Material und Methoden

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2.1  Materialien

Alle verwendeten Materialien, Chemikalien, und Zellkulturmedien wurden, wenn nicht anders beschrieben, von der Firma Sigma (Taufkirchen, Deutschland) bezogen.

2.2 Tierversuch

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Die Tierversuche und die damit verbundenen Experimente wurden von der Senatsverwaltung für Gesundheit und Soziales des Landes Berlin geprüft und genehmigt (Tierversuchsnummer G 0068/00). Alle Eingriffe an lebenden Tieren wurden unter Beachtung des § 9 Abs. 1 und 2 des Tierschutzgesetzes durchgeführt. Die Doktorandin arbeitete unter Aufsicht des Betreuers PD Dr. med. Harm Peters, qualifiziert für Eingriffe an lebenden Tieren gemäß dem § 9 Abs. 1 des Tierschutzgesetzes [56]. Die anfallenden toten Tiere und Tierkörperteile wurden gemäß § 8 Abs. 1 und 2 des Tierkörperbeseitigungsgesetzes vorschriftsmäßig entsorgt [57].

2.2.1  Tiere und Tierhaltung

Für die Tierversuche wurden 104 männliche Wistar Ratten der Firma „Charles River, Sulzfeld, Deutschland“ mit einem Gewicht von 200 bis 270 g verwendet. Die Haltung der Tiere erfolgte zu zweit in einem Käfig bei einem 12 Stunden Tag-/Nachtrhythmus in einem vollklimatisierten Raum. Futter- und Trinkmenge wurden täglich kontrolliert.

2.2.2 Die Anti-Thy-1-Glomerulonephritis – Herstellung des Antikörpers OX-7

Die Zellen der OX-7-Zellinie (Hybridoma Zellen der Firma Center of Applied Microbiology & Research, Saisbury UK) wurden bei –70°C gelagert und zum Ansatz einer Zellkultur zügig unter fließend warmen Wasser aufgetaut. Für die Erstkultivierung wurde zuvor folgendes Kulturmedium vorbereitet: RPMI 1640, 20 % fetales Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin. Das Kulturmedium wurde dann den Zellen zunächst tröpfchenweise zugegeben und auf 20 ml aufgefüllt. Der Ansatz wurde für 3 min bei 2500 U/min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 15 ml Kulturmedium resuspendiert. Dieser Ansatz wurde dann in eine Kulturflasche überführt und bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Jeden zweiten Tag erfolgte eine mikroskopische Kontrolle mit Differenzierung von vitalen und abgestorbenen Zellen mittels einer Vitalfärbung mit Tryptan Blue. Ebenfalls erfolgte eine regelmäßige pH-Wert-Kontrolle. Die Zellen wurden alle zwei Tage passagiert und derartig vermehrt und separiert, dass nach einem Zeitraum von 14 Tagen 16 große Kulturflaschen (100 ml) vorlagen. Der Inhalt dieser Flaschen wurde dann in ein miniPERM-Zellkulturgefäße (Heraeus-instruments, Hanau, Deutschland) überführt. Das Inseminationsvolumen lag bei 35 ml Zellsuspension mit einer Dichte von ca. 0,5 x 106 Zellen. Zur Optimierung der Antikörperproduktion wurde nach gutem Wachstum der Inhalt des ersten Kulturmoduls auf 4 Kulturmodule aufgeteilt, wobei die Dichte zu diesem Zeitpunkt im ersten Modul 8 x 106 Zellen/ml betrug. Das sich im Versorgungsmodul der Einrichtung befindliche Medium wurde wie oben erwähnt zubereitet, zusätzlich aber noch mit 1,5 ml HEPES-Puffer supplementiert. Zur Gewährleistung einer optimalen Sauerstoffversorgung wurden die 4 Module auf Drehvorrichtungen gelegt, die sich im Brutschrank befanden. Der Mediumwechsel erfolgte während guter Wachstumsphasen der Zellen täglich. Das Abernten aus dem Versorgungsmodul erfolgte bei einer Zellzahl von 11,5 x 106 Zellen/ml, wobei jeweils 17 ml aus dem Versorgungsmodul entnommen wurden. Das Volumen wurde mit Kulturmedium wieder aufgefüllt. Das erhaltene Gesamtvolumen an OX-7-haltigem Kulturüberstand betrug 327 ml.

2.2.3 Aufreinigung des Kulturüberstandes

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Zur Trennung der Immunglobuline von Fremdeiweißen wurde der Zellkulturüberstand über eine HiTrap-Protein G-Säule (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) geleitet. Hierbei wurden ein 20mM Sodiumphophat Binding Puffer (pH 7,0), ein 0,1M Glycine-HCl Elution Puffer (pH 2,7) und eine 1M Tris-HCl-Lösung (pH 9,0) zur Probenrekonstitution verwendet. Der Kulturüberstand wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min über die Säule geleitet. Am Ende konnten 130 ml Lösung mit einer Immunglobulinkonzentration von 1 mg/ml gewonnen werden. Das Eluat wurde anschließend 24h in PBS dialysiert (Slide-A-Lyzer, Pierce, Rockford, USA), aliquotiert und bei –70°C eingefroren.

2.2.4 Induktion der Glomerulonephritis

Die Tiere erhielten eine i.v.-Injektion des Antikörpers OX-7, diese führt wie in der Einleitung beschrieben zur Auslösung einer Anti-Thy-1-Glomerulonephritis. Jedes Tier erhielt 0,5 mg/kg Körpergewicht in PBS gelösten OX-7. Zur Injektion wurden die Tiere in eine leichte Äther-Narkose versetzt. Nach Desinfektion des Schwanzes wurde den Tieren mit einer 1-ml Spritze die entsprechende Menge des Antikörpergemisches in eine Schwanzvene injiziert. Die Kontrolltiere erhielten eine Injektion des gleichen Volumen PBS.

2.3 Futter

Zur Fütterung der Tiere wurde die Zuchtdiät für Ratten der Firma Altromin Nr. 1311 (Lage, Deutschland) verwandt. Der Caseinanteil betrug 22,5 %. der Eigenanteil von L-Arginin betrug in dieser Futterzusammensetzung 0,87%. Die weitere Zusammensetzung des Futtermehls ist in Abb. 2 dargestellt.

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Tab. 1: Zusammensetzung der Zuchtdiät 1311 für Ratten der Firma Altromin, Lage

Inhaltsstoffe

Gehalt in %

Zusatzstoffe

Gehalt

Rohprotein

22,50%

Vitamin A

15000 IE

Lysin

1,20%

Vitamin D3

600 IE

Rohfett

5%

Vitamin E

75 mg

Rohfaser

4,50%

Kupfer

5 mg

Rohasche

6,50%

 

Calcium

0,90%

 

Phosphor

0,70%

 

 

2.3.1  Wirkstoffe

2.3.1.1 L-Arginin

L-Arginin wurde in Pulverform verwendet und die Aminosäure wurde nach Dosisberechnung (500 mg/die auf 25 mg Futter pro Tier) dem Futter beigemengt. Diese Menge ist vergleichbar mit einer L-Arginin-Donation von 1% im Trinkwasser, einem Zufuhrweg, der am häufigsten in der Literatur verwendet wird. In dieser Arbeit wurde sich für die Futterzufuhr entschieden, da in sich in Vorexperimenten feststellen ließ, dass die Futteraufnahme insgesamt konstanter zwischen die Versuchstieren ist als die Aufnahme über das Trinkwasser.

