1 Einleitung

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Die Glomerulonephritis ist eine der häufigsten Ursachen des terminalen Nierenversagens. Sie ist durch einen fortschreitenden Funktionsverlust bis zum vollständigen Organversagen gekennzeichnet [1]. Der Funktionsuntergang korreliert eng mit vermehrter Expression von extrazellulären Matrixproteinen im Nierengewebe. Die Akkumulation renaler Matrixproteine findet sich bei akuter sowie bei chronischer Niereninsuffizienz [2]. Die extrazelluläre Matrixexpansion ist eine uniforme Gewebsantwort auf verschiedene Verletzungsstimuli verursacht durch z.B. Bluthochdruck, Entzündungsvorgänge, renale Hypoxämie oder Diabetes mellitus.

Der endogene Stoffwechsel der Aminosäure L-Arginin ist in die renale Matrix-Produktion und Akkumulation entscheidend involviert. L-Arginin ist die Ausgangssubstanz für die endogene Generierung des zentralen Signal- und Effektormoleküls Stickoxid (NO). Über drei Stickoxid-Synthasen (NOS) ist NO für die Regulation des renalen Gefäßdrucks, immunvermittelte Gewebeschädigung und die neuronale Kontrolle des tubulo-glomerulären Feedbacks bedeutsam. L-Arginin ist zusätzlich die Ausganssubstanz für die Synthese von Polyaminen, L-Prolin und Agmatin [10;19;37,38]. Forschungsarbeiten am Modell der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis der Ratte haben kürzlich zeigen können, dass eine erhöhte diätetische Zufuhr von L-Arginin die glomeruläre Matrixexpansion und Überexpression des profibrotischen Zytokins Transforming-Growth-Factor-ß nach Induktion der Glomerulonephritis signifikant vermindert [3;4;5;6;7]. Unklar blieb in dieser Untersuchung, ob die günstige Wirkung von L-Arginin über die endogene Bildung von NO - insbesondere endothelial gebildetem NO - oder über andere Stoffwechselwege vermittelt wurde.

Ziel dieser Arbeit ist die Prüfung der Hypothesen:

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1.1  Epidemiologie der chronischen Niereninsuffizienz

In den letzen Jahren ist eine stetige Zunahme der Zahl von Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz zu verzeichnen. In der Bundesrepublik Deutschland wurde bei Beginn einer Nierenersatztherapie für das Jahr 2001 eine Inzidenz von 36% Diabetes mellitus (Typ I 4%, Typ II 32%), die vaskuläre Nephropathie mit 17%, gefolgt von der Glomerulonephritis mit 14%, der interstitiellen Nephritis mit 9% und den Zystennieren mit 6% festgestellt [105]. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die diabetische und auch die hypertensive Nephropathie stetig zunehmen. Von 1995 bis 2001 wurde ein Anstieg der Inzidenz bei Therapiebeginn von 27% auf 36% für die diabetische und für die hypertensive Nephropathie von 11% auf 17% verzeichnet [105]. In den USA wurde nach einem Bericht des Annual Data Reports der United States Renal Data Systems eine Inzidenz der Niereninsuffizienz für das Jahr 2002 für folgende Grunderkrankungen vorgelegt: Diabetes mellitus 45%, Hypertonie 27%, Glomerulonephritis 8,6% und Zystennieren 2,2% [10].

1.2  Molekulare Mechanismen bei der chronischen Glomerulonephritis

Die Funktionsverschlechterung der Niere bei chronische Glomerulonephritis ist durch eine irreversible Abnahme des glomerulären Filtrates gekennzeichnet. Damit geht auf histologischer Ebene eine zunehmende Vermehrung des Bindegewebes im Glomerulus einher. Mit zunehmender Krankheitsdauer zeigt sich eine Nierenfibrose [1;2]. Die Zunahme dieses Narbengewebes korreliert eng mit der renalen Funktionseinschränkung [8]. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass auf molekularer Ebene dem histologischen Bild der Nierenfibrose ein Prozess mit Zunahme von extrazellulärer Matrix zugrunde liegt [2]. Diese Matrix besteht aus drei Einzelkomponenten [2;8]

