Ergebnisse

↓27

3.1  Protokoll 1 Effekte der Behandlung mit L-Arginin, Molsidomin und L-Arginin + L-NAME sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis

3.1.1  Gewichtsverhalten

↓28

Bis zum Tag der Nierenentnahme erreichten die Versuchstiere folgendes Gewicht:

Tab. 5: Mittleres Körpergewicht in g der Gruppen in Versuchsprotokoll 1; In der ANOVA-Prozedur zeigten sich keine signifikanten Unterschiede bei den Gewichten der einzelnen Gruppen. P=NS für alle Gruppen

3.1.2 Aufgenommene Dosen von L-Arginin, Molsidomin und L-NAME

Über den täglich dokumentierten Futter- und Trinkwasserverbrauch wurden die tatsächlich aufgenommenen Medikamentendosen mg/Tier/Tag berechnet.

3.1.2.1 L-Arginin

↓29

Alle Tiere wurden mit dem oben beschriebenen Futter gefüttert. Da das Futter per se einen L-Arginin-Anteil von 0,87% enthält, ist die Menge an aufgenommenen L-Arginin höher, als die täglich dazugegebene Dosis.

Auch die gesunden Kontrolltiere und die Tiere, die mit Molsidomin behandelt wurden haben die Aminosäure durch das Futter aufgenommen. Die gesunden Kontrolltiere nahmen 218 ± 0,0 mg/die auf. Bei den nephritischen Tieren nahmen die unbehandelte Gruppe (GN) 212 ± 4 mg/die und die Tiere mit einer NO-Donation mittels Molsidomin 218 ± 0,0 mg/die zu sich.

Die Tiere mit Arginin-Supplementation und die Versuchsgruppe mit L-Arginin und L-NAME erreichte eine L-Arginin Aufnahme von jeweils 677 ± 19 mg/die (GN-Arg) und 625 ± 43 mg/die (GN-Arg-NAME).

↓30

Abb. 3: Protokoll 1: Dosis der diätetischen L-Arginin-Zufuhr in mg/die; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name
(-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. ***P< 0,001 vs. Kontrolle, GN und GN-Molsi

3.1.2.2  L-NAME

Für die die Tiere der Therapiegruppe mit L-Arginin kombiniert mit dem NO-Synthase-Hemmer L-NAME wurde eine tägliche Aufnahme von L-NAME in Höhe von 2,6 ± 0,3 mg/Tier erzielt.

3.1.2.3 Molsidomin

Die Gruppe der Tiere, denen der NO-Donor zugeführt wurde, nahm eine Menge an Molsidomin in Höhe von 10,0 ± 0,2 mg pro Tier und Tag ein.

3.1.3  Systolischer Blutdruck

↓31

Die gesunden Kontrollen, die eine PBS-Injektion erhielten, hatten ebenso einen normalen Blutdruck (123 ± 5 mmHg) wie die nephritischen Kontrollen (125 ± 3 mmHg), die eine OX-7-Injektion erhalten haben. Die Gabe von L-Arginin, Molsidomin oder L-Arginin + L-NAME hatte keinen signifikanten Effekt auf den Blutdruck.

Abb. 4: Protokoll 1: Effekte der Behandlung auf den systolischen Blutdruck; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name
(-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion.

3.1.4 Glomerulärer Matrixgehalt

Auch auf den glomerulären Matrixgehalt nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis hatte die Gabe von L-Arginin, NO-Donation und L-Arginin + NOS-Inhibitor L-NAME einen Einfluss. Gesunde Kontrolltiere (Kontrolle) erreichten einen glomerulären Matrixgehalt von 21,4 ± 1,2 %, während bei nephritischen Tieren (GN), denen keinerlei Behandlung zukam, einen Matrixgehalt von 76 ± 1,7 % gemessen wurde. L-Arginin-Gabe und auch die NO-Donation mit Molsidomin reduzierten diesen glomerulären Matrixgehalt (GN-Arg: 67,1 ± 3,9 %; GN-Molsi: 62,7 ± 2,0 %). Bei Tieren mit der Kombinationbehandlung aus L-Arginin + NOS-Inhibitor L-NAME (GN-Arg-NAME) wurde ein Matrixgehalt von 74,6 ± 2,5 % gemessen.