2.3.1.2 Molsidomin

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In dieser Versuchsreihe wurde der NO-Donor Molsidomin verabreicht. Molsidomin ist ein Nitrat-ähnlicher Stoff und zählt pharmakologisch zu den Sydnomininen (zuerst in Sydney synthetisiert). Die mesoionische Verbindung Molsidomin wird in der Leber enzymatisch in 3-Morpholinosydnonimin (SIN-1) umgewandelt. SIN-1 geht in wäßriger Lösung unter Ringöffnung in N-Morpholino-N-nitrosoaminoacetonitril (SIN-1A) über, das wie Nitroprussid-Natrium und im Gegensatz zu organischen Nitraten NO unter Sauerstoffbeteiligung spontan freisetzt [58]. Es kommt über die Aktivierung der löslichen Guanylylcyclaseylcyclase zu einem Anstieg des cyclischen Guanosinmonophosphat (cGMP) in den Endothelzellen und einer nachfolgenden Gefäßmuskelrelaxation und Vasodilatation. Die Bioverfügbarkeit dieses NO-Donors beträgt 100%, der first-pass-Effekt 50-60% und die Eliminationshalbwertszeit 1,5 h. Molsidomin wird als venöser Vasodilatator - mit höherer Senkung der kardialen Vorlast als der Nachlast - bei chronischer Herzinsuffizienz, Therapie der koronaren Herzkrankheit und Angina pectoris – Zuständen eingesetzt. Eine Toleranzentwicklung entsteht im Gegensatz zu Nitraten nicht. Für die Versuchsreihen mit der NO-Donation wurden Corvaton Tabletten ® (Wirkstoff: Molsidomin) der Firma Höchst, Deutschland, verwendet.

2.3.1.3 N-ω-Nitro-L-Arginin-Methyl-Ester (L-NAME)

L-NAME ist ein kompetitiver Antagonist des L-Arginin. Es hemmt unspezifisch alle drei NO-Synthasen [51;59] und somit die endogene NO-Produktion aus L-Arginin. Einen ausreichend spezifischen Inhibitor für die endotheliale NO-Synthase ist bis dato noch nicht gefunden worden. L-NAME wurde in einer Dosis verabreicht, die, wie zuvor publiziert, den systolischen Blutdruck nicht beeinflusst.

Hierzu sollte noch angemerkt werden, dass die Dosis des NO-Inhibitors in der oben genannten Studie höher lag, als die verwendete Dosis in der vorliegenden Arbeit. In einer anderen Studie wurde eine dosisabhängige Reduktion des cGMP-Spiegels, dem distalen Mediator des NO, nachgewiesen [104].

2.3.2 Wirkstoffzubereitung

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Die Tabletten mit dem Wirkstoff Molsidomin wurden zerkleinert und gemahlen. Anschließend wurde in das trockene Futtermehl je nach Therapiegruppe die entsprechende Menge des Wirkstoffs gegeben und ca. 5 min mit einem elektrischen Handrührgerät vermengt. Anschließend wurde unter weiterem Rühren Wasser, ca. 500 ml/kg Mehl, hinzugefügt. Wenn das Mehl gleichmäßig durchfeuchtet war, wurde es ca. 3 min per Hand durchgeknetet und anschießend dünn aufgewalzt. Aus der ca. 1 cm dicken Teigplatte wurden mit Hilfe von Backformen Plätzchen ausgestochen und auf einem Gitter zum Trocknen ausgelegt. Zur Beschleunigung der Trocknung wurden die Gitter in einen gleichmäßigen Luftstrom gebracht. Der Luftstrom wurde durch einen Ventilator erzeugt. Die austretende Luft hatte eine Temperatur von ca. 40°C.

L-NAME ist chemisch instabil und wurde deshalb dem Trinkwasser täglich neu in entsprechender Dosis beigemengt. Molsidomin ist chemisch instabil unter längerem Einfluss künstlichen Lichts [76]. Aus diesem Grund wurde das Futter mit diesem NO-Donor im Dunkeln getrocknet und bei der Fütterung der Tiere eine Abdeckung verwendet.

Tab. 2: täglich verabreichte Dosis der Wirkstoffe L-Arginin, Molsdomin und L-NAME in mg

Wirkstoff

Dosis/die

L-Arginin

500 mg

Molsidomin

10 mg

L-NAME

75 mg

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Der Futterverbrauch und die Trinkwassermenge der Tiere wurde in Vorversuchen ermittelt. Die dem Futterteig beigemengten Wirkstoffe basieren auf einem täglichen Futterverbrauch von 25 g pro Tier. Für die Trinkwassermenge wurde im Vorfeld ein durchschnittlicher Verbrauch von 30 ml/Tier pro Tag ermittelt. Diese Wirkstoffdosen wurden auf der Basis vorausgegangener Experimente von Nierenerkrankungen im Tiermodell der Ratte verwendet [62;63;64].

2.4 Studienprotokolle

Es wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Versuchsprotokolle erstellt, die sich lediglich in dem Versuchszeitraum unterscheiden.

2.4.1  Protokoll 1 – Effekte der Behandlung mit L-Arginin, Molsidomin und L-Arginin + L-NAME sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis

Die Behandlung der Tiere mit L-Arginin, Molsidomin und L-Arginin + L-NAME wurde 24h nach Injektion des Anti-Thy-1-Antikörpers - wenn die Mesangialzell-Lyse abgeschlossen ist und eine fibrotische Gewebeantwort anfängt [65] - begonnen. In diesem ersten Studienprotokoll wurden die Tiere sieben Tage nach Induktion der Glomerulonephritis getötet. Nach diesem Zeitraum erreicht die Matrixakkumulation ihren Höhepunkt und mögliche Effekte einer Behandlung können hier am besten betrachtet werden.

2.4.2 Protokoll 2 – Effekte der Behandlung mit L-Arginin, Molsidomin und L-Arginin + L-NAME zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis

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Dieses zweite Versuchsprotokoll orientiert sich an Protokoll 1. Auch hier wurde 24h nach Antikörperinjektion die Therapie begonnen. In diesem ersten Studienprotokoll wurden die Tiere zwölf Tage nach Induktion der Glomerulonephritis getötet. Nach ungefähr zwölf Tagen dieser Glomerulonephritis-Form ist die geschädigte Niere mit Matrixakkumulation und Matrixexpansion als Gewebsantwort auf den Verletzungsstimulus über das Maximum hinaus. Im Anschluss daran beginnt die Ausheilungsphase. Diese zweite Versuchsreihe zum Zeitpunkt der letzten profibrotischen Phase der Gewebsantwort wurde gewählt, um eine „second line of evidence“ zu zeigen und um die Ergebnisse der ersten Versuchsreihe zu bestätigen.

Die Aufteilung der Tiere in die vier verschiedenen Therapiegruppen ist in der folgenden Tabelle ersichtlich. Diese Aufteilung ist für beide Studienprotokolle identisch.

Tab. 3: Protokoll 1/Protokoll 2; Aufteilung der Tiere in die verschieden Therapiegruppen

Normale Kontrolltiere

gesunde Kontrolltiere, Injektion mit PBS (n=4)

GN

Tiere mit Anti-Thy-1-Glomerulonephritis, keine Therapie (n=12)

GN-+L-Arg

Tiere mit Anti-Thy-1-Glomerulonephritis mit 500 mg L-Arginin/die (n=12)

GN+Molsi

Tiere mit Anti-Thy-1-Glomerulonephritis mit 10 mg Molsidomin/die (n=12)

GN+Arg-NAME

Tiere mit Anti-Thy-1-Glomerulonephritis mit 500 mg L-Arginin/die + 75 mg L-NAME (n=12)

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2.5 Versuchsparameter

2.5.1  Messung des systolischen Blutdrucks

Einen Tag vor der Tötung bzw. dem Ende eines Versuches wurden bei den Tieren der systolische Blutdruck gemessen. Die Messung erfolgte mit einem Gerät der Firma Life Science Instruments (Woddland Hills/ California, USA). Der Blutdruck wurde mit einem aufblasbaren Sensor erfasst, der über den Schwanz der Ratte bis ca. 1 cm vor die Schwanzwurzel geschoben wurde. Da der Blutdrucksensor sehr empfindlich für Erschütterung war, wurden die Tiere während der Messung mit einer leichten Äthernarkose betäubt, ausserdem konnte so gewährleistet werden, dass die Tiere nicht durch Stress bedingt falsch hohe Werte aufwiesen. Einige Minuten vor und während der Messung lagen die Ratten auf einem Heizkissen (Stufe 2), um die Schwanzgefäße, an denen die Messung erfolgte, maximal zu weiten. Es wurden jeweils drei Drücke gemessen und der Mittelwert ermittelt.