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  1. einer gesteigerterten Synthese von Matrixproteinen wie Fibronektin, Proteoglykanen, Kollagen I, III, IV, Laminin, Vitronectin, Tenascin und Heparansulfat
  2. eines gehemmten Matrixabbaus durch die verminderte Bildung von Gewebsproteinasen (wie Matrix-Metalloproteinasen = MMP´s, MMp-1 = Kollagenase I, MMP-2 Gelatinase A, MMP-9 = Gelatinase B, Elastase, Serin-Proteinasen) und gesteigerte Bildung von Protease-Inhibitoren (wie Tissue Inhibitors of Metalloproteinases = TIMP´s, Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-Typ-1 = PAI-1)
  3. einer lokalen Überexpression von Matrix-bindenden Rezeptoren (Integrine, z.B. α5β1-Integrin = Fibronektinrezeptor, α1β1-Integrin = Kollagen- und Lamininrezeptor α2β1-Integrin = Kollagenrezeptor).

1.2.1  Nierenfibrose als überschießende Wundheilung

Die Überexpression extrazellulärer Matrix in der Niere findet sich als uniforme Gewebsantwort auf verschiedenartige Schädigungsreize wie Hypertension, Hyperglykämie oder Inflammation [10]. Gleiche Gewebsantworten finden sich auch in anderen Organen bei chronisch-progressiven Erkrankungen wie z.B. bei Leberzirrhose, Lungen- oder Myocardfibrose [2]. Alle diese Erkrankungen gehen mit einer Fibrosierung und einem daraus resultierenden Funktionsverlust des Organs einher. Die renale Matrixexpansion ist Bestandteil des normalen Wundheilungsprozesses, die nach Schädigung einsetzt, um als Reparatur eines Gewebedefektes eine Normalisierung der Funktion wieder herzustellen. Die Organfibrosierung dagegen kann als nicht terminale Wundheilung beschrieben werden. Unter normalen physiologischen Bedingungen ist die Matrixakkumulation als Reparaturprozess des Defektes im Gewebe in sich beschränkt, da zuviel entstandene Matrix durch z.B. Gewebsproteinasen wieder abgebaut wird. Ein „Zuviel“ an Wundheilung bewirkt den Funktionsverlust durch Fibrose. Bezeichnend für chronisch-fortschreitende Erkrankungen wie die chronische Glomerulonephritis ist der ständig wiederkehrende Schädigungsreiz, auf den das Organ permanent mit Wundheilungsprozessen reagiert. Die normale Regeneration mit einem adäquaten Heilungsprozess ist gestört, zuviel entstandene Matrix wird nicht mehr abgebaut, und es resultiert eine Matrixakkumulation. Die Folge ist die Organfibrosierung [2].

1.2.2 Therapieansätze bei fibrotischen Nierenerkrankungen

Trotz Behandlung der Grunderkrankungen (immunsuppressive Behandlung bei Autoimmun-Glomerulonephritis, Behebung von Harnwegsobstruktionen und Reflux sowie Normalisierung des Blutdrucks und des Blutzuckerspiegels), denen eine chronische Niereninsuffizienz folgt, kann der chronisch-progressive Verlauf der Nierenfibrose oft nicht aufgehalten oder rückgängig gemacht werden. In der spezifischen Behandlung der chronischen Niereninsuffizienz sind bislang der Einsatz von ACE-Hemmern [11] und die Restriktion der Eiweißzufuhr etabliert [1;11]. Auch diese beiden Therapiestrategien können die Progression der Erkrankung lediglich verlangsamen. Bei hypertensiven Erkrankungen ist eine strenge Therapie des Blutdrucks notwendig, bei der vor allem ACE-Inhibitoren und auch AT1-Rezeptorblocker eine Rolle spielen [12]. Für Patienten mit diabetischer Nephropathie bei Diabetes mellitus ist eine optimale Einstellung des Blutzuckerspiegels absolut notwendig. Die Reduktion der Eiweißaufnahme durch diätische Nahrungsumstellung führt ebenfalls wahrscheinlich zur Progressionsverzögerung [12]. Die empfohlene Proteinmenge 0,6 bis 0,8 g/kg Körpergewicht pro Tag sollte von den Patienten nicht überschritten werden. Ansonsten muss die Therapie symptomatisch bleiben und kann lediglich die durch den zunehmenden Funktionsverlust der Nieren auftretenden Folgen ausgleichen. Im Stadium der terminalen Niereninsuffizienz, dem Endstadium der Erkrankung, ist eine Nierentransplantation neben der Dialyse bis heute die einzige Therapiemöglichkeit.