↓32

Abb. 5: Protokoll 1: Effekte auf den glomerulären Matrixgehalt; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. * P < 0.05 vs. GN, ** P < 0,01 vs. GN

3.1.5 Glomeruläre TGF-ß-Produktion

Verglichen mit unbehandelten nephritischen Tieren (GN; 1023 ± 71 pg/ml) reduzierten die Gaben von L-Arginin und Molsidomin signifikant die TGFß-Produktion der kultivierten Glomeruli. Glomeruli der Tiergruppe mit erhöhter L-Arginin-Zufuhr (GN-Arg) zeigten eine eine TGF-ß-Produktion von 522 ± 66 pg/ml. Bei Tieren der Gruppe, die mit der NO-Donation via Molsidomin (GN-Molsi) behandelt wurden, wurde eine Konzentration von 629 ± 34 pg/ml an Transforming growth factor-ß gemessen. Die Gabe des NO-Synthase-Inhibitors L-NAME unter gleichzeitiger L-Arginin-Gabe (GN-Arg-NAME) dagegen zeigte wieder einen Anstieg der TGFß-1-Produktion auf 967 ± 46 pg/ml. Die gesunden Kontrolltiere (Kontrolle) zeigten eine TGF-ß-Konzentration von 30 ± 16 pg/ml.

Abb. 6: Protokoll 1: Effekte auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. *** P < 0.001 vs. GN

3.1.6  Glomeruläre Fibronektin-Produktion

↓33

Die Messungen der Fibronektin-Konzentration im Zellkulturüberstand zeigte ebenfalls signifikante Unterschiede. Die unbehandelten nephritischen Tiere (GN) zeigten eine Fibronektin-Konzentration von 23,3 ± 1,2 µg/ml. Gesunde Kontrolltiere (Kontrolle) erreichten eine Konzentration von 4,3 ± 0,5 µg/ml. Auch hier reduzierten L-Arginin (GN-Arg; 16,4 ± 1,2 µg/ml) und Molsidomin (GN-Molsi; 15,8 ± 1,0 µg/ml) die Produktion von Fibronektin. Auch hier zeigte die kombinierte Gabe von L-Arginin und L-NAME (GN-Arg-NAME; 23,4 ± 1,2 µg/ml) einen Anstieg der gemessenen Konzentration.

Abb. 7: Protokoll 1: Effekte auf die glomeruläre Fibronektin-Produktion; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name
(-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. *** P < 0.001 vs. GN

3.1.7  Glomeruläre PAI-1-Produktion

Bei der PAI-1-Konzentration im glomerulären Kulturüberstand zeigten sich ebenfalls Unterschiede innerhalb der Therapiegruppen. Bei gesunden Kontrolltieren (Kontrolle) wurde eine PAI-1-Konzentration von 439 ± 62 ng/ml gemessen. Nephritische, unbehandelte Tiere (GN) dagegen erreichten eine Konzentration von 1060 ± 93 ng/ml. Die Arginin-Supplementation (GN-Arg) sowie auch die Molsidomin-Gabe (GN-Molsi) verringerten die PAI-1-Produktion auf 757 ± 43 ng/ml bzw. 723 ± 64 ng/ml.

↓34

Auch hier zeigten die Tiere mit kombinierter L-Arginin- und L-NAME-Gabe (GN-Arg-NAME) einen Anstieg der PAI-1-Konzentration auf 953 ± 69 ng/ml.