2.5.2 Urinsammlung

An dem Tag vor der Nierenentnahme wurden die Tiere in metabolischen Käfigen (Metabolic Cage–3701M081 der Firma Tecniplast, Buguggiate, Italien) gehalten. Diese Käfige wurden eingesetzt, um den Urin getrennt von den restlichen Exkrementen aufzufangen. Über einen speziellen Trichter wird der Urin separat gesammelt. Futterreste und Kot fallen in ein weiteres Behältnis. Um eine Kontamination des Urins mit Bakterien zu verhindern, wurden dem Urinauffanggefäß 100 µl Penicillin/Streptomycin (10000 U/ml, 10.000 µg/ml) hinzugefügt. Nach 24 Stunden wurden die Tiere in ihre alten Käfige zurückgesetzt, die Urinmengen sowie der Trinkwasser- und Futterverbrauch wurden notiert. Der Urin wurde mit 5000 U/min für fünf Minuten zentrifugiert und der Überstand bei –20°C für die folgenden Messungen eingefroren.

2.5.3  Entnahme der Nieren

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Zur Nierenentnahme und zur Gewinnung von Serum wurde wie folgt vorgegangen: Die Tiere wurden mit einer Äthernarkose betäubt. Die Bauchdecke der Tiere wurde mit Alkohol desinfiziert. Anschließend erfolgte mittels einer Schere die Eröffnung der Bauchhöhle durch einen U-förmigen Schnitt, beginnend einen Zentimeter über dem Penis und an beiden Rippenbögen endend. Durch Verdrängung des Darms am Mesenterium nach rechts und Eröffnung des dorsalen Peritoneums mittels zweier Pinzetten wurde die Bauchaorta präpariert und mit einer 27-Gauge-Butterfly-Kanüle punktiert. Mit einer 10 ml Spritze wurde soviel Blut entnommen, bis der Herzstillstand eintrat. Über die in der Aorta verbliebene Kanüle wurde nun solange eiskaltes PBS mit einer 20 ml Spritze injiziert (ca. 5-7 ml), bis es wieder zu einer Herzaktion kam. Anschließend wurden die Vena cava inferior und die Aorta abdominalis in Höhe der Leberunterseite oberhalb des Abgangs der Nierengefäße mit einer Klemme unterbunden, um ein Zurückfließen von Blut aus der oberen Körperhälfte zu verhindern. Anschließend wurde die Vena cava abdominalis mit einer Schere eröffnet, um ein Abfließen des infundierten PBS zu ermöglichen. Mit den restlichen in der Spritze verbliebenden 15 bis 20 ml PBS und einer weiteren 20 ml Spritze PBS wurden die Nieren dann perfundiert. Nachdem die Nieren blutleer waren, wurden sie durch einen Schnitt von den Gefäßen und dem Ureter getrennt und in ein 50 ml Röhrchen mit 4°C kaltem PBS gegeben. Bis zur weiteren Aufarbeitung wurden die Nieren auf Eis gelagert. Das entnommene Blut wurde bei 3000 U/min für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Zur Durchführung weiterer Messungen wurde das Serum abpipettiert und bei –20°C eingefroren.

2.5.4 Aufarbeitung der Nieren, Isolation der Glomeruli für die Zellkultur

Von den Nieren wurden die Kapsel und das anhängende Fett entfernt und ein Fünftel der Niere zur histologischen Aufarbeitung in Formalin (10 %, neutral gepuffert) gegeben. Der Rest der Nieren wurde mit einer Klinge längs halbiert und das Nierenmark mit einer kleinen Schere herausgeschnitten. Aus den so gewonnenen vier Nierenhälften wurden durch ein Siebverfahren die Glomeruli isoliert. Dazu wurden die Nierenhälften auf einer Glasplatte, welche auf Eis, lag mit Hilfe einer Klinge zerkleinert. Der so entstandene Gewebebrei wurde auf ein Metallsieb (Maschengröße 160 µm) übertragen und unter Zuhilfenahme eines Glasspatels durch die Maschen des Siebes gepresst. Während des Durchpressens des Nierengewebes wurden die mit Gewebe gefüllten Poren des Siebes immer wieder mit PBS freigespült. Das sich auf dem nächsten Sieb (Maschengröße 125 µm) sammelnde Gewebe wurde mit einem kräftigen Strahl PBS aus einer Spritzflasche (250 ml der Firma Nalgene) zusammengetrieben und ca. 2 min kräftig durchgespült. Das auf dem anschließenden Sieb, Maschenweite 90 µm, aufgefangene Gewebe wurde mit Hilfe der Spritzflasche auf das nächste Sieb mit einer Maschenweite von 71 µm übertragen und mit ca. 300 ml PBS indirekt gespült, um die Glomeruli von den kleinen Gewebstrümmern zu reinigen. Die so gewonnenen Glomeruli wurden in ein steriles 50 ml Röhrchen der Firma Nunc übertragen und für 10 min bei 15000 U/min bei 4°C zentrifugiert. Die Siebe, die Glasspatel, die Glasplatten, die Klingen, die Scheren und Pinzetten wurden vor der Benutzung bei 120°C für 90 Minuten sterilisiert. Das PBS wurde vor der Verwendung autoklaviert, ebenso wie die Spritzflaschen und die Becher, auf denen die Siebe während der Isolation der Glomeruli ruhten. Die Siebe, Glasspatel , Glasplatten, Klingen, Scheren, Pinzetten und das PBS wurden nach der Sterilisation vor der Benutzung auf eine Temperatur von 4°C gekühlt.

2.5.5 Zellkultur

Nach dem Zentrifugieren wurden der Überstand verworfen und die Glomeruli in 5 ml Zellkulturmedium resuspendiert. Als Zellkulturmedium wurde DMEM (Dubecco´s modified Eagle Medium) unter Zusatz von 0,1 U/ml Insulin, 100 U/ml Penicillin, 100µg/ml Streptomycin und 25 mM HEPES-Puffer verwendet. Durch Auszählung von 10 µl der resuspendierten Glomeruli unter dem Mikroskop wurde die Anzahl der Glomeruli bestimmt, welche durch das Sieben von jedem Tier gewonnen wurde. Nach dreimaliger Wiederhohlung der Auszählung wurde der Mittelwert gebildet und die Konzentration der Glomeruli für jedes Tier auf den gleichen Wert (ca. 2000 Glomeruli/ml) durch Zugabe von entsprechenden Mengen Medium eingestellt. Von jedem Tier wurden 3 Kulturen von je 1 ml in einer 24-Loch-Zellkulturplatte angelegt und in einem Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Nach 24 und 48 Stunden wurden die Zellkulturüberstände auf Bakterien- und Pilzwachstum überprüft. Nach 48 Stunden wurden sie abgeerntet und nach Zentrifugation mit 5000 U/min für 5 Minuten bei 4°C nochmals abpipettiert und bei –20°C bis zu weiteren Messungen eingefroren.

