1 Einleitung

1.1 Die Kornea

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Das Auge ist das wichtigste Sinnesorgan des Menschen. Über neunzig Prozent aller Sinneswahrnehmungen werden über die Augen aufgenommen. Die Kornea bildet die sichtbare äußere Grenze zur Außenwelt und nimmt ein Sechstel der äußeren Augenoberfläche ein. Neben ihrer lichtbrechenden Funktion, die sie als transparente und avaskuläre Struktur erfüllt, stellt sie gleichzeitig eine mechanisch stabile und chemisch impermeable Barriere zur Außenwelt dar. Der Sauerstoffbedarf der Korneazellen wird zum größten Teil aus der Umgebung über die vordere Augenoberfläche gedeckt. Ihre Versorgung mit Nährstoffen erfolgt über den Tränenfilm und das Kammerwasser in der Vorderkammer des Auges. Die humane Kornea ist aus fünf „Schichten“ aufgebaut: dem Epithel an der äußeren Oberfläche, seiner Basalmembran (Bowman Schicht), dem Stroma, der Basalmembran des Endothels (Descemet Membran) und dem Endothel selbst, als innerer Oberfläche. Einige der Schutzfunktionen und optischen Eigenschaften der Kornea werden durch angrenzende Strukturen bestimmt, z.B. Bindehaut und Tränendrüsen, deren Sekrete durch den Lidschlag über die Kornea verteilt werden.

Abbildung 1: Schematischer Aufbau der humanen Kornea.

1.1.1 Das korneale Endothel

Im Gegensatz zu Epithel und Stroma stellt das korneale Endothel eine einzellige Schicht dar. Es weist Zellen mit einer typischen hexagonalen Form auf (Abb.2). Das korneale Endothel nimmt eine Schlüsselfunktion für die Physiologie und Transparenz der Kornea ein. Es arbeitet als aktive und passive Barriere zwischen der Vorderkammer des Auges und dem kornealen Stroma.

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Abbildung 2 : Querschnitt durch eine Kornea und spekularmikroskopische Ansicht des kornealen Endothels (aus Wolff’s Anatomy, 8th Edition, 1997). BZ=Bowmann-Schicht, K=Keratozyten, DM=Descemet Membran, En=Endothel .

Das Endothel ist für die Funktion der Kornea essentiell. Normalerweise ist es durch seine privilegierte Lage in der Vorderkammer des Auges geschützt. Es stellt jedoch eine empfindliche Zellschicht dar, deren Unversehrtheit und Lebensfähigkeit für den Erfolg jedes intraokulären Prozesses aufrechterhalten werden muss. Trotz der entscheidenden Bedeutung dieser Zellschicht, ist seine regenerative Kapazität stark eingeschränkt. Die Zellen des humanen kornealen Endothels sind von Geburt an amitotisch. Im Gegensatz zu vaskulären Endothelzellen, die eine rasche Zellteilung aufweisen, werden korneale Endothelzellverluste primär durch Vergrößerung der umliegenden Zellen kompensiert, um das Eindringen von Kammerwasser ins Stroma zu verhindern und so seine Transparenz aufrechtzuerhalten (Joyce, 2003). Sie besitzen außerdem die Fähigkeit, in Bereiche von Zellverlusten einzuwandern. Vermutlich wird die normale korneale Zellfunktion aufrechterhalten, solange die Endothelzellen eine konfluente Zellschicht auf der Descemet Membran ausbilden können.
Dies wird z.B. während des postnatalen Wachstums der Kornea, durch normalen Zellverlust im Zuge des Alterungsprozesses und nach intraokulären Operationen und Traumata erforderlich.
In vitro-Studien mit humanen kornealen Endothelzellen sind aufgrund ihrer begrenzten Passagierbarkeit, dem Verlust der charakteristischen hexagonalen Morphologie und der notwendigen Zugabe verschiedener exogener Wachstumsfaktoren ins Kulturmedium, relativ aufwändig und schwierig durchzuführen (Engelmann und Böhnke, 1990). Eine Möglichkeit, diese Schwierigkeiten zu umgehen, ist die Nutzung immortalisierter Zelllinien, welche ausreichend Zellmaterial und konstante Zelleigenschaften garantieren (Aboalchamat et al., 1999, Bednarz et al., 2000).