1.2.3 Transforming growth factor ß und seine Rolle in der Nierenfibrose

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Tierexperimentelle Daten konnten zeigen, dass der günstige Effekt der ACE-Inhibition ebenso wie eine Restriktion der Eiweißaufnahme eng mit der Verminderung der renalen Matrixexpansion und der Expression des profibrotisch wirkenden Zytokins TGF-ß in Zusammenhang stehen [13;14]. Forschungsarbeiten konnten eine zentrale Rolle des profibrotischen Zytokins TGF-ß in der Expansion renaler Matrix nachweisen. Dieses Zytokin beeinflusst die drei Mechanismen der Matrixexpansion (vermehrte Produktion, verminderter Abbau und vermehrte Produktion vernetzender Proteinen) und die Regulation der einzelnen Reaktion [17;18]. TGF-ß induziert die Expression von Kollagen, Fibronektin und Proteoglykanen. Weiterhin konnte für den verminderten Abbau extrazellulärer Matrix gezeigt werden, dass TGF-β die Synthese von Proteasen inhibiert und Proteaseinhibitoren (z.B Plasminogen-Activator-Inhibitor 1 [PAI-1]) stimuliert und auch die Synthese steigert. Für den Einfluss auf die Produktion von vernetzenden Proteinen wurde gezeigt, dass TGF-β die Expression von Integrinen auf Zelloberflächen steigert. Durch diesen Prozess werden Zell-Matrixinteraktionen und Matrixvernetzungen möglich. Zusammenfassend kann gesagt werden, das Ausmaß der Fibrosierung korreliert direkt mit der Höhe des TGF-β-Spiegels [10;18]. Ein wichtiger Schritt zum Beweis der zentralen Rolle von TGF-β bei der Organfibrose war der Einsatz von neutralisierenden Antikörpern gegen TGF-β im Modell der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis [16]. In diesem Modell der mesangioproliferativen Glomerulonephritis, deren Kennzeichen unter anderem die rasche und ausgeprägte Akkumulation von extrazellulärer Matrix ist, konnte die Matrixakkumulation durch den Einsatz von neutralisierenden Antikörpern signifikant gesenkt werden. Die Fibrosierung des Glomerulus konnte allerdings nicht vollständig verhindert werden [16]. Das deutet darauf hin, dass weitere Faktoren bei der Entstehung der Fibrose beteiligt zu sein scheinen [15].

In den letzten Jahren wurde für das Verständnis der Entstehung chronischer Nierenleiden eine Reihe von pathogenetisch relevanten Mediatoren identifiziert, die neue Ansatzmöglichkeiten zur Behandlung der chronischen Niereninsuffizienz darstellen. Neben dem Schwerpunkt dieser Arbeit, dem L-Arginin/NO-System sind das unter anderem Endothelin-Rezeptor-Blockaden, TGF-ß neutralisierende Strategien sowie Chemokinin-Rezeptor-Antagonisten [10;18]. Im Folgenden soll ein Überblick über den L-Arginin-Stoffwechsel gegeben werden.