Abb. 8: Protokoll 1: Effekte auf die glomeruläre PAI-1-Produktion; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. * P < 0.05 vs. GN

3.1.8  Proteinurie

Im Vergleich zu den gesunden Kontrolltieren (Kontrolle: 13 ± 2 mg/24h) stieg die Proteinurie bei den unbehandelten, nephritischen Tieren an (GN: 48 ± 5 mg/24h). In den behandelten Tiergruppen wurde die Proteinurie jedoch nicht signifikant erhöht durch Gabe von L-Arginin (GN-Arg: 62 ± 7 mg/24h), Molsidomin (GN-Molsi: 48 ± 6 mg/24h) oder L-Arginin + L-NAME (GN-Arg-NAME: 64 ± 6 mg/24h).

↓35

Abb. 9: Protokoll 1: Effekte auf die Proteinurie; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. P=NS GN vs. GN-Arg, GN-Arg-NAME, GN-Molsi (ANOVA)

3.1.9 mRNA-Expression von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1

Das Muster der glomerulären messenger RNA-Expression von TGF-ß, Fibronektin und PAI-1 folgte dem Muster der oben dargestellten Protein-Expression. Die mRNA-Expression wurde für das housekeeping-enzyme GAPDH korrigert und in Prozent gemessen. Die unbehandelten nephritischen Tiere wurden mit 100%-mRNA-Expression gleichgesetzt (GN: 100%).

3.1.9.1 Glomeruläre mRNA-Expression von TGF-ß1

Im Vergleich dazu zeigte sich eine TGF-ß1-Expression bei mit Arginin behandelten Tieren (GN-Arg) von 68 ± 8%, bei NO-Donation mit Molsidomin (GN-Molsi) 63 ± 8% und bei Kombination L-Arginin + L-NAME (GN-Arg-NAME) 105 ± 14%. Bei den gesunden Kontrollen (Kontrolle) fand sich eine mRNA-Expression von 35 ± 5%

↓36

Abb. 10: Protokoll 1: Effekte auf die mRNA-Expression von TGF-ß1 relativ zur mRNA-Expression von housekeeping gene GAPDH; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. ***P < 0,001 vs. GN

3.1.9.2  Glomeruläre mRNA-Expression von Fibronektin

Auch für die glomeruläre mRNA-Expression von Fibronektin ergaben sich signifikante Unterschiede. Die Kontrolltiere (Kontrolle) zeigten eine Fibronektin-mRNA-Expression von 13 ± 1%. Bei den mit Arginin behandelten Tieren (GN-Arg) wurde eine Fibronektin-mRNA-Expression von 62 ± 5%, bei NO-Donation mit Molsidomin (GN-Molsi) 63 ± 6% und bei Kombination L-Arginin + L-NAME (GN-Arg-NAME) 90 ± 10% gemessen.

Abb. 11: Protokoll 1: Effekte auf die mRNA-Expression von Fibronektin relativ zur mRNA-Expression von Housekeeping gene GAPDH; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. ***P < 0,001 vs. GN

3.1.9.3  Glomeruläre mRNA-Expression von PAI-1

↓37

Die glomeruläre mRNA-Expression von PAI-1 zeigte ebenfalls signifikante Unterschiede zwischen den Therapiegruppen. Arginin-behandelte Tiere (GN-Arg) zeigten eine Expression von 81 ± 7%. Die mit Molsidomin (GN-Molsi) behandelten Tiere wiesen eine mRNA-Expression von 75 ± 4% auf und bei Kombinationsgabe L-Arginin + L-NAME (GN-Arg-NAME) wurde eine Fibronektin-mRNA-Expression von 109 ± 17% gemessen. Die gesunden Tiere (Kontrolle) zeigten eine mRNA-Expression von 11 ± 1%.