Das korneale Endothel steht zudem im Mittelpunkt der Problematik der Hornhauttransplantation. So ist eine Fehlfunktion dieser Zellschicht ein Hauptgrund für korneale Transplantationen. Ebenso stellt das Hornhautendothel als kritische Struktur des Organs auch die Zielstruktur akuter und chronisch verlaufender Immunreaktionen dar, die für 10-50% der Transplantatverluste verantwortlich sind.

1.2 Keratoplastik

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Die Hornhauttransplantation (Keratoplastik) stellt die mit Abstand häufigste Transplantation humanen Gewebes dar (in den USA ca. 50 000/Jahr) (Eye Bank Association of Amerika, 2002). Sie bietet die Möglichkeit, den Verlust der Sehkraft, der durch Schäden der Kornea verursacht wird, durch einen Austausch des Gewebes zu behandeln (Larkin, 1994). Solche Schäden umfassen angeborene, traumatische und infektiöse Hornhautveränderungen, zu denen v.a. auch Beeinträchtigungen der Funktion des Hornhautendothels gehören. Nach Angaben der WHO ist davon auszugehen, dass bei einer Häufigkeit von 38 Mio. Erblindungen jede vierte auf Hornhauttrübungen zurückgeführt werden muss (Thylefors et al., 1995).
Die Keratoplastik nimmt aufgrund des Immunprivilegs von Vorderkammer und Kornea eine Sonderrolle in der Transplantationsmedizin ein (Niederkorn, 1999). Unter dem Immunprivileg versteht man die beschränkte Reaktionsfähigkeit des Immunsystem auf Fremd-Antigene in Kornea und Vorderkammer. Aus diesem Grund können Hornhauttransplantationen auch ohne systemische Immunsuppression oder MHC-Übereinstimmung erfolgreich sein. Für das Immunprivileg sind verschiedenste Mechanismen verantwortlich. Dabei kann es einerseits zu Ignoranz und/oder Isolation des Fremd-Antigens und andererseits zu einer aktiven Suppression oder Modulation der Immunantwort kommen. Ersteres beruht auf dem Mangel an Blutgefäßen, schwacher lymphatischer Drainage und der geringeren Menge an MHC-II+ Antigen-präsentierenden Zellen (APZ), z.B. dendritischen Zellen, in der zentralen Kornea (Niederkorn, 1999). Aktive Suppression und Veränderung der Immunantwort in der Kornea werden durch eine Reihe von Mechanismen verursacht. Zu diesen gehören die Expression von Fas-Ligand (CD95L) auf Strukturen der Vorderkammer (korneale Endothelzellen), die mit Fas (CD95)-exprimierenden aktivierten Lymphozyten interagieren und in diesen Apoptose induzieren (Griffith et al., 1995, Yamagami et al., 1997, Stuart et al., 1997). Die aktive Suppression der Immunantwort wird als „Anterior chamber-associated immune deviation“, kurz ACAID bezeichnet (Niederkorn, 1999). ACAID beschreibt die experimentelle Beobachtung, dass ein in die Vorderkammer injiziertes Antigen, zur Entwicklung einer systemischen Reduktion der zellulären Antwort führt, wenn dieses Antigen erneut verabreicht wird. Es ist jedoch wichtig, das Immunprivileg als einen relativen und keinen absoluten Schutzmechanismus zu betrachten (Williams und Coster, 1997). So ist es auch hier möglich, dass sich Immunreaktionen entwickeln, die nach Transplantationen zu einer Abstoßungsrate von 30 % im Langzeitverlauf führen können (Alldredge und Krachmer, 1981, Pleyer et al., 1992, Reinhard et al., 1997). Zudem weisen Patienten mit Risikofaktoren, wie Vaskularisation der Hornhaut und Problemen der okulären Oberfläche, eine ungünstige Prognose für das Transplantatüberleben auf, und der Anteil der Transplantatverluste durch Immunreaktionen kann sich hier auf 60 % erhöhen (Stübiger et al., 1995). Zusätzliche Probleme werden durch einen Mangel an geeigneten Spenderhornhäuten verursacht. Zudem wirken sich Endothelzellverluste während der Hornhautkonservierung vor Transplantation und im Nachbeobachtungszeitraum ungünstig auf die Prognose aus. Im postoperativen Verlauf sind akute und chronische Immunreaktionen die wichtigsten Komplikationen nach Hornhauttransplantation. Aus diesem Grund sind neue Ansätze der Prävention der Immunreaktion nach Keratoplastik unter Berücksichtigung neuer Erkenntnisse über den Verlauf dieser Reaktionen notwendig.

