1 Einleitung

• 1.1  Epidemiologie der chronischen Niereninsuffizienz

• 1.2  Molekulare Mechanismen bei der chronischen Glomerulonephritis

  • 1.2.1  Nierenfibrose als überschießende Wundheilung

  • 1.2.2 Therapieansätze bei fibrotischen Nierenerkrankungen

  • 1.2.3 Transforming growth factor ß und seine Rolle in der Nierenfibrose

  • 1.2.4 Das L-Arginin/NO-System

    • 1.2.4.1 Die Aminosäure L-Arginin und ihre Stoffwechselwege

    • 1.2.4.2  Stickoxid – ein „ambivalentes“ Molekül

    • 1.2.4.3 Die NO-Synthasen: NOS I (neuronale NO-Synthase), NOS II (induzierbare NO-Synthase) und NOS III (endotheliale NO-Synthase)

• 1.3  Modell der– Anti-Thy-1-Glomerulonephritis der Ratte

• 1.4 Fragestellung

2  Material und Methoden

• 2.1  Materialien

• 2.2 Tierversuch

  • 2.2.1  Tiere und Tierhaltung

  • 2.2.2 Die Anti-Thy-1-Glomerulonephritis – Herstellung des Antikörpers OX-7

  • 2.2.3 Aufreinigung des Kulturüberstandes

  • 2.2.4 Induktion der Glomerulonephritis

• 2.3 Futter

  • 2.3.1  Wirkstoffe

    • 2.3.1.1 L-Arginin

    • 2.3.1.2 Molsidomin

    • 2.3.1.3 N-ω-Nitro-L-Arginin-Methyl-Ester (L-NAME)

  • 2.3.2 Wirkstoffzubereitung

• 2.4 Studienprotokolle

  • 2.4.1  Protokoll 1 – Effekte der Behandlung mit L-Arginin, Molsidomin und L-Arginin + L-NAME sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis

  • 2.4.2 Protokoll 2 – Effekte der Behandlung mit L-Arginin, Molsidomin und L-Arginin + L-NAME zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis

• 2.5 Versuchsparameter

  • 2.5.1  Messung des systolischen Blutdrucks

  • 2.5.2 Urinsammlung

  • 2.5.3  Entnahme der Nieren

  • 2.5.4 Aufarbeitung der Nieren, Isolation der Glomeruli für die Zellkultur

  • 2.5.5 Zellkultur

• 2.6 Messung der Krankheitsparameter

  • 2.6.1  Histologie

    • 2.6.1.1 Einbettung und Anfertigung der histologischen Schnitte

    • 2.6.1.2 Histologische Färbungen

      • 2.6.1.2.1 PAS-Färbung

      • 2.6.1.2.2 Immunhistochemische Färbung des Zytokins TGF-ß1

    • 2.6.1.3 Histologische Auswertung

  • 2.6.2 ELISA – Enzym Linked Immuno Sorbent Assay

    • 2.6.2.1  Transforming growth factor-ß ELISA

    • 2.6.2.2 Fibronektin ELISA

    • 2.6.2.3 Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 ELISA

  • 2.6.3 Proteinurie

  • 2.6.4 Glomeruläre messenger-RNA-Expression von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1

    • 2.6.4.1 Isolation der glomerulären RNA

    • 2.6.4.2 Bestimmung des RNA-Gehaltes und der Qualität

      • 2.6.4.2.1 Gelelektrophorese

  • 2.6.5 Konzentrationsmessung der RNA mittels Spektrometer

  • 2.6.6  RT-PCR

    • 2.6.6.1  Reverse Transkriptase-Reaktionen

    • 2.6.6.2 PCR

• 2.7 Nitrat/Nitrit-Messung (Griess-Assay)

• 2.8 Effekte des NO auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion in vitro

• 2.9  Statistische Auswertung

3  Ergebnisse

• 3.1  Protokoll 1 Effekte der Behandlung mit L-Arginin, Molsidomin und L-Arginin + L-NAME sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis

  • 3.1.1  Gewichtsverhalten

  • 3.1.2 Aufgenommene Dosen von L-Arginin, Molsidomin und L-NAME

    • 3.1.2.1 L-Arginin

    • 3.1.2.2  L-NAME

    • 3.1.2.3 Molsidomin

  • 3.1.3  Systolischer Blutdruck

  • 3.1.4 Glomerulärer Matrixgehalt

  • 3.1.5 Glomeruläre TGF-ß-Produktion

  • 3.1.6  Glomeruläre Fibronektin-Produktion

  • 3.1.7  Glomeruläre PAI-1-Produktion

  • 3.1.8  Proteinurie

  • 3.1.9 mRNA-Expression von TGF-ß1, Fibronektin und PAI-1

    • 3.1.9.1 Glomeruläre mRNA-Expression von TGF-ß1

    • 3.1.9.2  Glomeruläre mRNA-Expression von Fibronektin

    • 3.1.9.3  Glomeruläre mRNA-Expression von PAI-1

  • 3.1.10  NO2‾/NO3‾ im Plasma

  • 3.1.11 NO2‾/NO3‾ im Urin

  • 3.1.12  Effekte von NO auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion in vitro