Abb. 12: Protokoll 1: Effekte auf die mRNA-Expression von PAI-1 relativ zur mRNA-Expression von Housekeeping gene GAPDH; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. ***P < 0,001 vs. GN

3.1.10  NO2‾/NO3‾ im Plasma

Die Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis hatte keinen signifikanten Effekt auf die Plasma NOx-Produktion. Die gesunden Kontrolltiere (Kontrolle) zeigten 33 ± 4 nmol/ml, während auch bei den nephritischen Tieren, die keinerlei Behandlung bekamen, 36 ± 2 nmol/ml gemessen wurden. Auch bei der Gabe von L-Arginin (GN-Arg: 39 ± 4 nmol/ml) oder kombiniert mit L-NAME (GN-Arg-NAME: 36 ± 3 nmol/ml) zeigten sich keine signifikanten Unterschiede (P=NS vs. GN und Kontrolle). Im Kontrast dazu konnte durch die NO-Donation via Molsidomin (GN-Molsi) ein signifikanter Anstieg der NOx-Produktion auf 56 ± 8 nmol/ml gemessen werden.

↓38

Abb. 13: Protokoll 1: Effekte auf die NOx-Spiegel im Plasma; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN) Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. *P < 0,05 vs. GN

3.1.11 NO2‾/NO3‾ im Urin

Auch auf die NOx-Spiegel im Urin wurde allein durch Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis keine signifikanter Effekt nachgewiesen. Hier zeigten die gesunden Kontrolltiere (Kontrolle) 14 ± 0,54 µmol/24h und die nephritischen Tieren 13,9 ± 1,58 µmol/24h. Nach Gabe von L-Arginin (GN-Arg: 18,11 ± 2,73 µmol/24h) und auch L-Arginin kombiniert mit L-NAME (GN-Arg-NAME: 15,8 ± 2,28 µmol/24h) wurden keine signifikanten Unterschiede gemessen (P=NS vs. GN und Kontrolle). Die Tiere mit NO-Donation via Molsidomin (GN-Molsi) dagegen zeigten einen signifikanten Anstieg der NOx-Produktion auf 29,27 ± 3,73 µmol/24h.

Abb. 14: Protokoll 1: Effekte auf die NOx-Spiegel im Urin; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. **P < 0,01 vs. GN

3.1.12  Effekte von NO auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion in vitro

↓39

Der Effekt des NO-Donors DETA NONOate in vitro wurde in kultivierten Glomeruli gesunder Kontrolltiere und nephritischer, unbehandelter Tiere sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis analysiert. In beiden Fällen zeigte die Gabe von steigenden NO-Konzentrationen einen Abfall der glomerulären TGF-ß-Produktion innerhalb von 48 Stunden. Dieser Effekt war dosisabhängig.

3.1.12.1  Effekt von NO auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion gesunder Kontrolltiere in vitro

Bei den gesunden Kontrolltieren (Kontrolle) reduzierte die Gabe von jeweils 10, 50, 100 und 500 µmol DETA NONOate die TGF-ß-Synthese um 18%, 43%, 63% und 68%.

Abb. 15: Protokoll 1: Effekte der NO-Donation mittels DETA NONOate in ansteigenden Konzentrationen auf die TGF-ß-Produktion in vitro auf kultivierte Glomeruli gesunder Tiere. Die Kontrolle erhielt kein DETA NONOate. ***P < 0,001 vs. GN

3.1.12.2  Effekt von NO auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion nephritischer Tiere sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis in vitro

↓40

Für die nephritischen Tiere (GN) wurde eine Reduktion der TGF-ß-Produktion durch die Gabe von jeweils 10, 50, 100 und 500 µmol DETA NONOate um jeweils 1%, 12%, 18% und 38% gezeigt.