1.2.1 Problem: Hornhautkonservierung vor Keratoplastik

Die erfolgreiche Transplantation einer Spenderhornhaut ist in erster Linie von der Vitalität des Spenderendothels abhängig, da die Transparenz der Hornhaut und damit ihre Funktion als optisches Medium von der Unversehrtheit dieses Endothels bestimmt wird. Die Technik der Organkultur, wie sie in Europa gehandhabt wird, ermöglicht bei 35°C Aufbewahrungszeiten der Spenderhornhaut von bis zu 4 Wochen. Andere Methoden der Hornhautkonservierung, wie die in Amerika gängige Lagerung bei 4°C, erlauben dagegen eine Lagerung der Transplantate für nur 4 Tage (Frueh und Böhnke, 1995).

Allerdings kommt es während der Konservierung der Kornea vor einer Transplantation oftmals zu einem z.T. erheblichen, vermutlich Apoptose-induzierten Verlust an vitalen Endothelzellen. Der normale physiologische Verlust dieser Zellen liegt bei ca. 0,6 % pro Jahr (Bourne et al., 1997). Obwohl die Vitalität des organkultivierten Spenderendothels im Vergleich zu anderen Konservierungsmethoden länger erhalten bleibt, ist nach einer Organkultur von 3-4 Wochen mit einem Zellverlust von etwa 10-20 % zu rechnen. Die Dichte des Endothels unterschreitet dann oftmals den Qualitätsstandard von 2500 Zellen/mm2, sodass die betreffenden Hornhäute für eine Transplantation nicht mehr verwendet werden können (Redbrake et al., 1999, Albon et al., 2000).

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Es besteht somit großes Interesse, Methoden zu finden, welche die Vitalität des Hornhautendothels während der Konservierung erhalten können. In diesem Zusammenhang stellt der Einsatz von Wachstumsfaktoren einen interessanten Ansatz dar (siehe 1.7).

1.2.2 Problem: Abstoßungsreaktionen nach Keratoplastik

Trotz einer intensivierten immunmodulatorischen Therapie ist bei Risikopatienten mit Abstoßungsreaktionen von bis zu 60 % der Transplantate zu rechnen. Diese Immunprozesse gefährden das Operationsergebnis und können zum Funktionsverlust der transplantierten Hornhaut führen (Pleyer et al., 2001a).

Die Abstoßung kornealer Transplantate kann an drei morphologischen Strukturen erfolgen: Epithel, Stroma und Endothel (Larkin, 1994). Die epitheliale Abstoßung betrifft die äußere Schicht des Transplantats; das Epithel an der Außenseite der Kornea verfügt jedoch über die Fähigkeit sich zu regenerieren und kann in einigen Fällen von Empfängerzellen ersetzt werden. Bei der stromalen Rejektion wandern Leukozyten in das korneale Stroma ein. Diese Form der Abstoßung tritt jedoch nur sehr selten auf. Aus diesem Grund spielen epitheliale und stromale Rejektionen klinisch nur eine untergeordnete Rolle (Larkin, 1994).

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Die häufigste und funktionell wichtigste Form der Abstoßung kornealer Transplantate tritt am Endothel auf. In diesem Fall gelangen Leukozyten vermutlich durch die Vorderkammer zur inneren Oberfläche des Transplantats und zerstören seine Endothelzellschicht. Da das Endothel eine nicht-replikationsfähige Zellschicht ist, können diese Schäden nur begrenzt, durch Einwanderung und Vergrößerung von überlebenden Endothelzellen, ausgeglichen werden. Wird dabei eine kritische Zellzahl unterschritten, führt dies zu einem Eindringen von Kammerwasser ins Stroma und damit zu einer Quellung und Trübung des Transplantats.