2.6 Messung der Krankheitsparameter

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Zur Abschätzung der Effektivität der unterschiedlichen Therapien wurde neben dem morphologischen Parameter der Histologie und dem funktionellen Parameter der Proteinurie ebenfalls eine Zellkultur von den Glomeruli der Versuchstiere anlegt. Im Überstand der Zellkultur wurden TGF-β, Fibronektin und PAI-1 bestimmt, da die Expression dieser Proteine mit dem Ausmaß des Krankheitsgeschehens korreliert. Zur quantitativen Bestimmung von TGF-β, Fibronektin und PAI-1 konnte die ELISA-Technik genutzt werden. Die messenger-RNA-Expression dieser Fibroseparameter wurde mit einer RT-Polymerase-Kette-Reaktion (RT-PCR) analysiert. Als Indikatoren für die endogene NO-Synthese wurden Nitrat/Nitrit-Messungen mittels Griess-Reaktion bestimmt. Um die Effekte einer direkten NO-Donation auf glomeruläre Zellen in vitro zu untersuchen, wurde der NO-Donor Diethylenetriamin (DETA) (NONOate) auf gewonnene Glomeruli gegeben und im Überstand die TGF-ß-Produktion mittels ELISA bestimmt. Die histologische Auswertung erfolgte nach einer HE- und PAS-Färbung mikroskopisch mit Hilfe eines Scores-Systems.

2.6.1  Histologie

2.6.1.1 Einbettung und Anfertigung der histologischen Schnitte

Das bei der Nierenentnahme gewonnene Gewebestück wurde bis zur Weiterverarbeitung in Formalin belassen. Innerhalb von 12 Stunden wurden die so konservierten Gewebestücke weiterverarbeitet. In einem Einbettautomaten erfolgte zunächst die Auswaschung des Fixiermediums, dann über ein Zwischenmedium die Durchtränkung des Gewebes mit Paraffin. Das so vorbereitete Gewebe wurde mit Hilfe von Metallwännchen in kleine Paraffinblöcke gegossen, welche mit den beschrifteten Deckeln der Histokinette abgedeckt wurden. Nach Aushärten der Blöcke auf einer Kühlplatte wurden mit dem Schlittenmikrotom HN 40 der Firma Reichert-Jung 3 µm dicke Paraffinschnitte angefertigt. Diese wurden in einem Wasserbad (25°C) aufgefangen, anschließend auf Objektträger übertragen und in einem warmen Wasserbad (46°C) gestreckt. Zur Trocknung wurden die Objektträger für 24 Stunden bei 37°C in einem Wärmeschrank gelagert.

2.6.1.2 Histologische Färbungen

Es wurde eine Färbung mit Perjodsäure-Schiff-Reagenz (PAS) und eine immunhistochemische Anfärbung des Fibrosemarkers TGF-ß1 durchgeführt.

2.6.1.2.1 PAS-Färbung

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Bei der PAS-Färbung kommt es zu einer deutlichen Anfärbung der extrazellulären Matrix, was eine quantitative Einschätzung ermöglicht. Die HE-Färbung diente zur Kontrolle der in der PAS-Färbung gesehenen Strukturen. Da die Farbstoffe nur wasserlöslich waren, mussten die Gewebeschnitte zum Färben vom Paraffin befreit werden. Dazu wurden die Objektträger zunächst zwei mal 5 Minuten in Xylol 100% gebracht und anschließend jeweils kurz durch eine absteigende Alkoholreihe (Ethanol 96%, 96%, 80%, 50%, Aqua dest. und Aqua dest.) gezogen. Die so entparaffinierten Schnitte wurden nun für 10 Minuten in 1%ige Perjodsäure gestellt und anschließend 5 Minuten in Leitungswasser gespült. Dann wurden die Schnitte, nachdem sie kurz in Schwefelwasser getaucht wurden, für 20 Minuten in Schiff-Reagenz gestellt und abermals kurz in Schwefelwasser getaucht. Nach 10 Minuten Spülen mit Leitungswasser erfolgte für 10 Minuten die Gegenfärbung mit Hämalaun und anschließend erneutes Spülen in Leitungswasser für 10 Minuten. Die so gefärbten Schnitte wurden durch eine aufsteigende Alkoholreihe (Aqua dest., Aqua dest, 50% Ethanol, 80%, 96%, 96%, 100%, 100% und 100%) wieder entwässert. Vor der Eindeckung mit Corbit-Balsam wurden die Schnitte drei mal kurz in Xylol 100% getaucht.

2.6.1.2.2 Immunhistochemische Färbung des Zytokins TGF-ß1

Für das Versuchsprotokoll 1, sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis wurde eine Färbung des Zytokins TGF-ß angefertigt. Zur immunhistologischen Darstellung von TGF-ß1 wurde eine modifizierte APAAP (Alkalische Phosphatase Anti Alkalische Phosphatase)-Färbung verwendet. Hierzu wurde zur Detektion des gebundenen Primärantikörpers ein mit einem Polymer konjugierter Sekundärantikörper benutzt, an welches das für die sichtbare Farbreaktion notwendige Enzym Alkalische Phosphatase mehrfach gekoppelt wurde. Auf diese Weise kann eine Verstärkung des Farbsignales erzielt werden und Antigene, die nur schwach ausgeprägt sind, deutlicher dargestellt werden. Vor der Färbung musste ein TBS (Tris Buffered Saline)-Puffer hergestellt werden. Dazu wurde zunächst eine Stammlösung bestehend aus zwei Komponenten angesetzt: Stammlösung A: Herstellung einer 0,5 M Tris-Lösung, bestehend aus 60,55 g Tris-Base/ 1 l a.dem.. Stammlösung B: Herstellung einer 1,5 M NaCl-Lösung, bestehend aus 87,66 g NaCl/ 1 l a.dem.. Die Stammlösungen wurden bei 4°C aufbewahrt, vor Gebrauch im Verhältnis 1+1+8 Teile a.dem. angesetzt und mittels 5 M HCl-Lösung auf pH 7,6 eingestellt. Die immunhistologische TGF-ß1-Färbung wurde am Paraffinschnitt in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur durchgeführt. Es erfolgte zunächst die Entparaffinisierung, das Einbringen der Schnitte in die absteigende Alkoholreihe und Kochen in Zitratpuffer wie oben beschrieben. Dann wurden die Gewebestückchen auf den Objektträgern mit einem Fettstift (DAKO Pen™, DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland) umkreist und in TBS-Puffer eingestellt. Anschließend wurden die Schnitte für 30 min mit inaktiviertem fetalem Kälberserum (Biochrom AG, Berlin, Deutschland) (30 min bei 65°C) inkubiert. Es folgte eine 30 minütige Inkubation mit einem polyklonalen Primärantikörper Rabbit-anti-Rat-TGF-ß1 (SantaCruz, Biotechnology, Inc. Heidelberg, Deutschland). Der Antikörper wurde zuvor im Verhältnis 1:25 mit einem Antikörperverdünnungsmedium (1Teil inaktiviertes fetales Kälberserum, 1 Teil RPMI-Medium, 8 Teile a.dest.) verdünnt. Auf den Objektträgern befanden sich drei Schnitte. Ein Schnitt diente jeweils als Negativ-Kontrolle und wurde anstelle des Primärantikörpers mit Antikörperverdünnungsmedium inkubiert. Nach der Inkubation wurde mit TBS-Puffer gespült. Es folgte eine 30 minütige Inkubation mit dem Sekundärantikörper Goat-anti-Rabbit EnVision™ Alkalische Phosphatase (DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland). Dann wurde erneut mit TBS-Puffer gespült und die Schnitte mit dem Substrat-Chromogen Fast Red (Fast Red Kit, DAKO Cytomation, Hamburg, Deutschland) versetzt. Das Substrat wurde nach Angaben des Herstellers angesetzt. Die Intensität der Färbung wurde mikroskopisch kontrolliert. Die Färbedauer betrug 5 min bis zur Entwicklung eines intensiv roten Farbsignals. Die Färbung wurde durch Spülen mit aqua dem. gestoppt. Die Kernfärbung erfolgte in Mayers Hämatoxillin für eine Dauer von 10 min. Abschließend wurden die Schnitte für 10 min unter fließendem Leitungswasser gebläut und in einem wässrigen Eindeckmedium (ImmuMount™, Shandon,Pittsburgh, USA) luftblasenfrei eingedeckt.