    • 3.1.12.1  Effekt von NO auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion gesunder Kontrolltiere in vitro

    • 3.1.12.2  Effekt von NO auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion nephritischer Tiere sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis in vitro

  • 3.1.13  Immunhistochemische Färbung von TGF-ß1-Protein sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis

• 3.2  Protokoll 2 Effekte der Behandlung mit L-Arginin, Molsidomin und L-Arginin + L-NAME zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis

  • 3.2.1  Gewichtsverhalten

  • 3.2.2 Aufgenommene Dosen von L-Arginin, Molsidomin und L-NAME

    • 3.2.2.1 L-Arginin

    • 3.2.2.2  L-NAME

    • 3.2.2.3 Molsidomin

  • 3.2.3  Glomerulärer Matrixgehalt

  • 3.2.4  Glomeruläre TGF-ß-Produktion

  • 3.2.5  Glomeruläre Fibronektin- Produktion

  • 3.2.6  Glomeruläre PAI-1-Produktion

  • 3.2.7  Proteinurie

    • 3.2.7.1  NO2‾/NO3‾ im Plasma

    • 3.2.7.2  NO2‾/NO3‾ im Urin

• 3.3 Zusammenfassung der Ergebnisse

4  Diskussion

• 4.1  Methodenkritik

  • 4.1.1  Tiermodelle

  • 4.1.2  TGF-ß-Expression als zentraler Parameter für die Fibroseaktivität

  • 4.1.3 Weitere Parameter zur Messung der Fibroseaktivität

• 4.2  Wirkung der L-Arginin-Gabe, der NO-Donation und der Blockade der NO-Synthese auf den Blutdruck

• 4.3  Wirkung der pharmakologischen Intervention in den L-Arginin/NO-Stoffwechsel auf die Expression der Fibrosemarker TGF-ß, Fibronektin und PAI-1 sowie auf die Matrixexpansion

  • 4.3.1  Effekte der diätetischen L-Arginin-Zufuhr

  • 4.3.2 Effekte der diätetischen L-Arginin-Zufuhr unter gleichzeitiger Hemmung der NO-Synthase mit L-NAME

  • 4.3.3 Effekte der NO-Donation mit Molsidomin

• 4.4 Effekte auf die NOx-Konzentrationen in Blutplasma und Urin

• 4.5 TGF-ß und NO

• 4.6 Proteinurie

• 4.7 L-Arginin – eine Aminosäure mit gegensätzlichen Wirkungen

5  Zusammenfassung

6. Literaturverzeichnis

7. Erklärung an Eides Statt

8. Publikationsverzeichnis

Danksagung

Tab. 1: Zusammensetzung der Zuchtdiät 1311 für Ratten der Firma Altromin, Lage

Tab. 2: täglich verabreichte Dosis der Wirkstoffe L-Arginin, Molsdomin und L-NAME in mg

Tab. 3: Protokoll 1/Protokoll 2; Aufteilung der Tiere in die verschieden Therapiegruppen

Tab. 4: PCR-Protokolle für GAPDH, TGF-ß, Fibronektin und PAI-1: Sense/Antisense-Sequenzen, Temperaturprofile und Zykluslängen

Tab. 5: Mittleres Körpergewicht in g der Gruppen in Versuchsprotokoll 1; In der ANOVA-Prozedur zeigten sich keine signifikanten Unterschiede bei den Gewichten der einzelnen Gruppen. P=NS für alle Gruppen

Tab. 6: Mittleres Körpergewicht in g der Gruppen in Versuchsprotokoll 2; In der ANOVA-Prozedur zeigten sich keine signifikanten Unterschiede bei den Gewichten der einzelnen Gruppen. P=NS für alle Gruppen (ANOVA)

Abb. 1: Formel für die Berechnung der Proteinurie in mg/24h

Abb. 2: Formel für die Berechnung des RNA-Konzentration in µg/ml

Abb. 3: Protokoll 1: Dosis der diätetischen L-Arginin-Zufuhr in mg/die; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name  (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. ***P< 0,001 vs. Kontrolle, GN und GN-Molsi

Abb. 4: Protokoll 1: Effekte der Behandlung auf den systolischen Blutdruck; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name  (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion.