Die immunologischen Mechanismen, die der Abstoßung kornealer Transplantate zugrunde liegen, wurden bislang in Modellen von Kaninchen, sowie Maus und Ratte untersucht. Bei der akuten Transplantatabstoßung sind T-Lymphozyten entscheidend an den immunpathologischen Effektormechanismen beteiligt (Abb. 3) (Callanan et al., 1988, Pleyer et al., 1995, Wackenheim-Urlacher, 1995, Niederkorn, 1999).

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Induktion einer Immunantwort (nach Pleyer und Ritter, 2003). T-Zellen erkennen ein Antigen und werden durch Interaktionen zwischen TCR-MHC (Signal 1) und ko-stimulatorischen Molekülen (CD28-B7, CD40L-CD40) (Signal 2) aktiviert. Aktivierte T-Zellen sekretieren Zytokine, die wiederum Makrophagen, B-Zellen, zytotoxische T-Zellen und natürliche Killerzellen aktivieren können. APZ=Antigen-präsentierende Zelle, TH=T-Helferzelle, TCR=T-Zell-Rezeptor, IL-2=Interleukin-2; IL-2R=IL-2-Rezeptor.

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Bereits in der frühen afferenten Phase der Immunreaktion können Makrophagen und T-Lymphozyten im Transplantat nachgewiesen werden (Nishi et al., 1990, Holland et al., 1991). Dieser initialen Sensibilisierungsphase schließt sich die Proliferation immunkompetenter Zellen an. Botenstoffe (Zytokine), die von diesen Zellen freigesetzt werden, fördern den Prozess. Pro-inflammatorische Zytokine (IFN-γ, IL-2, TNF-α) spielen eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der akuten Transplantatabstoßung. Dies konnte sowohl im Hornhautgewebe (Transplantat) als auch im Kammerwasser der Transplantatempfänger nachgewiesen werden. Schließlich erfolgt die Infiltration und Zerstörung des Transplantats (efferentes Stadium) (Pleyer und Thiel, 1995, Pleyer et al., 1998). Zu den Entzündungszellen, die nach Keratoplastik im Kammerwasser nachweisbar sind, gehören auch natürliche Killerzellen (NK-Zellen). Möglicherweise spielen auch diese Zellen als Effektoren im Abstoßungsprozess (efferentes Stadium) eine Rolle (Claerhout, 2003).

Die akute Abstoßung findet bei Mäusen innerhalb von 2-6 Wochen nach Transplantation statt und ist durch starke stromale Trübungen gekennzeichnet, die auf Schäden bzw. Verlust der Endothelfunktion zurückzuführen sind. In der normalen Kornea sind keine MHC-II+ tragenden dendritischen Langerhans Zellen (LHZ) vorhanden, die transplantierte Kornea wird jedoch schnell von diesen Zellen infiltriert. Erfolge bei der Verhinderung oder Verzögerung der Abstoßung konnten durch Strategien erzielt werden, die ein Einwandern von dendritischen Zellen (DZ) und Makrophagen (MØ) des Empfängers in das Transplantat verhindern (Dana et al., 1997, Slegers et al., 2000, Slegers et al., 2003).

1.2.3 Prävention der Immunreaktionen nach Keratoplastik

Zur Prävention der Immunreaktion und um diese Faktoren möglichst in den Auswirkungen zu begrenzen, werden klinisch derzeit zwei wesentliche Vorgehensweisen eingesetzt.

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Hier sind die Erfahrungen der Transplantationsmedizin nach Übertragung solider Organe eingegangen. So ist durch die Einführung von immunmodulatorisch wirksamen Pharmaka wie Cyclosporin A, FK 506 oder in jüngerer Zeit von Mycophenolat Mofetil ein wichtiger Beitrag auch für die Therapie nach Hornhauttransplantation geleistet worden (Pleyer et al., 1998). Allerdings sind auch unter Verwendung dieser Maßnahmen Allograftreaktionen zu beobachten.