Abb. 16: Protokoll 1: Effekte der NO-Donation mittels DETA NONOate in ansteigenden Konzentrationen auf die TGF-ß-Produktion in vitro auf kultivierte Glomeruli nephritischer Tiere sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephrits. Die Kontrolle erhielt kein DETA NONOate. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 vs. GN

3.1.13  Immunhistochemische Färbung von TGF-ß1-Protein sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis

Als Nachweis des renalen TGF-ß1-Proteins wurde eine immunhistochemische Färbung sieben Tage nach Induktion der Glomerulonephritis vorgenommen. Die folgenden Abbildungen zeigen eine charakteristische Färbung des renalen TGF-ß1 Proteins Abbildung (A) zeigt die Färbung bei normalen, gesunden Kontrolltieren (Kontrolle). Bild (B) zeigt die TGF-ß1-Färbung bei unbehandelten nephritischen Tieren (GN), (C) die Gabe von L-Arginin (GN-Arg), (D) die kombinierte Behandlung L-Arginin und L-NAME (GN-Arg-NAME) und (E) die NO-Donation mit Molsidomin (GN-Molsi). Die Bilder (B)/(GN) und (D)/(GN-Arg-NAME) zeigen eine erhöhte Anfärbung des Fibrosemarkers, während – verglichen mit den Abbildungen in (C)/(GN-Arg) und (E)/(GN-Molsi) – eine deutlich niedrigere Färbungsintensität gezeigt wird. Die gesunden unbehandelten Tiere (A)/(Kontrolle) weisen dagegen fast kein rötliches Färbungsmuster auf.

↓41

Abb. 17: Charakteristische immunhistochemische Färbung des renalen TGF-ß1 Proteins sieben Tage nach Induktion der Glomerulonephritis. (A) zeigt die Färbung bei normalen, gesunden Kontrolltieren (Kontrolle). Bild (B) zeigt die TGF-ß1-Färbung bei unbehandelten nephritischen Tieren (GN), (C) die Gabe von L-Arginin (GN-Arg), (D) die kombinierte Behandlung L-Arginin und L-NAME (GN-Arg-NAME) und (E) die NO-Donation mit Molsidomin (GN-Molsi).

3.2  Protokoll 2 Effekte der Behandlung mit L-Arginin, Molsidomin und L-Arginin + L-NAME zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis

3.2.1  Gewichtsverhalten

Bis zum Tag der Nierenentnahme erreichten die Versuchstiere folgendes Gewicht:

Tab. 6: Mittleres Körpergewicht in g der Gruppen in Versuchsprotokoll 2; In der ANOVA-Prozedur zeigten sich keine signifikanten Unterschiede bei den Gewichten der einzelnen Gruppen. P=NS für alle Gruppen (ANOVA)

Gruppe

Gewicht in g

Gesunde Kontrollen

268 ± 15

GN

271 ± 7

GN-Arg

279 ± 11

GN-Arg-NAME

279 ± 9

GN-Molsi

246 ± 12

3.2.2 Aufgenommene Dosen von L-Arginin, Molsidomin und L-NAME

↓42

Über den täglich dokumentierten Futter- und Trinkwasserverbrauch wurden die tatsächlich aufgenommenen Medikamentendosen mg/Tier/Tag berechnet.

3.2.2.1 L-Arginin

Auch in diesem Versuchsprotokoll wurden alle Tiere mit dem oben beschriebenen Futter ernährt. In diesem zweiten Protokoll wurden folgende Mengen an L-Arginin für die einzelnen Versuchsgruppen erreicht: Gesunde Kontrolltiere (Kontrolle) 195 ± 2 mg/die, unbehandelte nephritische Tiere (GN) 190 ± 2 mg/die, Tiere mit NO-Donation (GN-Molsi) 180 ± 5 mg/die, Versuchsgruppe mit erhöhter L-Arginin-Zufuhr (GN-Arg) 692 ± 6 mg/die und die Gruppe mit erhöhter L-Arginin-Gabe und gleichzeitiger NO-Synthase-Blockade (GN-Arg-NAME) 689 ± 6 mg/die. Die folgende Graphik verdeutlicht die Arginin-Aufnahme:

Abb. 18: Protokoll 2: Dosis der diätetischen L-Arginin-Zufuhr in mg/die; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name
(-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion.L-Argininaufnahme der Gruppen in Versuchsprotokoll 2; ***P< 0,001 vs. Kontrolle, GN und GN-Molsi

3.2.2.2  L-NAME

↓43

Für die Tiere der Therapiegruppe mit L-Arginin kombiniert mit dem NO-Synthase-Hemmer L-NAME wurde eine tägliche Aufnahme von L-NAME in Höhe von 2,8 ± 0,1 mg/die pro Tier erzielt.