2.6.1.3 Histologische Auswertung

Die mikroskopischen Auswertungen wurden mit einem Lichtmikroskop in einem verblindeten Modus durchgeführt, wie er in anderen Arbeiten bereits publiziert wurde [65]. Dazu wurden jeweils 25 Glomeruli pro Schnitt untersucht. Der prozentuale Anteil der Bereiche des Glomerulus, die von Matrix eingenommen waren wurde von 0-100% bewertet. Von allen pro Schnitt bewerteten Glomeruli wurde anschließend der Mittelwert gebildet. Die Auswertung erfolgte durch einen unabhängigen Untersucher, der über die Gruppenzugehörigkeit nicht informiert war.

2.6.2 ELISA – Enzym Linked Immuno Sorbent Assay

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Zum spezifischen Nachweis auch kleiner Mengen von Zytokinen und Proteinen kam die ELISA-Methode [68] zur Anwendung. Bei den verwendeten ELISA handelte es sich um kompetitive ELISA. Eine absorbierende Mikrotiterplatte wurde mit dem zu bestimmenden Antigen beschichtet. Alle freien Bindungsstellen der Mikrotiterplatte wurden zur Verhinderung von unspezifischer Bindung und Absorbtion des Primärantikörpers oder des Antigens der Probe mit Bovinen Serum Albumin verdeckt. Bei Zugabe der Proben und des Primärantikörpers in die so vorbereitete Platte konkurrierte das Antigen der Probe mit dem Antigen, das an die Platte gebunden hat, um die Bindungsstellen des Primärantikörpers. Bei dem Primärantikörper handelt es sich um einen spezifischen monoklonalen Antikörper gegen das zu bestimmende Protein. Zur quantitativen Bestimmung der Menge an spezifisch gebundenem Primärantikörper muss der Anteil an Antikörpern, der nicht spezifisch oder gar nicht gebunden hat, aus der Platte entfernt werden. Dies geschieht durch mehrmaliges Waschen. Ein Sekundärantikörper, der polyklonal ist und sich gegen den Primärantikörper richtet, ermöglicht es, die spezifischen Bindungen zu detektieren. Der Sekundärantikörper wurde in diesem Fall mit einem Enzym gekoppelt. Dadurch war es möglich, die Menge des gebundenen Sekundärantikörpers anhand des Substratumsatzes zu ermitteln. Unspezifisch oder ungebundene Sekundärantikörper wurden wieder durch Waschen entfernt. Der Umsatz an Substrat ist durch eine Farbentwicklung erkennbar, die sich durch die Messung der Absorbtionszunahme genau bestimmen lässt. Durch die Verwendung von Antigenlösungen mit bekannter Konzentration in einer Standardkurve ist die Konzentration in der Probe berechenbar. Nach dem Prinzip des kompetitiven ELISA zeigten die Proben mit der geringsten Konzentration an dem zu messenden Protein die höchste Extinktion und die Proben mit hohen Konzentrationen entsprechend niedrigere Werte. Die Messung der Extinktion erfolgte mit Hilfe eines Plattenphotometers. Das Softwareprogramm BioLinx 2.10 (Dynatech, Denkendorf, Deutschland) erstellte anhand der gemessenen Extinktionswerte der Standardlösungen eine Standardkurve. Je nach ELISA erfolgte eine lineare oder logarithmische Auftragung der Extinktion auf der X-Achse und der Konzentration auf der Y-Achse, um eine lineare oder sigmoidale Standardkurve zu erzeugen. Mit Hilfe der durch das Programm erzeugten Standardkurve konnte die Konzentration des zu messenden Proteins in der Probe berechnet werden.

2.6.2.1  Transforming growth factor-ß ELISA

Um die Konzentration von TGF-β in unseren Zellkulturüberständen zu bestimmen, kam ein „Human TGF-β Immunoassay–Quantikine R“ der Firma R&D-Systems (Abingdon, UK) zum Einsatz. Dieser Kit enthielt bereits vorbereitete Mikrotiterplatten, die mit einem rekombinantem menschlichen TGF-β-Rezeptor vom Typ II beschichtet waren. Vor dem Messen in der Platte wurde das TGF-β in den Proben aktiviert. Die 250 µl Proben wurden mit 50 µl 1MHCl für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend mit 400 U/min zentrifugiert. Um den pH-Wert in den Proben wieder zu neutralisieren - eine pH-Veränderung würde die Messung negativ beeinflussen - wurden 50 µl 1,2M NaOH/0,5M HEPES nach dem Zentrifugieren zur Probe hinzugegeben. Der Kit enthielt ebenfalls eine Standardlösung (rekombinantes menschliches TGF-β mit einer Konzentration von 2000 pg/ml), die nach Verdünnen mit der im Kit vorhandenen Lösung RD5l die Konzentrationen von 2000 bis 0 pg/ml ergab. Es wurden 200 µl Standard oder aktivierte Probe in die Mikrotiterplatte pipettiert und bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach 3 Stunden wurde der Inhalt der Platte verworfen und die Platte gewaschen. Anschließend wurden 200 µl Conjugate-Solution (ein polyklonaler peroxidasegekoppelter Antikörper gegen TGF-β) in jede Vertiefung pipettiert und für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nachdem der Platteninhalt erneut verworfen und die Platte gewaschen wurde, konnte das Substrat in die Platte pipettiert und bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert werden. Das Substrat bestand aus zwei im Kit enthaltenen Lösungen, Farblösung A (Hydrogen Peroxide) und Farblösung B (Tetramethylbenzidine), dem eigentlichen Farbstoff. Diese beiden Lösungen wurden im Verhältnis 1:1 kurz vor Gebrauch gemischt und anschließend wurden 200 µl pro Vertiefung in die Platte pipettiert. Nach 20 Minuten wurde die Reaktion durch Hinzugabe von 50 µl 1M H2SO4 gestoppt und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 450 und 570 nm gemessen. Die Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 570 nm wurde als Korrekturmessung verwandt. Durch die Subtraktion des bei 570 nm gemessenen Werts von dem bei 450 nm gemessenen Wert wurden die optischen Interferenzen in der Mikrotiterplatte ausgeglichen. Mit Hilfe der Messung der Extinktionswerte für die Standardkurve ließen sich die Konzentrationen von TGF-β in den Proben berechnen. Gewaschen wurde jeweils mit der im Kit enthaltenen Waschlösung. Diese lag als Konzentrat vor und wurde vor der Verwendung 1:25 verdünnt.

2.6.2.2 Fibronektin ELISA

Zum Beschichten einer absorbierenden Mikrotiterplatte (F96 Maxisorb der Firma Nunc, Wiesbaden) wurde Fibronektin (Fibronectin from rat plasma, F-0653) im Coating-Puffer, bestehend aus 0,2 g Na2CO3 und 0,3 g NaHCO3 in 100 ml dH2O (ph 9,6), gelöst um eine Zielkonzentration von 200 µg/l zu erreichen. In die Vertiefungen der Mikrotiterplatte wurden je 100 µl dieser Lösung pipettiert und zwei Stunden inkubiert. Anschließend wurden alle noch freiliegenden Bindungsstellen der Platte eine Stunde mit BSA Bovines Serum Albumin (BSA) geblockt (10 µg/ml PBST). Nach dem Waschen wurden je 95 µl vorbereitete Probe oder Standard pro Vertiefung für eine weitere Stunde inkubiert. Zur Vorbereitung wurden die Proben je nach zu erwartender Fibronektinkonzentration 1:2 bis 1:8 mit DMEM-Kulturmedium verdünnt, um in den linearen Bereich der Standardkurve zu gelangen. Es wurden jeweils 100 µl verdünnte Probe oder Standard und 100 µl Primärantikörper (Rabbit/Anti-Human, Code No A:0245, der Firma DAKO A/S, Dänemark) mit einer Konzentration von 45 µg/ml eine Stunde in einer nicht absorbierenden Mikrotiterplatte vorinkubiert. Als Standards wurden Fibronektinlösungen mit Konzentrationen von 2667; 1334; 667; 333; 167; 83; 42; 21; 10; 5; 3 und 0 ng/ml eingesetzt. Anschließend wurde erneut gewaschen und eine weitere Stunde mit 100 µl Sekundärantikörper (Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG der Firma Dianova, Hamburg, Deutschland) in einer Konzentration von 0,3 µg/ml pro Vertiefung inkubiert. Nach anschließendem Waschen wurden 200 µl der Substratlösung (o-Phenylenediamine Dihydrochloride Tablet Set, Code No: P-9187) des Sekundärantikörpers pro Vertiefung hinzupipettiert und die Farbintensität mit Hilfe des Platten-Photometers MRX-5000 bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen. Die Konzentration in den Proben konnte wie beschrieben anhand der optischen Dichte der Standards ermittelt werden. Die Darstellung und demzufolge die Auftragung der Extinktion und der Konzentration erfolgte linear. Die Standardkurve zeigte einen sigmoidalen Verlauf. Die Inkubationsschritte und das Blocken der gecoateten Platte erfolgten jeweils bei 37°C, dabei wurden die Platten mit Folie oder einem Deckel abgedeckt. Gewaschen wurde jeweils nach Verwerfen des Inhalts zwei mal mit 400 µl PBST/Vertiefung und zwei mal mit 200 µl PBST/Vertiefung bei 200 U/min auf dem Minishaker der Firma IKA-Labortechnik.

