. Das von uns gewählte PCR-SSCP-Detektionsverfahren hat den entscheidenden Vorteil, dass eine große Anzahl von Personen und große DNA-Bereiche schnell auf genetische Varianten mit vertretbarem Material- und Etablierungsaufwand untersucht werden können. Dies wäre durch andere Methoden mit einem vergleichbaren Aufwand nicht zu erreichen. Der Nachteil der SSCP-Analyse ist, dass verschiedene Arbeitsgruppen die Sensitivität nur zwischen 70 und 90 % angeben, so dass Mutationen übersehen werden können [87,88]. Jedoch kann die Sensitivität bei einer DNA-Fragmentlänge von 150 bis 300 bp und optimalen Elektrophorese-Bedingungen angehoben werden [89,91]. Deshalb wurde in dieser Arbeit die Analyse bei zwei unterschiedlichen Temperaturen durchgeführt – Raumtemperatur und 4° C. Außerdem optimierten wir die Acrylamidkonzentration und Ionenstärke des Laufpuffers, um die Detektionsrate zu erhöhen.
Weiterhin wurde in unserer Arbeitsgruppe ein Patientenkollektiv mit HCM auf Mutationen im β-MHC-Gen sowohl mit der etablierten SSCP-Methode als auch mit der Temperatur-modulierten Heteroduplexanalyse (TMHA) untersucht, um die Sensitivität beider Methoden zu vergleichen [102]. Es zeigte sich, dass unsere SSCP-Methode im Vergleich zur TMHA eine Sensitivität von 92 % besitzt, diese Mutationsdetektionsrate liegt im oberen Bereich von veröffentlichten SSCP-Sensitivitätsraten [103,104]. Es ist also nahezu ausgeschlossen, dass Genvarianten bei den untersuchten Patienten übersehen wurden.
Um Sequenzabweichungen zu ermitteln wurden die auffälligen Proben sequenziert. Als zusätzliche Bestätigung der Varianten wurde entweder eine Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen-Analyse, eine Heteroduplexanalyse oder eine erneute Sequenzierung eines unabhängigen PCR-Produkts angewandt.

4.2 Bedeutung von seltenen genetischen Varianten und Polymorphismen

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden neben zwei Missense-Mutationen zwei Mutationen ohne Aminosäureaustausch im β-MHC-Gen und jeweils sechs Polymorphismen im β-MHC- und im Troponin T-Gen identifiziert. Die Bedeutung von synonymen Varianten, die nicht zu einem Aminosäureaustausch führen, ist schwer abzuschätzen. Üblicherweise gelten sie als bedeutungslos. Durch die Veränderung der Nukleotidsequenz und damit der RNA-Sekundärstruktur besteht jedoch die Möglichkeit, dass Transkription, Processing und Translation beeinflusst werden.
Das Processing überführt die transkribierte, unreife prä-mRNA in die reife mRNA, die dann der Translation zur Verfügung steht. Sie umfasst die drei Reifungsschritte Capping, Polyadenylierung und Spleißen. Die meisten Krankheiten, die durch Veränderung des Processings entstehen, beruhen auf Defekten während des Spleißens der prä-mRNA [105]. Für korrektes Spleißen werden RNA-Erkennungssequenzen benötigt, die am Intron-Exon-Übergang (Spleißdonor/-akzeptor) und innerhalb des Introns (Verzweigungspunkt) liegen. Mutationen, die solche Erkennungssequenzen zerstören, führen zu einem aberranten Spleißen. Es wird geschätzt, dass 15 % aller pathologischen Mutationen zu Spleißdefekten der betroffenen Gene führen [106].
Um den Einfluss der intronischen Variante IVS2-25G>T im β-MHC-Gen und der fünf intronischen Polymorphismen auf das Spleißen vorhersagen zu können, wurden die veränderten Sequenzen mit dem Splice-Site-Prediction-Tool des Berkeley Drosophila Genome Project analysiert [107]. Es zeigte sich, dass alle sechs intronischen Varianten außerhalb von Spleiß-Konsensus-Sequenzen liegen, so dass ein Einfluss auf das Spleißen der prä-mRNA unwahrscheinlich ist. Vermutlich haben diese Varianten also keine funktionelle Bedeutung.
Bei der Translation wird die genetische Information in Protein umgesetzt. Jeweils drei Nukleotide (Triplett) sind einer Aminosäure zugeordnet, eine Aminosäure kann jedoch von verschiedenen Tripletts kodiert werden, die sich nur in der dritten Stelle unterscheiden. Diese Tripletts oder Kodons werden als synonym bezeichnet. Bei einer Nukleotidsubstitution an der dritten Position des Tripletts kann das veränderte Kodon eine seltenere tRNA verlangen, und dadurch zu einer Veränderung der Translationseffizienz führen. Grantham et al. zeigten, dass die Verwendung synonymer Kodons nicht zufällig ist, sondern dass bestimmte Kodons spezies-spezifisch bevorzugt werden [108]. Hierfür wurde der Begriff „codon usage bias“ geprägt. Durch die selektive Verwendung synonymer Kodons soll für die jeweilige Spezies ein Selektionsvorteil entstehen, der durch die erhöhte Translationseffizienz erklärt wird [109,110].
Von den zwölf identifizierten Polymorphismen befinden sich sieben in den kodierenden Bereichen der beiden Gene, außerdem fand sich eine synonyme Mutation Asp376Asp im β-MHC-Gen. Anhand der Datenbank des Kazusa DNA Research Institute wurde analysiert, ob jeweils eine Bevorzugung eines der beiden Kodons vorliegt (Tab. 4-1) [111]. Bei den Polymorphismen Phe244Phe, Asp325Asp, Lys365Lys und Ile106Ile besteht nur ein geringer Unterschied in der Häufigkeit, mit der das jeweilige synonyme Kodon eingebaut wird. Es wird also nicht eindeutig ein bestimmtes Kodon bevorzugt. Bei den Varianten Thr63Thr, Gly354Gly und Ser69Ser besteht ein stärkerer Unterschied in der Häufigkeit der verwendeten Kodons, was für einen Selektionsvorteil spricht. Wie groß der Einfluss auf die Translationseffizienz tatsächlich ist und inwieweit dies zur Krankheitsentstehung beiträgt, kann aufgrund dieser Werte jedoch kaum abgeschätzt werden.