1.2.4 Neue Ansätze zur Prävention von Abstoßungsreaktionen kornealer Transplantate

Der Endothelzellverlust, der im Zusammenhang mit Hornhauttransplantationen auftritt, hat seine Ursache zum einen in der Konservierung der Kornea vor Keratoplastik, zum anderen aber auch durch den Eingriff selbst, durch mechanische Beanspruchung und immunologische Prozesse (Gain et al., 2001). Neue Ansätze zur Verbesserung der Endothelvitalität vor Transplantation, die auch Gegenstand dieser Arbeit sind, befassen sich mit dem Einsatz von Wachstumsfaktoren zur Optimierung der Lagerungsbedingungen des Transplantats (Rieck et al., 2003). Dies beinhaltet auch die genetische Modifizierung von kornealen Endothelzellen durch zytoprotektive oder anti-apoptotische Gene, die einen Schutz dieser Zellen bei der Lagerung und der Allotransplantation vermitteln können. Andere derzeit aktuelle Ansätze befassen sich mit der Transplantation von Endothelzellen (Aboalchamat et al., 1999, Engelmann et al., 1999) oder Stammzellen auf die Spenderkornea oder mit der Suppression der T-Zellaktivierung durch Hemmung der Ko-Stimulation z.B. mit Hilfe von CTLA4-Ig (Comer et al., 2002).

1.2.5 Gentherapie zur Modulation des kornealen Endothels

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Die anatomischen und immunologischen Eigenheiten der Kornea stellen eine gute Voraussetzung für genetische Manipulationen dar. Insbesondere das korneale Endothel lässt sich problemlos sowohl mit viralen als auch mit nicht-viralen Vektoren transfizieren (Larkin et al., 1996). Durch die ex vivo-Kultivierung der Kornea ist ein gezielter Transfer des therapeutischen Gens in die Zielzellen möglich. Ein großer Vorteil dieser Anwendung liegt in der Vermeidung einer systemischen Applikation und der damit verbundenen unerwünschten Verbreitung des Vektors in den gesamten Organismus. Die exponierte Lage der Kornea ermöglicht darüber hinaus die Beurteilung des Behandlungserfolgs ohne zusätzlichen operativen Eingriff.

Heute gebräuchliche Gentransfervehikel sind vor allem virale und nicht-virale Vektoren, wobei an der Kornea insbesondere Adenoviren und Lipide zum Einsatz kommen.

1.2.5.1 Nicht-viraler Gentransfer mittels Lipiden

Vor allem kationische Lipide, stellen vielversprechende Gentransfer-Vehikel dar, die mit der negativ geladenen DNA Komplexe ausbilden. An verschiedenen Organen, wie z.B. Lunge, Haut und Gefäßendothelien, konnten kationische Lipide in vivo bereits vor einiger Zeit eingesetzt werden (Nabel et al. 1993).

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Die Liposomen können, als eine Sonderform der Lipide, aus Phospholipiden mit oder ohne Cholesterol in einer Größe von 20 nm - 10 µm hergestellt werden. Liposomen besitzen eine oder mehrere Lipid-Doppelschichten, die durch wässrige Kompartimente voneinander getrennt sind (Abb.4). Jede Lipid-Doppelschicht umschließt einen wässrigen Kern. Liposomen können diverse Substanzen und Chemikalien einschließen; hydrophile Agentien werden in wässrigen Regionen gelöst, während hydrophobe Substanzen mit der Lipid-Doppelschicht assoziiert sind.

Abbildung 4: Schematische Darstellung des Lipid-vermittelten Gentransfers und ein Querschnitt durch ein Liposom.

Der erfolgreiche lipid-vermittelte Gentransfer erfordert eine effiziente Aufnahme des genetischen Materials, selektive Bindung an die Zielzelle, die Übertragung ins Zytoplasma ohne lysosomale Degradation und eine nachfolgende Aufnahme in den Zellkern (Abb. 4).

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Die Zusammensetzung der Lipide und ihre damit verbundenen Eigenschaften üben den größten Einfluss auf den Prozess des Gentransfers aus.

Lipide stellen eine Alternative zum Gebrauch viraler Vektoren dar und verfügen über eine Vielzahl von Vorteilen. So sind sie relativ einfach zu handhaben, besitzen kaum immunogene Eigenschaften und sind daher für die wiederholte Anwendung geeignet. Ein weiterer Vorteil besteht in ihrer kommerziellen Verfügbarkeit. Nachteile des lipid-vermittelten Gentransfers liegen in der relativ geringen Transfektionseffizienz ebenso wie in einer starken Varianz aller Eigenschaften in Abhängigkeit vom Zelltyp (George et al., 2000, Pleyer und Dannowski, 2002).