1.2.4 Das L-Arginin/NO-System

1.2.4.1 Die Aminosäure L-Arginin und ihre Stoffwechselwege

L-Arginin ist eine semi-essentielle Aminosäure [19;10;20], die endogen im wesentlichen in den proximalen Tubuluszellen der Niere produziert wird [10]. In geringerem Umfang wird L-Arginin auch von Endothelzellen und von Makrophagen gebildet. Unter normalen physiologischen Bedingungen ist die endogene Produktion von L-Arginin ausreichend, um das metabolische Gleichgewicht aufrecht zu erhalten [19;20]. Bei erhöhtem Verbrauch ist jedoch die vermehrte diätetische Zufuhr für die Unterhaltung der verschiedene L-Arginin-Stoffwechselwege essentiell. Die endogenen Metabolite des L-Arginin sind auf der einen Seite Stickoxid (NO) und auf der anderen Seite Polyamine, L-Prolin und Agmatin [10].

1.2.4.2  Stickoxid – ein „ambivalentes“ Molekül

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Unter physiologischen Bedingungen wird ungefähr 1% der täglichen Argininzufuhr zu NO verstoffwechselt [24]. Stickoxid ist ein reaktionsfreudiges, gasförmiges Molekül mit einer Halbwertszeit von 20 – 30 Sekunden [122]. Gering freigesetzte Menge an NO, das aus L-Arginin via verschiedenen NO-Synthese-Enzymen (NO-Synthasen NOS) hervorgegangen ist, wirkt als intrazellulärer Botenstoff, Neurotransmitter, Vasodilatator, Entzündungsmediator und spielt eine Rolle bei der Zellabwehr [25;26;19]. 1980 konnten R. F. Furchgott und J. F. Zawadzki zeigen, dass Acetylcholin nur dann zu einer Vasorelaxation führt, wenn Endothelzellen vorhanden sind, und folgerten, dass die Kontraktion der Gefäßmuskelzellen durch ein Signalmolekül der Endothelzellen reguliert wird. Dieser noch unbekannte Botenstoff wurde »endothelium-derived relaxing factor«, EDRF genannt [21]. 1986 konnte L.J. Ignarro beweisen, dass es sich bei dem von Furchgott beschriebenen endothelialen Relaxationsfaktor um Stickstoffmonoxid handelt [22]. Ferid Murad konnte zeigen, dass eine der wichtigsten biologisch relevanten Reaktionen des Stickoxids die Bindung an das Enzym lösliche Guanylylcyclase ist. Durch die NO-gekoppelte Aktivierung dieser Guanylylcyclase resultiert die Produktion des second- messenger 3',5'-zyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP), welches eine Reihe von physiologischen Reaktionen wie Vasodilatation und Neurotransmission regulieren kann [114]. Ferid Murad, Robert F. Furchgott und Louis J. Ignarro wurden 1998 für die Entdeckung und Charakterisierung von Stickstoffmonoxid (NO) als zentrales Signalmolekül des Herz-Kreislaufsystems mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet.

NO wird in verschiedenen Zelltypen durch Abspaltung und Oxidation eines Stickstoffatoms von L-Arginin unter Entstehung von L-Citrullin produziert. Diese Reaktion wird durch NO-Synthasen (NOS) katalysiert [115]. Stickstoffmonoxid ist lipophil und kann ungehindert durch Zellmembranen diffundieren. Aufgrund seiner Reaktionsfreudigkeit, z. B. mit Sauerstoff oder mit Hämoglobin, hat NO nur eine kurze Lebensdauer von wenigen Sekunden. Daher wirkt NO vor allem am Ort seiner Produktion. Die Effekte von NO werden durch die Aktivierung der löslichen Guanylylcyclase verursacht. Dadurch steigen die intrazellulären cGMP-Spiegel der glatten Muskelzellen der Gefäße [116] Das Ergebnis sind u.a. eine über cGMP-abhängige Proteinkinasen gesteuerte Vasodilatation [27], Hemmung der Thrombozytenaggregation und Leukozytenmigration [25]. Während NO in niedrigen Konzentrationen überwiegend als Signalstoff fungiert, wird es in hohen Konzentrationen zu einem Effektormolekül des Immunsystems mit einer wichtigen Rolle bei Infektabwehr und Autoimmunität. Diese zytostatischen und auch zytotoxischen Wirkungen des Stickoxid wird durch Reaktion mit Superanionen der Bildung des starken Oxidants Peroxynitrit zugewiesen [25;28]. Peroxynitrit und NO hemmen u.a. Schlüsselenzyme der Atmungskette und führen zur DNA-Fragmentation und zur Apoptosis [25;29].