Tabelle 4-1: Codon usage der stummen Varianten im β-MHC- und Troponin T-Gen

Gen

Variante

Kodon

Codon usage

Häufigkeit /
1.000 Kodons

Anzahl der unter suchten Kodons

MYH7

Asp376Asp

GAC

54 %

25,5

765.702

GAT

46 %

21,9

656.552

Thr63Thr

ACC

60 %

19,2

574.769

ACT

40 %

13,0

389.477

Phe244Phe

TTC

55 %

20,5

613.217

TTT

45 %

17,1

512.809

Asp325Asp

GAC

54 %

25,5

765.702

GAT

46 %

21,9

656.552

Gly354Gly

GGC

68 %

22,6

678.626

GGT

32 %

10,8

323.268

Lys365Lys

AAG

57 %

32,2

965.496

AAA

43 %

23,9

717.175

TNNT2

Ser69Ser

TCG

27 %

4,5

134.506

TCA

73 %

12,0

358.579

Ile106Ile

ATT

43 %

15,8

472.168

ATC

57 %

21,1

633.572

Codon usage zeigt an, zu welchem Anteil das spezifische Kodon im Vergleich zu seiner synonymen Variante verwendet wird. Außerdem ist angegeben, wie häufig das jeweilige Kodon innerhalb von 1.000 Kodons beobachtet wurde, und wie viele Kodons insgesamt untersucht wurden.

↓52

Die synonyme Mutation Asp376Asp im β-MHC-Gen führt zu einem Austausch des Kodons GAC zu GAT. Beim Menschen ist GAC mit einer Häufigkeit von 54 %, GAT mit 46 % vertreten. Es besteht also keine eindeutige Bevorzugung eines der beiden Tripletts, so dass eine Veränderung der Translationseffizienz unwahrscheinlich erscheint.
Auffällig ist, dass die Mutation bei dem gleichen Patienten auftrat, der die Mutation Ala223Thr trägt. Inwieweit die synonyme Mutation zur Beeinträchtigung der Proteinfunktion bei diesem Patienten beiträgt, ist unklar. Obwohl es primär nicht zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz kommt, ist denkbar, dass durch die Nukleotidsubstitution C>T an Position g.9666 ein fakultatives Spleißsignal innerhalb des Exons (Spleiß-Enhancer) zerstört wird. Solche Spleiß-Enhancer-Mutationen sind unter anderem bei der Neurofibromatose Typ 1 oder der spinalen Muskelatrophie beschrieben, bei der eine synonyme Mutation in Exon 7 zu einem alternativen Spleißprodukt führt und so die Krankheit verursacht [112,113].
Kürzlich berichtete eine Arbeitsgruppe aus Japan ebenfalls von der Mutation Asp376Asp in einem Patientenkollektiv von 99 nicht verwandten DCM-Patienten [114]. Da die Mutation nicht zu einem Aminosäureaustausch führt, wurde sie jedoch in dieser Veröffentlichung nicht diskutiert.