1.2.5.2 Gentransfer mittels viraler Vektoren

Virale Vektoren besitzen sehr effiziente und spezifische Mechanismen zum Einschleusen von DNA in die Wirtszellen und wurden durch Entfernen ihrer pathogenen Effekte für die gefahrlose Anwendung im Menschen nutzbar gemacht. Das Problem dieser Vektoren ist jedoch, dass sich oft starke Immunantworten gegen ihre viralen Bestandteile herausbilden und so eine langfristige Expression der übertragenen Gene nicht immer möglich ist (Verma und Somia, 1997, Ritter et al., 2002, Olive et al., 2002).

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Die am häufigsten eingesetzten viralen Vektoren sind Retroviren und Adenoviren, aber auch Lentiviren und Adeno-assoziierte Viren kommen verstärkt zur Anwendung. Tabelle 1 fasst einige Eigenschaften verschiedener Gentransfervektoren zusammen.

Tabelle 1: Virale und nicht-virale Gentransfervektoren

Viral

Expression

Transduktion von

ruhenden Zellen

Immunogenität

Adenovirus

transient

ja

hoch

Retrovirus

stabil

nein

gering

Lentivirus

stabil

ja

gering

Herpes Simplex

Virus

transient

ja

hoch

Adeno-assoziiertes

Virus

stabil

ja

gering

Nicht-viral

Expression

Transduktion von

ruhenden Zellen

Immunogenität

Nackte DNA

transient

ja

gering

Liposomen

transient

ja

gering

DNA-Konjugat

transient

ja

gering

1.2.5.3 Adenovirale Vektoren

Adenoviren enthalten doppelsträngige, lineare DNA mit einer Größe von 36 bis 38 kb, an deren Enden sich invertierte Sequenzwiederholungen befinden. Diese Enden sind während der DNA-Replikation für die Initiation der Doppelstrangsynthese verantwortlich. Das Genom besteht aus fünf kodierenden Bereichen. Die Bereiche E1 bis E4 werden früh während der Infektion aktiviert, die Gruppe der spät exprimierten Gene (L) ist für die Synthese der viralen Strukturproteine verantwortlich.

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Abbildung 5: Adenoviruspartikel (nach Modrow & Falke, 1997)

Der adenovirale Infektionszyklus umfasst mehrere Schritte. Zunächst erfolgt die Adsorption des Viruspartikels an Zell-Oberflächenrezeptoren (CAR, Coxsackievirus und Adenovirus Rezeptor) (Bergelson et al., 1997). Dabei spielen sowohl die Fiberproteine als auch die Pentonproteine auf der Partikeloberfläche eine Rolle (Abb. 5). Letztere interagieren mit Oberflächenintegrinen der Wirtszelle (Huang et al., 1996). Die Aufnahme der Virus-Rezeptor-Komplexe in das Zytoplasma der Wirtszelle erfolgt über rezeptorvermittelte Endozytose. Unter Verlust der Fiber- und Pentonbasisproteine werden die Viren aus dem endozytotischen Vesikel entlassen und gelangen durch Bindung an Mikrotubuli zu den Kernporen. Der virale DNA-Protein-Komplex wird durch schrittweisen Kapsidabbau freigesetzt und in den Nukleus aufgenommen, wo über das terminale Protein die Assoziation mit der Kernmatrix erfolgt. Das Adenovirusgenom integriert nicht in das Wirtsgenom sondern liegt als episomale Einheit im Zellkern vor (Horwitz, 1990). Nach Transkription der frühen und späten Gene, Synthese der entsprechenden Proteine, DNA-Replikation und Morphogenese erfolgt die Freisetzung der neuen Virionen aus der an den Folgen der Infektion zerstörten Zelle.