1.2.4.3 Die NO-Synthasen: NOS I (neuronale NO-Synthase), NOS II (induzierbare NO-Synthase) und NOS III (endotheliale NO-Synthase)

Bislang sind von den NO-Synthasen sind drei Isoformen bekannt, die zelltypspezifisch exprimiert und unterschiedlich reguliert werden. Es wird in konstitutive (eNOS, nNOS) und induzierbare (iNOS) unterteilt. Die endotheliale NOS (eNOS, Typ III) und die neuronale NOS (nNOS, Typ I) sind kalziumabhängig und werden konstitutiv exprimiert. Sie sind Calmodulin-abhängig und unterliegen damit dem intrazellulären Ca-++-Stoffwechsel [117;115]. Ein weiterer Unterschied zwischen den NOS-Unterformen ist darin zu sehen, dass die konstitutiven NOS in der Lage sind, NO in einem zeitlich begrenzten Rahmen von mehreren Minuten NO in niedrigen Konzentrationen zu synthetisieren [118;38], während die induzierbare iNOS grössere Mengen an NO im Bereich von Stunden und Tagen [66;38] zusammensetzt.

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Das von der neuronalen Synthase nNOS produzierte NO übernimmt eine wichtige Funktion bei Gedächtnisleistungen im Hippocampus und für das Sexualverhalten [30]. Diese Synthase wird vorwiegend konstitutiv exprimiert und über den intrazellulären Calciumhaushalt reguliert. In der Niere wird nNOS vornehmlich in der Makula densa exprimiert und ist an der Regulation des tubulointerstitiellen Feedbacks und der Renin-Produktion beteiligt [25].

Die induzierbare NOS (iNOS, Typ II) setzt dagegen nur nach Stimulation, z. B. durch Zytokine, NO frei. Nach Stimulation produziert die iNOS große Mengen NO. Die induzierbare NO-Synthase iNOS wurde zunächst in Makrophagen entdeckt [67]. Bei experimenteller und auch humaner Nephritis wurde die Expression der NOS II auch in Mesangialzellen und Tubuluszellen beschrieben [31;32;33;36;25]. Das von der iNOS in hohen Konzentrationen bereitgestellte NO ist ein wichtiger Effektor in der unspezifischen Immunabwehr [25;34]. Stimuli für die Expression der iNOS sind proinflammatorische Mediatoren wie Lipopolysaccharide, Tumor-Nekrose-Faktor-alpha, Interleukin–1 und gamma-Interferon. Die iNOS produziert NO über längere Zeiträume und Ihre Aktivität ist abhängig vom extrazellulären L-Arginin-Angebot [35;116]

Die endotheliale NO-Synthase (NOS III, eNOS) findet sich im Gefäßbett. Das von ihr gebildete NO ist ein potenter Vasodilatator [19;27;25;41]. In der Niere beteiligt sich die eNOS an der Zunahme des effektiven renalen Plasmaflusses und an der glomerulären Filtrationsrate. Hieraus resultiert eine Senkung des glomerulären Filtrationsdrucks. Neben diesen Regulations-Mechanismen der renalen Hämodynamik gibt es Hinweise darauf, dass die endotheliale NOS auch eine wichtige Rolle in den antifibrotischen und antiproliferativen Wirkungen des NO spielt. In Kulturen renaler Mesangialzellen konnte gezeigt werden, dass NO die Synthese von Matrixproteinen dosis- und zeitabhängig limitiert [43;44]. Weitere Forschungsarbeiten konnten die proliferationshemmenden Wirkungen des Stickoxid in-vitro belegen [46;47] Diese antifibrotischen Wirkungen sind wahrscheinlich als Folge einer NO-vermittelten Abnahme der Expression des profibrotischen Zytokins TGF-ß zu sehen [45]. Zentrale Kennzeichen chronischer Nierenerkrankungen sind die Zellproliferation sowie die gesteigerte Synthese von Matrixproteinen, so dass die günstigen Wirkungen einer L-Arginingabe über diese endotheliale NOS und der daraus folgenden NO-Generierung vermittelt sein könnten. Diese Hypothese diente der zugrundeliegenden Arbeit als Ausgangspunkt.