In der statistischen Analyse der in der vorliegenden Arbeit identifizierten zwölf Polymorphismen wurden die jeweilige beobachtete Genotypverteilung im DCM-Patientenkollektiv mit nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz errechneten Werten verglichen. Diese Analyse ergab keinen signifikanten Unterschied in der Verteilung der Genotypen (p > 0,05).
Da die Polymorphismen auch bei HCM beschrieben wurden [99], haben wir für die weitere statistische Analyse HCM-Patienten hinzugezogen, die bereits in elf der zwölf beschriebenen Polymorphismen genotypisiert waren. Um zu testen, ob ein Allel oder Genotyp bei DCM im Vergleich zu HCM gehäuft auftritt, haben wir die jeweiligen Allel- und Genotypfrequenzen der Polymorphismen verglichen. Es konnte jedoch kein signifikanter Unterschied zwischen DCM und HCM nachgewiesen werden. Es tritt also mit hoher Wahrscheinlichkeit weder bei DCM noch bei HCM ein bestimmtes Allel oder ein bestimmter Genotyp bevorzugt auf. Eine direkte pathogenetische Relevanz der Polymorphismen erscheint daher unwahrscheinlich.
Da sich im Rahmen unserer Fragestellung keine Anhaltspunkte auf eine krankheitsverursachende Rolle der zwölf Polymorphismen ergab, wurden keine weiteren funktionellen Untersuchungen durchgeführt.

4.3 Genotyp-Phänotyp-Korrelation

Die Genotyp-Phänotyp-Korrelation beschreibt, ob ein Zusammenhang zwischen molekulargenetischen und klinischen Befunden besteht, ob also bestimmte Mutationen in bestimmten Genen für einen bestimmten Phänotyp prädisponieren. Der Phänotyp kann durch mehrere Merkmale charakterisiert werden: durch die Penetranz der Erkrankung bzw. das Alter bei Krankheitsbeginn, durch den Schweregrad und Verlauf der Erkrankung und durch einen zusätzlichen Phänotyp neben der Grunderkrankung.
Die dilatative Kardiomyopathie wird sowohl durch Mutationen in Genen für das Sarkomer als auch für das Zytoskelett verursacht. Dabei treten teilweise zusätzliche Phänotypen auf. Einerseits sind dies kardiale Manifestationen, z. B. Störungen des Erregungsleitungssystems bei Mutationen im Lamin A/C-Gen oder ein Mitralklappenprolaps bei Mutationen im Locus 10q21-23 [30,37]. Die DCM kann aber auch von extrakardialen Störungen wie Skelettmuskelmyopathien (Dystrophin, Desmin, Tafazzin) [33,35,80] oder Innenohrschwerhörigkeit (EYA4) [81] begleitet sein. Bei allen bisher bekannten Mutationen in Sarkomerprotein-Genen bei DCM-Patienten trat jedoch keiner dieser zusätzlichen Phänotypen auf. Auch die zwei Patienten dieser Studie, die Träger der beiden Mutationen im β-MHC-Gen sind, leiden an einer isolierten dilatativen Kardiomyopathie.
Als Penetranz wird bei einer Erbkrankheit die Tendenz zur Ausprägung von typischen Symptomen bezeichnet. Sie ist bei der DCM altersabhängig und dabei sehr variabel. Familienmitglieder mit der gleichen Mutation können bereits als Kind oder erst sehr viel später im Erwachsenenalter erkranken. Da bei beiden Indexpatienten keine Familienmitglieder zur genetischen Untersuchung bereit standen, ist es schwierig, Aussagen über die Penetranz der beiden Mutationen zu machen. Es zeigte sich lediglich ein Unterschied im Erkrankungsbeginn. Der Indexpatient mit der Mutation Ser642Leu erkrankte bereits mit 18 Jahren an einer DCM, der Patient mit der Mutation Ala223Thr erst mit 35 Jahren. Wie bei vielen monogen vererbten Erkrankungen hängt die phänotypische Ausprägung der Erkrankung wohl von weiteren Faktoren ab. Dies können genetische Faktoren, wie Modifier Genes, aber auch nicht-genetische Faktoren, wie Umweltfaktoren, Autoantikörper oder hämodynamische Veränderungen sein [115,116]. Diese Faktoren tragen ebenfalls zur Schwere der Erkrankung bei.