2.6.2.3 Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 ELISA

↓22

Der Ablauf des PAI-1-Elisa gleicht dem des Fibronektin-Elisa.Eine absorbierende Mikrotiterplatte, Platte 1 (F96 Maxisorb der Firma Nunc, Wiesbaden), wurde mit 100 µl PAI-1 (Rat-PAI-1 der Firma American Diagnostica Inc., Pfugstadt, Deutschland) in einer Konzentration von 100 mg/ml Coating-Puffer beschichtet. Nach einer Inkubationszeit von 2,5 Stunden wurde die PAI-1-Lösung verworfen und die Mikrotiterplatte gewaschen. Anschließend wurde die Platte mit 200 µl Blocking-Puffer inkubiert, um unspezifische Bindungen der folgenden Antikörper zu verhindern. Der Blocking-Puffer bestand aus Bovinem Serum Albumin gelöst in PBST mit einer Konzentration von 5 mg/ml. Nach einer Stunde Blocken wurde erneut der Inhalt verworfen, gewaschen und 95 µl des vorbereiteten Probe-bzw. Standardantikörpergemischs in die Platte 1 übertragen. Zur Vorbereitung der Proben und der Standards wurden diese 1 Stunde vor Übertragung auf die Platte 1 in einer nichtabsorbierenden Mikrotiterplatte mit dem primären Antikörper (Rabbit Anti-Rat PAI-1 IgG der Firma American Diagnostica Inc., Pfungstadt, Deutschland) vorinkubiert. Dazu wurden jeweils 100 µl Probe oder Standard und 100 µl des Primärantikörpers (Konzentration 1 µg/ml) zusammengegeben. Die Proben wurden je nach zu erwartender Konzentration 1:2 bis 1:5 mit DMEM-Kulturmedium verdünnt. Zur Herstellung einer Standardkurve kam das gleiche PAI-1 wie zum Beschichten der Platte 1 zum Einsatz. Durch Verdünnen wurden Lösungen mit den Konzentrationen 741; 445; 267; 160; 96; 58; 35; 21; 12; 8; 5; 3 und 0 pg/µl erreicht. Als der grösste Teil des Primärantikörpers die Bindungsstellen für PAI-1 an der Platte oder in der Probe besetzt hatte, nach ca.1 Stunde, wurde erneut gewaschen und anschließend 1 Stunde mit dem sekundären Antikörper Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti Rabbit IgG, der Firma Dianova, Hamburg, Deutschland), Konzentration 0,3 µg/ml, inkubiert. Nachdem der Sekundärantikörper (Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG der Firma Dianova, Hamburg, Deutschland) an den Primärantikörper gebunden hatte, nach ca. 1 Stunde Inkubation, wurden nach einem Waschschritt 100 µl des Substrat (o-Phenylenediamine Dihydrochloride Tablet Set, Code No: P-9187) des Sekundärantikörpers hinzupepittiert. Nach 45 Minuten wurde über das Plattenphotometer MRX5000 die Menge des entstandenen farbigen Substrat-Produkts als Absobtion bei 450 nm gemessen werden. Die Konzentration von PAI-1 in den Proben wurde wie beschrieben mit Hilfe einer sigmoidalen Standardkurve berechnet. Die Auftragung der Extinktion erfolgte ebenso linear wie die der Konzentration. Die Inkubationsschritte und das Blocken der gecoateten Platte erfolgten jeweils bei 37°C, dabei wurden die Platten mit Folie oder einem Deckel abgedeckt. Gewaschen wurde jeweils nach dem Verwerfen des Inhalts mit zwei mal 400 µl PBST/Vertiefung und zwei mal 200 µl PBST/Vertiefung bei ca. 200 U/min auf dem Minishaker der Firma IKA-Labortechnik.

2.6.3 Proteinurie

Da bei der Urinsammlung in den metabolischen Käfigen die Trennung der Exkrementbestandteile nicht ganz sauber erfolgte, war die Gefahr der Kontamination mit proteinhaltiger Nahrung relativ groß. Die Bestimmung der Proteinurie wäre damit zu unspezifisch für die Abschätzung des Krankheitsgeschehens gewesen. Es erfolgte deshalb zusätzlich eine Messung der Proteinurie. Zur Bestimmung des Eiweißgehalts im Urin der Tiere wurde die Pyrogallol-Rot-Methode in Mikrotiterplatten-Technik [108] (Fluitest USP, Pyrogallol-Rot-Methode, Firma Biocon, Vöhl, Deutschland) verwendet. Pyrogallol-Rot-Molybdat bilden Komplexe mit anwesenden Proteinen. Diese Verbindung erzeugt einen Farbstoff, der einen Absorptions-Anstieg bis zu 600 nm verursacht. Dieser Absorptions-Anstieg ist direkt proportional zur vorhandenen Proteinkonzentration. Es wurde eine Standardreihe angefertigt, wobei 50 µl des Standards mit der Proteinkonzentration von 1 g/l mit NaCl verdünnt worden sind, sodass eine Standardreihe von 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 und 1 g/l Proteinkonzentration entstand. 50 µl des gesammelten 24h-Urins wurden mit 50 µl NaCl verdünnt. Von diesem Gemisch wurden 10 µl Probe auf eine nichtabsorbierende Mikrotiterplatte pipettiert. Anschließend wurden 350 µl der gebrauchsfertigen Pyrolgallol-Rot-Lösung des Herstellers auf die Proben und die Standards pipettiert. Nach 10 Minuten erfolgte die Messung der Extinktion der Proben/Standards und des Standards mit Hilfe des Platten-Photometers MRX-5000 bei 570 nm Wellenlänge. Aus den Extinktionswerten konnte die Proteinurie in mg/24h nach unten stehender Formel berechnet werden.