1.3  Modell der– Anti-Thy-1-Glomerulonephritis der Ratte

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Das Modell der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis der Ratte diente als etabliertes Modell einer akuten mesangioproliferativen Glomerulonephritis [50]. Induziert wird diese Form der Glomerulonephritis durch eine intravenöse Injektion von Antikörpern, die gegen das Thy-1-Epitop von Mesangialzellen gerichtet sind. Diese führen zu einer dosis- und komplementabhängigen Lyse der Mesangialzellen. Andere Nierenzellen sind sekundär nicht betroffen, da in der Rattenniere nur dort das Thy-1-Epitop an der Zelloberfläche exprimiert ist. Die sich anschließende glomeruläre Reaktion gleicht dem Bild einer akuten mesangioproliferativen Glomerulonephritis mit Akkumulation von mesangialer Matrix und Hyperzellularität [51;52;53]. Im Rahmen dieser Erkrankung lassen sich folgende drei Phasen unterscheiden [10]:

Die zeitliche Staffelung der Wundheilung macht es möglich, die einzelnen Phasen der Wundheilung spezifisch zu untersuchen. Die Blutdruckunabhängigkeit ist ein Vorteil dieses Modells. Die glomeruläre Schädigung ist immunvermittelt und während der Schädigungs- und Matrixexpansionsphase besteht kein erhöhter systemischer Blutdruck, so dass das Ausmaß der glomerulären Matrixvermehrung im wesentlichen der Antikörper-induzierten Mesangialzellschädigung zugeschrieben wird.

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Dadurch ist dieses Modell besonders geeignet, blutdruckunabhägige Wirkungen auf die glomeruläre Matrixakkumulation zu untersuchen.

1.4 Fragestellung

Ziel der Arbeit war es, die nephroprotektiven Wirkungen der Aminosäure L-Arginin für die chronisch progressive Matrixexpansion bei immun-vermittelter Glomerulonephritis im Hinblick auf ihren NO-Stoffwechsel weiter zu untersuchen. Es wurde die Arbeitshypotheseüberprüft, ob die günstigen Wirkungen von L-Arginin auf die Überexpression des Zytokins TGF-ß in der normotensiven Anti-Thy-1-Glomerulonephritis der Ratte durch endogen produziertes NO vermittelt werden. Für diese Studie wurden folgende Versuchsansätze durchgeführt:

  1. Therapie der Tiere mit einer diätetischen L-Arginin-Gabe
  2. Therapie der Tiere mit dem NO-Donator Molsidomin
  3. Therapie der Tiere mit einer diätetischen L-Arginin-Gabe und zusätzlich einer niedrig dosierten Gabe des NO-Synthase-Inhibitors L-Nitro-Arginine-Methyl–Esther (L-NAME).

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Die Behandlungen begann jeweils 24 Stunden nach Induktion der Glomerulonephritis und wurde sieben Tage (Protokoll 1) bzw. zwölf Tage (Protokoll 2), bis zur Tötung der Tiere, fortgeführt.

Nach Tötung der Tiere wurden histologische und molekulare Fibrosemarker analysiert. Hierzu wurde die glomeruläre Matrixakkumulation histologisch ausgewertet und die Expression von TGF-β als zentralem Fibrosemediator, Fibronektin als Marker für die Matixproduktion und PAI-1 als Marker für die Matrixdegeneration bestimmt. Darüber hinaus erfolgte die Analyse der NO-Konzentration im Plasma und Urin-Spiegel als Zeichen der endogenen NO-Produktion. Desweiteren wurde der systemische Blutdruck und die Proteinurie der Tiere bestimmt [35;54;55].


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04.10.2006