↓53

Bei der hypertrophen Kardiomyopathie konnte gezeigt werden, dass Mutationen in verschiedenen Sarkomerprotein-Genen einen unterschiedlichen Schweregrad und Verlauf der Erkrankung hervorrufen können. So führen Mutationen im Troponin T-Gen zwar nur zu einer milden Hypertrophie, sind aber mit einem hohen Risiko für den plötzlichen Herztod assoziiert [62]. Mutationen im β-MHC-Gen sind überwiegend mit einem schweren Krankheitsverlauf verbunden [117]. Dahingegen führen Mutationen im Myosin-Bindungsprotein C-Gen eher zu einem milden Verlauf [118].
Um bei der dilatativen Kardiomyopathie Aussagen über Schweregrad und Krankheitsverlauf bei Vorliegen von einzelnen Mutationen in den verschiedenen Sarkomerprotein-Genen treffen zu können, sind bisher noch zu wenige Familien untersucht worden. Mogensen et. al. identifizierten in fünf Familien vier Mutationen im Troponin T-Gen und eine Mutation im Troponin C-Gen [69]. Insgesamt lag ein maligner Verlauf vor, denn 15 von 21 Mutationsträgern (71 %) verstarben am plötzlichen Herztod oder erhielten eine Herztransplantation. Auch die beiden bereits bekannten Mutationen im β-MHC-Gen, Ser532Pro und Phe764Leu, führen zu einem eher schweren Krankheitsverlauf, auffällig ist hier insbesondere bei der Mutation Phe764Leu ein früher Krankheitsbeginn [48].
Der Indexpatient mit der Mutation Ser642Leu erkrankte bereits im Alter von 18 Jahren. Initial wurde er klinisch als NYHA III eingestuft und zur Transplantation akzeptiert. Aufgrund von ventrikulären Arrhythmien wurde ein ICD implantiert; ebenso bei dem Indexpatienten mit der Mutation Ala223Thr, der nach Kammerflimmern einen ICD erhielt. Die Erkrankung trat bei diesem Patienten erst in einem Alter von 35 Jahren auf. Bei beiden zeichnet sich insgesamt ein schwerer Krankheitsverlauf ab. Um jedoch genauere Aussagen zur Genotyp-Phänotyp-Korrelation bei DCM-assoziierten Mutationen machen zu können, sind Untersuchungen größerer Familien und im Tiermodell notwendig.