3.2.2.3 Molsidomin

Die Gruppe der Tiere, denen der NO-Donor zugeführt wurde, nahm eine Menge an Molsidomin in Höhe von 8,3 ± 0,2 mg pro Tier und Tag ein.

3.2.3  Glomerulärer Matrixgehalt

Gesunde Kontrolltiere (Kontrolle) erreichten einen glomerulären Matrixgehalt von 30 ± 5%, während bei nephritischen Tieren (GN), denen keinerlei Behandlung zukam, einen Matrixgehalt von 65,4 ± 2,6% gemessen wurde. Molsidomin und auch L-Arginin-Gabe reduzierten diesen glomerulären Matrixgehalt (GN-Arg: 55,8 ± 1,8%; GN-Molsi: 53,9 ± 3,5%). Bei Tieren mit der Kombinationbehandlung aus L-Arginin + NOS-Inhibitor L-NAME (GN-Arg-NAME) wurde ein Matrixgehalt von 62,6 ± 1,0% gemessen.

↓44

Abb. 19: Protokoll 2: Effekte auf den glomerulären Matrixgehalt; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. * P < 0.05 vs. GN, ** P < 0,01 vs. GN

3.2.4  Glomeruläre TGF-ß-Produktion

Ähnlich wie in Versuchsprotokoll 1 zeigte die L-Arginin-Gabe (GN-Arg: 167 ± 13 pg/ml) und auch die NO-Donation mit Molsidomin (GN-Molsi: 158 ± 11 pg/ml) eine signifikante Reduktion der TGF-ß-Produktion in den kultivierten Glomeruli Die Gabe des NO-Synthase-Inhibitors L-NAME unter gleichzeitiger L-Arginin-Gabe (GN-Arg-NAME) dagegen zeigte ebenfalls einen Anstieg der TGFß-Produktion auf 275 ± 26 pg/ml. Die gesunden Kontrolltiere (Kontrolle) zeigten eine TGF-ß-Konzentration von 60 ± 11 pg/ml, für die Werte der unbehandelten nephritischen Tiere fanden sich Konzentrationen von 282 ± 15 pg/ml.

Abb. 20: Protokoll 2: Effekte auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name
(-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. *** P < 0.001 vs. GN

3.2.5  Glomeruläre Fibronektin- Produktion

↓45

Auch die glomeruläre Fibronektin-Konzentration zeigte signifikante Unterschiede. Gesunde Kontrolltiere (Kontrolle) erreichten eine Konzentration von 2,7 ± 0,5 µg/ml. Bei den unbehandelten nephritischen Tiere (GN) wurde eine Fibronektin-Konzentration von 17,6 ± 1,5 µg/ml gemessen. Auch hier reduzierten L-Arginin (GN-Arg; 11,9 ± 0,9 µg/ml) und Molsidomin (GN-Molsi; 11,8 ± 1,2 µg/ml) die Produktion von Fibronektin. Wurde neben L-Arginin der NOS-Inhibitor L-NAME (GN-Arg-NAME) gegeben, stieg die gemessene Konzentration auf 15,3 ± 0,8 µg/ml.