Abb. 1: Formel für die Berechnung der Proteinurie in mg/24h

2.6.4 Glomeruläre messenger-RNA-Expression von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1

2.6.4.1 Isolation der glomerulären RNA

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Die –80° C gelagerten Proben wurden 5 Minuten in einem Wasserbad aufgetaut. Anschließend wurde jeder Probe 200 µl Chloroform hinzugefügt und durch vortexen gemischt. Es erfolgte eine dreiminütige Inkubation bei Raumtemperatur mit anschließendem Zentrifugieren für 15 Minuten bei 14000 rpm (Biofuge, Firma Heraeus, Deutschland) und 4°C. In den Proben entstanden jeweils drei Schichten, von denen die oberste Schicht (RNA-Schicht) vorsichtig in ein neues Tube abpipettiert wurde. Der so gewonnenen RNA wurde 0,5 ml Isopropanol hinzugefügt und dieses Gemisch für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es erfolgte daraufhin eine ebenfalls 10-minütige Zentrifugation bei 14000 rpm bei 4°C. Der entstandene Überstand wurde verworfen und das im Tube verbliebene RNA-Pellet mit 70 %igem Ethanol gewaschen und nochmals bei 14000 rpm für fünf Minuten zentrifugiert. Der verbleibende Überstand wurde unter Sicht des RNA-Pellets abgekippt und das Tube mit dem Pellet fünf Minuten trocknen gelassen. Anschließend wurden je Probe 10 µl DEPC-Wasser dazugegeben und die Probe aufgemischt und danach bei 60° C für 10 Minuten inkubiert. Zur Konzentrationsbestimmung wurde eine Messung der optischen Dichte mit einem Photometer (Firma Dynatech, Hamburg, Deutschland) bestimmt, zur Bestimmung der Reinheit der gewonnenen RNA wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt.

2.6.4.2 Bestimmung des RNA-Gehaltes und der Qualität

2.6.4.2.1 Gelelektrophorese

Zur Bestimmung der RNA-Qualität wurde 1 µl des Probengemisches mit 9 µl DEPC-Wasser und 10 µl Loading Buffer auf ein ethidiumbromidgefärbtes, 2%iges Agarosegel aufgetragen und für eine Stunde bei 80mA/80V in der Gelkammer (Max Submarine Unit, HE 99X, Firma Hoefer, Deutschland) unter Mitführung eines 100 bp Markers (Rapidozym, Deutschland) elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurde die RNA-Qualität unter UV-Licht (254 nm) sichtbar gemacht und anhand der Banden beurteilt.

2.6.5 Konzentrationsmessung der RNA mittels Spektrometer

Zur Bestimmung der Konzentration und der Reinheit der gewonnenen RNA wurde 1µl der RNA Probe mit 99 µl DEPC-Wasser verdünnt und im Photometer (Firma Dynatech, Hamburg, Deutschland) bei einer Wellenlänge von 260 nm die Extinktion für Nukleinsäuren gemessen. Das hier verwendete Spektrometer mißt selbständig den Quotienten zwischen DNA- und RNA-Extinktion, um zu überprüfen, ob in der Probe eventuell Spuren von DNA enthalten sind, und gibt eine Ratio an. Eine Ratio zwischen 1,4 und 1,6 wurde als qualitativ gut und rein bewertet. Aus der ermittelten Extinktion der RNA bei 260 nm wurde die Konzentration der RNA in µg/ml nach folgender Formel berechnet:

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Abb. 2: Formel für die Berechnung des RNA-Konzentration in µg/ml

Diese Werte wurden der folgenden RT-PCR zu Grunde gelegt.

2.6.6  RT-PCR

Die PCR ist eine etablierte Methode zur Genanalyse, die es ermöglicht, auch kleine Mengen von DNA zu untersuchen. Von dem zu untersuchenden Genabschnitt werden eine so hohe Anzahl von Kopien angefertigt, so dass das Amplifikat analysierbar wird. Die PCR beruht auf drei wesentlichen Schritten. Als erstes wird die DNA so stark erhitzt, dass sich die beiden Doppelstränge von einander trennen. Dieser Schritt heißt Denaturierung. Anschließend wird die Reaktionstemperatur soweit gesenkt (annealing temperature), dass sich vor bzw. hinter dem zu untersuchenden Genabschnitt jeweils individuelle Primerpaare anlagern können. Primer sind Oligonucleotide, die etwa 15-30 Basenpaare umfassen und als Starthilfe für die Synthese des komplementären Strages benötigt werden. Sie flankieren jeweils die gewünschte Region in der Ziel-DNA. In dem dritten Arbeitsschritt wird die Temperatur auf den otimalen Arbeitsablauf der in die Reaktion eingebrachten DNA-Polymerase eingestellt, die eine komplementäre Kopie des Bereiches zwischen den beiden Primerpaaren anfertigt. Anschließend beginnt der Zyklus von neuem mit der Denaturierung. Dieses Vorgehen ermöglicht eine Verdopplung des Gensegments bei jedem Zyklus.

↓25

Die hier verwendete RT-PCR ist eine gängige Methode zu Untersuchung von messengerRNA-Genexpression. Durch das Enzym Reverse Transkriptase (RT) wird die isolierte RNA in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben, da die RNA selbst für die PCR nicht thermostabil genug ist.

2.6.6.1  Reverse Transkriptase-Reaktionen

Die isolierte RNA wurde auf eine Konzentration von 1 µg/µl eingestellt und mit einer Lösung aus 4 µl Magnesiumchlorid, 2 µl PCR-Puffer, 2 µl DEPC-Wasser, jeweils 2 µl der Desoxynukloesidphosphaten von Adenin (dATP), Guanin (dGTP), Cytosin (dCTP) und Thymidin (dTTP), 1 µl des unspezifischen Primer Random Hexamer, 1 µl des RNAse Inhibitors und 1 µl der Murinen Reversen Transkriptase versetzt (alle verwendeten Substanzen analog Hersteller des RT-Kits RNA PCR Core Kit, PE Applied Biosystems,California, USA). Dieser Ansatz wird 10 Minuten bei 25°C, 45 Minuten bei 42°C, 5 Minuten bei 95°C und weitere 10 Minuten bei 0°C im Thermocycler (Trio-Thermoblock, Biometra, Deutschland) inkubiert.

2.6.6.2 PCR

Für die PCR wurde die bei der RT erzeugte cDNA verwendet. Es wurde die relative Menge an cDNA der Gene für TGF-ß, Fibronectin und PAI-1 bestimmt, die eine Aussage darüber erlaubte, wieviel mRNA für das jeweilige Gen in der RNA-Probe enthalten war. Zusätzlich wurde eine semiquantitave Auswertung von Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH) durchgeführt. Dieses Gen gehört zu den sogenannten „housekeeping enzymes“ und wird definitionsgemäß in der immer gleichen Menge exprimiert. Es stellt somit als Maß dafür, wie erfolgreich die RT verlaufen und wieviel cDNA in den einzelnen Proben jeweils vorhanden war. Die PCR (Polymerase-Chain-Reaction) beginnt grundsätzlich mit einer Denaturierung doppelsträngiger DNA zu jeweils zwei Einzelsträngen bei einer Temperatur von 95°C. Als zweiter Schritt erfolgt eine Hybridisierung von im Überschuß vorliegenden Oligonucleotiden, sogenannten Primern, an ihre komplementären Sequenzen bei einer Temperatur von 59°C (für GAPDH) und 64°C (für die Zytokine TGF-ß, PAI-1 und Fibronektin). Dieser Schritt wird auch als „Annealing“ bezeichnet. Als Drittes kommt es bei einer Temperatur von 72°C zu einer komplementären Verlängerung der Einzelstrang-DNA zum Doppelstrang durch die DNA-Polymerase, die die Primer als Startsignale für diesen Vorgang erkennt. Diese drei Zyklusschritte werden zur Vervielfältigung, der Amplifizierung, der Ziel-DNA bis zu 29 Mal wiederholt. Die Zyklenzahl ist Primer-abhängig, ebenso wie die „annealing-temperature“ und ist aus der Tabelle 5 ersichtlich.

↓26

Die cDNA-Probe wurde mit einer Lösung aus Magnesiumchlorid, PCR-Puffer, den jeweiligen Primer-Paaren und der DNA-Polymerase versetzt und nach dem oben erläuterten Prinzip der PCR amplifiziert.