Bei den 46 nicht verwandten Patienten wurden neben den Genen für β-MHC und Troponin T, die in der vorliegenden Arbeit beschrieben sind, auch die Gene für Myosin-Bindungsprotein C und α-Tropomyosin analysiert. Die vier Gene wurden ausgewählt, da Mutationen in diesen Genen die häufigste Ursache für HCM sind [119]. Das Ziel war, erstens neue Mutationen in Sarkomerprotein-Genen bei DCM zu entdecken und zweitens ihre Häufigkeit in einem nicht verwandten Patientenkollektiv anzugeben.
Kamisago et al. untersuchten 20 Patienten mit familiärer DCM in den Genen für β-MHC, Troponin T, Troponin I und α-Tropomyosin [48]. Es wurde bei zwei Patienten eine Deletion im Troponin T-Gen gefunden, bei einem eine Missense-Mutation im β-MHC-Gen. Deshalb wurde die Häufigkeit von Mutationen in Sarkomerprotein-Genen bei Patienten mit familiärer DCM mit mindestens 10 % angegeben. Kürzlich identifizierten Villard et al. in einem Kollektiv von 96 nicht verwandten DCM-Patienten sowohl bei zwei Patienten die bereits bekannte Mutation Arg141Trp im Troponin T-Gen als auch sieben neue Mutationen im β-MHC-Gen [120]. Das Mutationsscreening umfasste neben dem β-MHC- und Troponin T-Gen auch die Gene für Phospholamban und Metavinculin, in denen keine Mutationen entdeckt wurden. Deshalb schreiben die Autoren dem β-MHC-Gen eine vorherrschende Rolle bei dilatativer Kardiomyopathie zu.
Wir haben neben den beiden bereits beschriebenen Mutationen im β-MHC-Gen im gleichen Patientenkollektiv eine weitere Mutation im Myosin-Bindungsprotein C-Gen identifiziert [64]. Die Häufigkeit von Mutationen in unserer Patientengruppe liegt also bei 6,5 % und somit niedriger als 10 %. Die Erklärung dafür könnte die Zusammensetzung des Patientenkollektivs sein. Unser Kollektiv bestand aus 46 nicht miteinander verwandten symptomatisch erkrankten Patienten, Kamisago et al. akquirierten ihre 20 Patienten dahingegen aus 20 betroffenen Familien. Außerdem hatten bei Villard et al. die Träger von Mutationen im β-MHC-Gen bei Diagnosestellung bereits ein Alter von 48,2 ± 17 Jahren, die Autoren stellten somit einen späten Krankheitsbeginn bei Patienten mit Mutationen im β-MHC-Gen fest [120]. Da wir unsere 46 Patienten anhand eines frühen Alters bei Diagnosestellung (29,5 ± 7,9 Jahre) auswählten, könnte demnach die Wahrscheinlichkeit geringer sein, DCM-Patienten mit Mutationen im β-MHC-Gen zu erfassen. Ein weiterer Grund für das seltenere Auftreten von Mutationen in unserem Kollektiv könnte darin bestehen, dass wir nur den Kopfteil des β-MHC untersucht haben. Vier der sieben Mutationen von Villard et al. sind im Schwanzteil lokalisiert [120].

4.4 Molekularbiologischer Krankheitsmechanismus

Das β-MHC-Gen und das Troponin T-Gen kodieren beide für Bestandteile des Sarkomers. Durch Mutationen kann es zu einem defekten, nicht funktionsfähigen Protein kommen, wodurch die Muskelkontraktion beeinflusst wird.
Bei Mutationen in autosomal-dominant vererbten Genen gibt es zwei verschiedene Pathomechanismen, die zu einer Veränderung der Proteinfunktion führen. Der eine Weg ist die Haploinsuffizienz [39]. Durch Deletions-, Insertionsmutationen und Mutationen im Bereich von Spleiß-Donor- und Spleiß-Akzeptor-Stellen, wie sie zum Beispiel im Troponin T- und vor allem im Myosin-Bindungsprotein C-Gen vorkommen, wird ein Allel inaktiviert, was zu weniger funktionstüchtigem Protein führt. Die Aktivität des normalen Allels reicht quantitativ nicht aus, um den Ausfall des mutierten Allels zu kompensieren. Die zweite Möglichkeit ist der dominant-negative Mechanismus [121]. Es wird ein mutiertes Protein gebildet, das mit der normalen Proteinfunktion interferiert oder eine neue Funktion hat. Die Wirkung des normalen Proteins wird aufgehoben.
Die überwiegende Zahl aller bisher beschriebenen Mutationen im kardialen β-MHC-Gen bei HCM und DCM sind Missense-Mutationen, die dominant-negative Effekte bewirken und nicht zu einem vorzeitigen Abbruch der Transkription führen [40,41,42].
Es stellt sich die Frage, wie der Austausch einer einzelnen Aminosäure die Krankheit verursachen kann und insbesondere, wann eine Mutation zu DCM, wann zu HCM führt. Dies soll im Folgenden anhand der gefundenen Mutationen im β-MHC-Gen bei DCM erörtert werden.