Abb. 5: Protokoll 1: Effekte auf den glomerulären Matrixgehalt; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. * P < 0.05 vs. GN, ** P < 0,01 vs. GN

Abb. 6: Protokoll 1: Effekte auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. *** P < 0.001 vs. GN

Abb. 7: Protokoll 1: Effekte auf die glomeruläre Fibronektin-Produktion; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name  (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. *** P < 0.001 vs. GN

Abb. 8: Protokoll 1: Effekte auf die glomeruläre PAI-1-Produktion; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. * P < 0.05 vs. GN

Abb. 9: Protokoll 1: Effekte auf die Proteinurie; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. P=NS GN vs. GN-Arg, GN-Arg-NAME, GN-Molsi (ANOVA)

Abb. 10: Protokoll 1: Effekte auf die mRNA-Expression von TGF-ß1 relativ zur mRNA-Expression von housekeeping gene GAPDH; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. ***P < 0,001 vs. GN

Abb. 11: Protokoll 1: Effekte auf die mRNA-Expression von Fibronektin relativ zur mRNA-Expression von Housekeeping gene GAPDH; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. ***P < 0,001 vs. GN

Abb. 12: Protokoll 1: Effekte auf die mRNA-Expression von PAI-1 relativ zur mRNA-Expression von Housekeeping gene GAPDH; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. ***P < 0,001 vs. GN

Abb. 13: Protokoll 1: Effekte auf die NOx-Spiegel im Plasma; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN) Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. *P < 0,05 vs. GN

Abb. 14: Protokoll 1: Effekte auf die NOx-Spiegel im Urin; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. **P < 0,01 vs. GN

Abb. 15: Protokoll 1: Effekte der NO-Donation mittels DETA NONOate in ansteigenden Konzentrationen auf die TGF-ß-Produktion in vitro auf kultivierte Glomeruli gesunder Tiere. Die Kontrolle erhielt kein DETA NONOate. ***P < 0,001 vs. GN

Abb. 16: Protokoll 1: Effekte der NO-Donation mittels DETA NONOate in ansteigenden Konzentrationen auf die TGF-ß-Produktion in vitro auf kultivierte Glomeruli nephritischer Tiere sieben Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephrits. Die Kontrolle erhielt kein DETA NONOate. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 vs. GN

Abb. 17: Charakteristische immunhistochemische Färbung des renalen TGF-ß1 Proteins sieben Tage nach Induktion der Glomerulonephritis. (A) zeigt die Färbung bei normalen, gesunden Kontrolltieren (Kontrolle). Bild (B) zeigt die TGF-ß1-Färbung bei unbehandelten nephritischen Tieren (GN), (C) die Gabe von L-Arginin (GN-Arg), (D) die kombinierte Behandlung L-Arginin und L-NAME (GN-Arg-NAME) und (E) die NO-Donation mit Molsidomin (GN-Molsi).

Abb. 18: Protokoll 2: Dosis der diätetischen L-Arginin-Zufuhr in mg/die; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name  (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion.L-Argininaufnahme der Gruppen in Versuchsprotokoll 2; ***P< 0,001 vs. Kontrolle, GN und GN-Molsi

Abb. 19: Protokoll 2: Effekte auf den glomerulären Matrixgehalt; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. * P < 0.05 vs. GN, ** P < 0,01 vs. GN

Abb. 20: Protokoll 2: Effekte auf die glomeruläre TGF-ß-Produktion; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name  (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. *** P < 0.001 vs. GN

Abb. 21: Protokoll 2: Effekte auf die glomeruläre Fibronektin-Produktion; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name  (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. ** P < 0.01 vs. GN

Abb. 22: Protokoll 2: Effekte auf die glomeruläre PAI-1-Produktion; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. * P < 0.05 vs. GN

Abb. 23: Protokoll 2: Effekte auf die Proteinurie; Behandlung mit L-Arginin  (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. P=NS GN-Molsi vs. GN, GN-Arg, GN-Arg-NAME (ANOVA)

Abb. 24: Protokoll 2: Effekte auf die NOx-Spiegel im Plasma; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN) Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. **P < 0,01 vs. GN

Abb. 25: Protokoll 2: Effekte auf die NOx-Spiegel im Urin; Behandlung mit L-Arginin (-Arg), Molsidomin (-Molsi) und L-Arginin + L-Name (-Arg-NAME) zwölf Tage nach Induktion der Anti-Thy-1-Glomerulonephritis (GN). Die Kontrolle erhielt eine PBS-Injektion. Die Behandlung begann 24 Stunden nach der Krankheitsinduktion. **P < 0,01 vs. GN