Abb. 21: Protokoll 2: Effekte auf die glomeruläre Fibronektin-Produktion; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name
(-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. ** P < 0.01 vs. GN

3.2.6  Glomeruläre PAI-1-Produktion

Im Vergleich zu den nephritischen Tieren (GN: 758 ± 78 ng/ml) zeigten auch hier die Arginin-Gabe (GN-Arg: 624 ± 80 ng/ml) und auch die NO-Donation (GN-Molsi: 521 ± 69 ng/ml) eine Reduktion der PAI-1-Konzentration im glomerulären Kulturüberstand, während die kombinierte L-Arginin- und L-NAME-Gabe (GN-Arg-NAME) einen Anstieg der PAI-1-Konzentration auf 968 ± 130 ng/ml aufwies. Die gesunden Kontrolltieren (Kontrolle) erreichten eine PAI-1-Konzentration von 143 ± 17 ng/ml.

↓46

Abb. 22: Protokoll 2: Effekte auf die glomeruläre PAI-1-Produktion; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. * P < 0.05 vs. GN

3.2.7  Proteinurie

Auch hier in diesem zweiten Versuchsprotokoll ist die Im Vergleich zu den gesunden Kontrolltieren (Kontrolle: 0,2 ± 0,1 mg/24h) stieg die Proteinurie bei den unbehandelten, nephritischen Tieren an (GN: 25 ± 5 mg/24h). In den behandelten Tiergruppen wurde die Proteinurie im Vergleich zu den unbehandelten nephritischen Tieren nicht signifikant erhöht durch Gabe von L-Arginin (GN-Arg: 33 ± 4 mg/24h), oder L-Arginin + L-NAME (GN-Arg-NAME: 33 ± 6 mg/24h). Die Gabe von Molsidomin (GN-Molsi: 14 ± 2 mg/24h) erreichte eine Abnahme der Proteinurie, die in der ANOVA-Testung jedoch keine Signifikanz zeigte.

Abb. 23: Protokoll 2: Effekte auf die Proteinurie; Behandlung mit L-Arginin
(-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. P=NS GN-Molsi vs. GN, GN-Arg, GN-Arg-NAME (ANOVA)

3.2.7.1  NO2‾/NO3‾ im Plasma

↓47

Auch zwölf Tage nach Induktion der Glomerulonephritis zeigte sich signifikanter Effekt auf die Plasma NOx-Produktion. Die gesunden Kontrolltiere (Kontrolle) zeigten 41,2 ± 2,5 nmol/ml, während auch bei den unbehandelten nephritischen Tieren 42,2 ± 2,9 nmol/ml gemessen wurden. Auch bei der Gabe von L-Arginin (GN-Arg: 41,6 ± 2,4 nmol/ml) oder kombiniert mit L-NAME (GN-Arg-NAME: 44,7 ± 1,6 nmol/ml) zeigten sich keine signifikanten Unterschiede (P=NS vs. GN und Kontrolle). Im Gegensatz dazu wurde auch hier durch die NO-Donation via Molsidomin (GN-Molsi) ein signifikanter Anstieg der NOx-Produktion auf 65,7 ± 8,2 nmol/ml gemessen werden.

Abb. 24: Protokoll 2: Effekte auf die NOx-Spiegel im Plasma; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN) Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. **P < 0,01 vs. GN

3.2.7.2  NO2‾/NO3‾ im Urin

Auch auf die NOx-Spiegel im Urin wurde allein durch Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis keine signifikanter Effekt nachgewiesen. Hier zeigten die gesunden Kontrolltiere (Kontrolle) 12,3 ± 0,45 µmol/24h und die nephritischen Tieren 11,6 ± 0,98 µmol/24h. Nach Gabe von L-Arginin (GN-Arg: 14,71 ± 1,92 µmol/24h) und auch L-Arginin kombiniert mit L-NAME (GN-Arg-NAME: 12,34 ± 2,0 µmol/24h) wurden keine signifikanten Unterschiede gemessen (P=NS vs. GN und Kontrolle). Die Tiere mit NO-Donation via Molsidomin (GN-Molsi) dagegen zeigten einen signifikanten Anstieg der NOx-Produktion auf 32,39 ± 5,07 µmol/24h.