4.5 Phänotyp bei Mutationen in Sarkomerprotein-Genen

↓54

Eine effektive Muskelkontraktion erfordert die Krafterzeugung durch das Sarkomer und die Kraftübertragung durch Zytoskelett und extrazelluläre Matrix. Lange Zeit glaubte man, dass eine ineffektive Krafterzeugung zur hypertrophen Kardiomyopathie führt, Defizite in der Kraftübertragung hingegen in einer dilatativen Kardiomyopathie münden. Deshalb wurde die HCM als Erkrankung des Sarkomers und DCM als Erkrankung des Zytoskeletts bezeichnet [25,47].
Mittlerweile konnte jedoch gezeigt werden, dass Mutationen in sieben Sarkomerprotein-Genen auch zu DCM führen können (Tab. 4-2). Die These, dass DCM ausschließlich eine Erkrankung des Zytoskeletts und HCM eine Erkrankung des Sarkomers ist, ist also nicht mehr haltbar. Ob dabei eine eindeutige Beziehung zwischen Genotyp und Phänotyp besteht, ob also die Position der Mutation im Molekül die Entwicklung einer HCM bzw. DCM bestimmt, ist bisher unklar. Es sind grundsätzlich zwei Mechanismen denkbar:
Die erste Möglichkeit ist, dass zwei unterschiedliche Pathomechanismen für DCM bzw. HCM verantwortlich sind. Dies würde bedeuten, dass Mutationen an unterschiedlichen Positionen des gleichen Gens zwei verschiedene Krankheitsphänotypen auslösen können. Dabei treten die verursachenden Mutationen in unterschiedlichen funktionellen Domänen des Proteins auf. Diese These wird durch die bisher bekannten Mutationen im kardialen α-Aktin gestützt. HCM-verursachende Mutationen in diesem Gen treten in Regionen auf, die an der Krafterzeugung beteiligt sind, während DCM-verursachende Mutationen in Regionen identifiziert wurden, die mutmaßlich an der Kraftübertragung beteiligt sind [38].
Im Gegensatz dazu wäre es möglich, dass nur ein einziger Pathomechanismus für beide Krankheitsphänotypen verantwortlich ist, und diese nur eine Abstufung des Mechanismus darstellen. Die in dieser Arbeit beschriebene Mutation Ser642Leu und die bereits bekannte Mutation Ser532Pro im β-MHC-Gen, die beide ausschließlich mit DCM assoziiert sind, treten in der Aktin-Bindungsregion des Myosins auf [48]. Diese Region ist wesentlich an der Krafterzeugung beteiligt und stellt eine der vier Hauptregionen dar, in denen HCM-Mutationen auftreten [122]. Ob eine Mutation zu DCM oder HCM führt, muss also von weiteren Faktoren abhängig sein. Eine Möglichkeit könnte das Ausmaß des Kontraktionsdefizits sein. Geringe Defizite könnten durch Hypertrophie kompensiert werden, während eine schwere Dysfunktion des Sarkomers nicht zur effektiven Kompensation ausreicht und somit zur Dilatation führt. Studien an genetisch veränderten Mäusen haben gezeigt, dass heterozygote Mäuse, die die Mutation Arg403Gln im α-MHC-Gen tragen, eine HCM entwickeln, während homozygote Mäuse eine schnell progressive DCM zeigten [123,124]. Ähnliche Ergebnisse konnten McConnell et al. bei MYBPC3 erzielen [125]. Des weiteren wurden bei Patienten mit HCM eine Dekompensation des Herzens und ein Übergang in die dilatative Form beobachtet („burn-out“) [101].

Tabelle 4-2: Alle bekannten DCM-Mutationen in Sarkomerprotein-Genen

Gen

Genort

Protein

Mutation

Anzahl der Familien

Referenz

MYH7

14q12

β-MHC

Ile201Thr

1 Familie

Villard 2005 [120]

Ala223Thr

1 Indexpatient

diese Studie

Thr412Asn

1 Indexpatient

Villard 2005 [120]

Ser532Pro

1 Familie

Kamisago 2000 [48]

Ala550Val

1 Familie

Villard 2005 [120]

Ser642Leu

1 Indexpatient

diese Studie

Phe764Leu

1 Familie

Kamisago 2000 [48]

Thr1019Asn

1 Familie

Villard 2005 [120]

Arg1193Ser

1 Familie

Villard 2005 [120]

Glu1426Lys

1 Familie

Villard 2005 [120]

Arg1500Trp

1 Indexpatient

Kärkkäinen 2004 [126]

Arg1634Cys

1 Indexpatient

Villard 2005 [120]