Tab. 4: PCR-Protokolle für GAPDH, TGF-ß, Fibronektin und PAI-1: Sense/Antisense-Sequenzen, Temperaturprofile und Zykluslängen

GAPDH

TGF-ß1

PAI-1

Fibronektin

Sense

1,5 µl

1,5 µl

1,5 µl

1,5 µl

CCATCTTCC

GGTGGCAGGC

CAGCATGTGG

GGTCCAAATCG

AGGAGCGAGAT

GAGAGCGCTGA

TCCAGGCCTCCAAA

GTCATGTTCCCA

Antisense

1,5 µl

1,5 µl

1,5 µl

1,5 µl

GATGACCTTG

GGCATGGTAG

TGTGCCGCTC

GCCCCAGGTC

CCCACAGCCT

CCCTTGGGCT

TCGTTCACCTCGATCT

TGCGGCAGTTGT

cDNA

1µl

1µl

1µl

1µl

10fach TBE-Puffer

2 µl

2 µl

2 µl

2 µl

Mg-Cl

2 µl

2 µl

2 µl

2 µl

dNTP

0,1 µl

0,1 µl

0,1 µl

0,1 µl

DEPC-H2O

11,65 µl

11,65 µl

11,65 µl

11,65 µl

Temperatur-Profil

24 Zyklen

27 Zyklen

27 Zyklen

27 Zyklen

95°C für 10:00 min

95°C für 10:00 min

95°C für 10:00 min

95°C für 10:00 min

94°C für 00:30 min

94°C für 00:30 min

94°C für 00:30 min

94°C für 00:30 min

59°C für 00:30 min

64°C für 00:30 min

64°C für 00:30 min

64°C für 00:30 min

72°C für 02:00 min

72°C für 02:00 min

72°C für 02:00 min

72°C für 02:00 min

 

72°C für 07:00 min

72°C für 07:00 min

72°C für 07:00 min

72°C für 07:00 min

 

4°C für 10:00 min

4°C für 10:00 min

4°C für 10:00 min

4°C für 10:00 min

Anschließend wurde der Probe 8 µl Ladungspuffer (bestehend aus 20% Glycerol, 0,02% Bromphenolblau und DEPC-Wasser) zugesetzt und das Gemisch auf ein 1%iges mit Ethidiumbromid versetztes Agarosegel aufgetragen. Unter Mitführen eines 100 bp Markers (Rapidozym, Berlin, Deutschland) wurde das Amplikon bei 125 Volt 35 Minuten elektrophoretisch aufgetrennt, wonach die DNA-Banden unter UV-Licht (254 nm) durch Interkalation der DNA mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht werden. Dieses Gel wurde anschließend durch einen bildgebenden Dichtemesser (Typhoon® 8600, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) und mit dem Programm „ImageQuant®“ (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) semiquantitativ die Banden des Zielgens (TGF-ß, PAI-1, Fibronektin) im Vergleich zum housekeeping enzyme GAPDH analysiert. Die Werte der Dichtemessung für TGF-ß1, PAI-1 und Fibronektin wurden durch die Dichtewerte von GAPDH dividiert. Diese Ratio Zielgen/GAPDH wurde tabellarisch aufgetragen. Für das Zielgen wurde bei den unbehandelten nephritischen Tieren (GN) für die Bestimmung der Quantität der glomerulären Zytokin-Expression ein Wert von 100% angenommen.

2.7 Nitrat/Nitrit-Messung (Griess-Assay)

↓27

Nitrat und Nitrit sind die stabilen Oxidationsprodukte des NO. Sie fungieren als Indikatoren der endogenen NO-Synthese [38]. Für die Messung dieser Indikatoren diente die Reaktion nach Griess [10]. Die Sensitivität dieser Reaktion erhöht sich, wenn vor der Messung mittels Reduktase Nitrat zu Nitrit reduziert wird [69]. Analysiert wurden Plasma- und Urinproben der Tiere. Beide Probenarten wurden zuerst mit PBS verdünnt. Die Urinproben wurden im Verhältnis 1:10, die Plasmaproben wurden im Verhältnis 1:3 mit PBS verdünnt. Anschließend wurde 100µl Probenvolumen entnommen und jeweils 40 µl 0,05 mmol/L NADPH (Nicotinamidadenindinucleotidphosphat) und 30 µl 0,05 U des Enzyms Nitrat Reduktase (Boehringer Mannheim Biochemie, Mannheim, Deutschland) in die Urin- und Plasmaproben dazugegeben. Es erfolgte eine 45minütige Inkuabtionszeit bei bei Raumtemperatur. Ausgangssubstanz für die Standardkurve war eine 1M Natriumnitrit – Lösung, die zu einer 100 µM Lösung mittels PBS verdünnt wurde. Durch weitere Verdünnung mit PBS erreichte man verschieden Konzentrationen von 0; 1; 2; 5; 5; 7; 10; 15; 20; 25; und 50 µM Natriumnitrit, die dann als Standard-Proben fungierten. 100 µl dieser Standard-Proben wurden ebenfalls mit 30 µl 0,05 U des Enzyms Nitrat Reduktase (Boehringer Mannheim Biochemie, Mannheim, Deutschland) versetzt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Urin- und Plasmaproben mit 20 µl einer 70%igen Zinksulfat-Lösung versetzt und bei 14.000 U für fünf Minuten zentrifugiert. Daraus resultiert eine Proteinfällung, die die Sensitivität der Messung erhöht, da noch vorhandene Eiweiße die optische Dichtemessung stören können. 100 µl der Proben und der Standard-Proben wurde auf eine nichtabsorbierende Mikrotiterplatte aufgetragen und anschließend auf jede Probe 100 µl Griess-Reagenz pipettiert. Griess-Reagenz besteht aus zwei gleichen Anteilen Griess-I-Lösung (0,05% N-(1-naphtyl)ethylendiamin-Dihydrochlorid) und Griess-II-Lösung (0,5% Sulfanilamid in 45% eiskalter Essigsäure), die erst unmittelbar vor dem Aufbringen auf die Urin- und Plasmaproben, zur Griess-Reagenz zusammengemischt werden. Dann erfolgt eine 10minütige Inkubation in Dunkelheit. Bei 570 nm konnte mittels des Plattenphotometer MRX5000 (Dynex Technologies, Frankfurt am Main, Deutschland) die Menge des entstandenen farbigen Substrat-Produkts als Absobtion gemessen werden. Die Konzentration in den Proben wurde anhand der optischen Dichte der Standards ermittelt.

2.8 Effekte des NO auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion in vitro

Um die direkten Einflüsse von NO auf die Produktion des Zytokins TGF-ß in vitro zu untersuchen, wurden Glomeruli von zwei normalen, gesunden Tieren und Glomeruli von drei unbehandelten, nephritischen Tieren, (Tag sieben nach Injektion des OX-7 Antikörpers in einer Dosis von 0,5 mg/kg KG) in DMEM Kulturmedium bei einer Dichte von 2000/ml resuspendiert. Der NO-Donor Diethylenetriamin (Halbwertszeit bei 37°C: 20 h; DETA NONOate, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI USA) wurde in ansteigenden Konzentration diesen kultivierten Glomeruli zugesetzt: 0 (Kontrolle), 10, 50, 100, 500 µmol/l. diese Konzentrationen wurden auf Grundlage vorangegangener Arbeiten gewählt [103]. Anschließend wurden die Glomeruli 48 Stunden bei 37°C/5% CO2 inkubiert. Danach wurden der Überstand gesammelt und bei – 20° C bis zur Analyse der TGF-ß-Produktion gelagert. Es wurden jeweils drei Proben von jedem Tier analysiert. Die TGF-ß-Produktion wurde wie oben beschrieben anhand des TGF-ß-ELISA analysiert.

2.9  Statistische Auswertung

Die Versuchsergebnisse wurden je Gruppe als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Die Auswertung wurde mit dem SPSS Software-Programm vorgenommen. Die statistische Analyse erfolgte unter Verwendung einer ANOVA-Prozedur und anschließendem t-Test mit Bonferroni Korrektur für Mehrfachtestung. Ein p-Wert von <0,05 wurde als signifikant gewertet. Die Daten der mRNA-Exprimierung wurden mit Man-Whitney-U-Test ausgewertet.


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04.10.2006