↓48

Abb. 25: Protokoll 2: Effekte auf die NOx-Spiegel im Urin; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. **P < 0,01 vs. GN

3.3 Zusammenfassung der Ergebnisse

Zusammenfassend lässt sich über die Auswertung beider Versuchsprotokolle sagen, dass die Gabe der Aminosäure L-Arginin und auch die NO-Donation mit Molsidomin einen günstigen Effekt auf das Krankheitsgeschehen im Rahmen der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis hat. Es zeigten sich sowohl sieben Tage (der Matrixexpansionsphase der Glomerulonephritis) als auch in der beginnenden Ausheilungsphase der Erkrankung (zwölf Tage) nach Induktion der Glomerulonephritis signifikante Reduktionen der Krankheitsparameter TGF-ß, Fibronektin und PAI-1. Auch die histologische Auswertung zeigte signifikante Veränderungen über eine positive Beeinflussung des Krankheitsgeschehens. Der Einfluss auf die TGF-β-Überexpression lässt sich anhand des morphologischen Parameters des glomerulären Matrixgehalts nachweisen, der in beiden Protokollen durch NO-Donation und auch L-Arginin-Supplemetation reduziert wurde.

Im Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass diese positiven Effekte durch L-Arginin-Gabe und gleichzeitiger Blockade der NO-Synthese mit L-NAME aufgehoben wurden. Die gemessenen Konzentration der Fibrosemarker TGF-ß, Fibronektin und PAI-1 näherten sich denen der unbehandelten, nephritischen Tiere an. Das Gleiche zeigte sich in der glomerulären Matrixexpansion. Auch hier stieg der Matrixgehalt auf ähnliche Werte wie die der unbehandelten nephritischen Tiere.

↓49

In beiden Versuchsprotkollen zeigte sich bei den nephritischen Tieren eine deutlich erhöhte Proteinausscheidung im Vergleich zu den gesunden Kontrolltieren. Dies spricht für die erfolgreiche Krankheitsinduktion. In der Sieben-Tage-Nephritis (Protokoll 1) fanden sich keine Unterschiede in den behandelten Tiergruppen. In Protokoll 2 (zwölf Tage nach Induktion der Glomerulonephritis) wurde eine erniedrigte Proteinurie der Gruppe, die eine NO-Donation erhielt, festgestellt. In der ANOVA-Testung zeigte sich hier jedoch keine Signifikanz zu den anderen nephritischen Behandlungsgruppen.

Die Daten zeigten desweiteren, dass TGF-β ein reproduzierbarer und sensitiver Marker für die Matrixakkumulation und damit für das gesamte Krankheitsgeschehen ist. Eine erfolgreiche Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis ist am 3,4-fachen Anstieg (Protokoll 1) und am 4,5-fachen Anstieg (Protokoll 2) des TGF-β-Spiegels zu erkennen. Damit ist eine deutliche Unterscheidung der kranken von gesunden Tieren möglich und antifibrotische Effekte einer zu untersuchenden Therapie sind klar erkennbar. Dieser Sachverhalt wird durch die Ergebnisse der Positivkontrolle hervorgehoben. Auch der Einfluss von NO auf die glomeruläre TGF-ß-Synthese in vitro konnte eine signifikante, dosisabhängige Reduktion dieses Zytokins bewirken und damit auf einen direkten Zusammenhang zwischen NO und TGF-ß-Produktion hinweisen. Die Ergebnisse der glomerulären mRNA-Expression (Protokoll 1) der Krankheitsparameter TGF-ß, Fibronektin und PAI-1 unterstreichen die in Zellkultur und Histologie gefundenen Ergebnisse. Die signifikant erhöhten Spiegel der endogenen NO-Produktion (NOx-Spiegel) in Blut und Plasma weisen auf eine erfolgreiche NO-Donation mit Molsidomin hin.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
04.10.2006