TNNT2*

1q32

Troponin T

Arg131Trp

1 Familie

Mogensen 2004 [69]

Arg141Trp

1 Familie

Li 2001 [127]

1 Familie

Villard 2005 [120]

Ala172Ser

1 Familie

Stefanelli 2004 [128]

Arg205Leu

1 Familie

Mogensen 2004 [69]

Lys210del

2 Familien

Kamisago 2000 [48]

1 Familie

Hanson 2002 [129]

1 Familie

Mogensen 2004 [69]

Asp270Asn

1 Familie

Mogensen 2004 [69]

TPM1

15q22.1

α-Tropomyosin

Glu40Lys

1 Familie

Olson 2001 [65]

Glu54Lys

1 Indexpatient

Olson 2001 [65]

MYBPC3

11p11.2

Myosin-Bindungsprotein C

Asn948Thr

1 Indexpatient

Daehmlow 2002 [64]

TNNI3

19q13.4

Troponin I

Ala2Val

1 Familie

Murphy 2004 [67]

TNNC1

3p21.3-14.3

Troponin C

Gly159Arg

1 Familie

Mogensen 2004 [69]

ACTC

15q11-q14

α-Aktin

Arg312His

1 Familie

Olson 1998 [38]

Glu361Gly

1 Familie

Olson 1998 [38]

Bisher sind über 20 verschiedene Mutationen in Sarkomerprotein-Genen bei DCM beschrieben, wovon die meisten Missense-Mutationen im β-MHC-Gen sind.
* Die Aminosäure-Position ist nach der GenBank Accession Number AY044273.1 angegeben.

4.6 Mögliche funktionelle Effekte der Mutationen Ala223Thr und Ser642Leu

Einige Argumente sprechen für ein krankheitsverursachendes Potential der beiden Mutationen Ala223Thr und Ser642Leu im β-MHC-Gen. Erstens waren die Mutationen weder bei 136 HCM-Patienten, noch bei 88 gesunden Kontrollpersonen, die im Rahmen dieser Studie untersucht wurden, vorhanden. Bei den Varianten handelt es sich also nicht um Polymorphismen. Zweitens sind die Bereiche, in denen die Mutationen liegen, evolutionär konserviert. Lediglich bei Drosophila melanogaster ist an Position 223 bereits die Aminosäure Threonin und an Position 642 Glycin vorhanden. Dies legt nahe, dass diese Aminosäure-Reste für eine normale Proteinfunktion wichtig sind.

↓55

Beide Mutationen wurden von der Arbeitsgruppe Frömmel an der Charité mit dem STRAP-Programm (Editor for Structural Alignment of Proteins) [130] auf die Proteinstruktur des Myosins projiziert (siehe 3.2.1.3). Die neu gefundenen Mutationen wurden neben den bereits bekannten in der dreidimensionalen Struktur des Proteins dargestellt. Die Mutation Ala223Thr liegt in der Nähe der ATP-Bindungsstelle, in der oberen 50 kDa Domäne des β-MHC. Der Platzbedarf der Aminosäure Threonin ist geringfügig größer als der von Alanin. Dieser Größenunterschied könnte dazu führen, dass Threonin schwieriger in die Proteinstruktur einzufügen ist und es dadurch zu einer Veränderung der Raumstruktur des Proteins kommt. Der Austausch könnte die Thermostabilität verringern und die Proteinfaltung und somit die Proteinmotilität beeinträchtigen [131]. Außerdem ist Ala223Thr neben der HCM-verursachenden Mutation Gln222Lys lokalisiert [122], was die funktionelle Relevanz dieser Region bestärkt.
Das Ergebnis der STRAP-Analyse für Ser642Leu deutet auf funktionelle Veränderungen der Aktin-Myosin-Interaktion hin. Die Mutation liegt in einer Schleife des Myosins, die direkt mit Aktin interagiert, wodurch es zu einer Veränderung von Bindungsaffinität und -kinetik kommen könnte. Durch eine verstärkte hydrophobe Wechselwirkung könnte die Interaktion verstärkt oder umgekehrt die Affinität durch den Verlust einer Wasserstoffbrückenbindung vermindert werden. Da Leucin größer ist als Serin, könnte außerdem die chemische Reaktionsfähigkeit beeinflusst werden. Weiterhin ist die DCM-verursachende Mutation Ser532Pro ebenfalls in der Aktin-Myosin-Bindungsregion lokalisiert [48]. Da HCM-verursachende Mutationen häufig um spezifische Loci gruppiert sind [122], könnte dies auch für DCM-verursachende Varianten zutreffen. Die Aktin-Myosin-Bindungsregion könnte so ein spezifischer Locus sein.
Mehrere molekulare Pathomechanismen als Ursache der dilatativen Kardiomyopathie werden diskutiert. So können Defizite in der Kraftübertragung und in der Krafterzeugung, aber auch ein Energiedefizit oder vorzeitige Apoptose zur dilatativen Kardiomyopathie führen [132]. Auch die Mutation Ser642Leu in der Aktin-Myosin-Bindungsregion kann zu einer verminderten Krafterzeugung führen.
Ein definitiver Nachweis der krankheitsverursachenden Natur der Varianten ist jedoch nicht möglich, da keine Familienmitglieder zur Berechnung eines Zweipunkt LOD-Score verfügbar waren. Nächste Schritte wären einerseits die Untersuchung weiterer Familien auf die beiden Mutationen in diesen Genen und andererseits ein transgenes Mausmodell, um die funktionelle Relevanz der Mutationen zu bestärken.

4.7 Bedeutung der molekulargenetischen Diagnostik von DCM

Die systematische Mutationssuche in den Sarkomerprotein-Genen für β-MHC und Troponin T bei 46 Patienten mit idiopathischer DCM ergab bei zwei Patienten eine Mutation mit krankheitsverursachendem Potential. Bei den restlichen 44 Patienten basiert die Krankheit wahrscheinlich auf anderen Ursachen, wobei ein Patient Träger einer Mutation im Myosin-Bindungsprotein C-Gen ist [64]. Dies bestätigt die Vielfalt der möglichen Ursachen und Pathomechanismen der DCM [132].
Da DCM in 20 bis 35 % der Fälle eine familiäre Erkrankung ist [19,20], ist eine detaillierte Familienanamnese und die Untersuchung von erstgradig Verwandten sinnvoll. Mittels EKG und Echokardiographie kann bei 5 bis 10 % der Verwandten eine bisher asymptomatische DCM diagnostiziert und bei weiteren 25 % eine Dilatation des linken Ventrikels oder eine verminderte Ejektionsfraktion festgestellt werden [133]. Darüber hinaus haben die COMET- und SOLVD-Studie gezeigt, dass eine prophylaktische Herzinsuffizienz-Therapie bei asymptomatischen Personen mit verminderter systolischer Funktion einen positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf hat [134,135]. Daher ist es denkbar, dass die frühe Diagnose und Behandlung asymptomatischer Patienten mit familiärer DCM auch ihre Prognose verbessern kann [136]. Insbesondere die Gefahr des plötzlichen Herztodes, wie sie bei Patienten mit Mutationen im Troponin T-Gen besteht, rechtfertigt eine regelmäßige klinische Untersuchung von Verwandten [69]. So kann die Diagnose gesichert und frühzeitig ein ICD implantiert werden.
Inwieweit ein genetisches Screening bei DCM-Patienten sinnvoll ist, ist schwer abzuschätzen. Für die tägliche Praxis ist es sicherlich noch nicht geeignet, denn es gibt zu viele unterschiedliche Gene, die mit DCM assoziiert sind, und häufig sind nur die Genorte bekannt. Auch sind der Verlauf und die Penetranz nicht vorhersehbar. Die genetische Diagnose ist jedoch für die Identifizierung von asymptomatischen Mutationsträgern und von Verwandten mit normalem Genotyp hilfreich. So kann entschieden werden, wer eine regelmäßige Untersuchung benötigt. Darüber hinaus erhofft man sich durch die genetische Untersuchung, die Erkrankung besser zu verstehen, das Risiko besser einschätzen zu können und die Behandlungsstrategie zu optimieren. Die Kenntnis der Ursachen und Pathomechanismen der Erkrankung wird die Entwicklung neuer spezifischer diagnostischer und therapeutischer Strategien ermöglichen - mit dem Ziel, die schlechte Prognose der dilatativen Kardiomyopathie zu verbessern, die derzeit die häufigste Indikation zur Herztransplantation bei jüngeren Erwachsenen darstellt [137].


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04.07.2007