1.2.5.4 Vor- und Nachteile adenoviraler Vektoren

Adenovirale Vektoren besitzen für den in vivo-Gentransfer eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen Vektoren. Sie sind in der Lage, sowohl sich teilende, als auch ruhende Zellen der verschiedensten Art mit hoher Effizienz in vitro und in vivo zu transduzieren, im Gegensatz zu retroviralen Vektoren, die nur sich teilende Zellen transduzieren können. Gerade bei ex vivo-Experimenten an der Kornea zeigten sich diese Vektoren als effizient (Larkin et al., 1996, Fehervari et al., 1997, Oral et al., 1997, Ritter et al., 1999a, Klebe et al., 2001). So konnten Larkin et al. (1996) und Fehervari et al. (1997) zeigen, dass Adenoviren fast ausschließlich die Endothelzellen der Kornea transduzieren. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass adenovirale Vektoren in hohen Titern (1011-1012 pfu/ml) zu gewinnen sind. Sie integrieren nicht in die Wirts-DNA, sondern replizieren als extrachromosomale Elemente im Zellkern der Wirtszelle, wodurch Insertionsmutationen vermieden werden (Verma & Somia, 1997, Kay et al., 2001). Durch die relativ einfache Manipulierbarkeit ihres Genoms ist es z.B. möglich, das Transgen unter die Kontrolle eines sehr starken Promotors zu setzen und es damit in großen Mengen zu exprimieren. Um adenovirale Vektoren relativ gefahrlos handhaben zu können, ist es üblich, die E1-Genregion der adenoviralen DNA durch das Transgen zu ersetzen. Dieser Bereich des adenoviralen Genoms wirkt auf die für die Virusreplikation verantwortliche E2-Region transaktivierend. Dadurch sind E1-deletierte rekombinante Adenoviren zwar zur Transduktion, jedoch nicht zur Replikation befähigt und können sich somit nicht unkontrolliert vermehren (Kolls et al., 1994). Die gezielte Virusvermehrung erfolgt in bestimmten Verpackungszelllinien in vitro (293 [Graham et al., 1977], 911 [Fallaux et al., 1996]), die die E1A- und E1B-Gene konstitutiv exprimieren (Abb. 6).
Der Hauptnachteil adenoviraler Vektoren liegt in der Immunantwort, die sie im Wirt induzieren. Dadurch ist die Expression des eingeführten Transgens nur transient und endet nach 3-4 Wochen. Die wiederholte Applikation der Vektoren gestaltet sich schwierig, da neben einer zellulären Immunantwort auch eine humorale Immunreaktion mit der Produktion von Antikörpern, die gegen das Adenoviruskapsid gerichtet sind, ausgelöst werden kann (Yang et al., 1994). Allerdings sollte dieser Umstand am Auge nur eine untergeordnete Rolle spielen, da es sich um ein immunprivilegiertes Organ handelt (Larkin et al., 1996) und eine systemische Anwendung durch ex vivo-Gentransfer vermieden werden kann.

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Abbildung 6: Schematische Darstellung der Herstellung replikationsdefizienter, rekombinanter adenoviraler Vektoren und der Transduktion einer Zielzelle mittels dieser Vektoren (nach Kay et al., 2001).

1.2.6 Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) als Kandidat für die Verbesserung der prä-operativen Ausgangssituation kornealer Transplantate

Wachstumsfaktoren sind körpereigene Polypeptide, die vielfältige Wirkungen auf die Differenzierung, Morphologie und Funktion von Zellen mesodermalen und neuroektodermalen Ursprungs ausüben. Die Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF-Familie) sind aus zahlreichen Geweben isoliert worden (Gospodarowicz et al., 1986, Houssaint et al., 1990). FGF beeinflusstwichtige Vorgänge auf zellulärer Ebene, wie Zellproliferation, Zelldifferenzierung und –morphologie (Gospodarowicz et al., 1986). In vitro-Studien zeigen, dass besonders der saure und der basische FGF (aFGF bzw. bFGF) die Wundheilung des Hornhautepithels und -endothels durch Stimulierung der Zellproliferation und –migration beschleunigen (Gospodarowicz et al., 1977, Gospodarowicz und Greenburg, 1979, Landshman et al., 1987, Assouline et al., 1989, Hoppenreijs et al., 1994).

aFGF und bFGF sind zwei eng miteinander verwandte Mitogene, die eine absolute Homologie von 55 % aufweisen (Esch et al, 1985). aFGF-mRNA, Protein und seine Rezeptoren finden sich in der Kornea in Epithel- und Endothelzellen, jedoch nicht in stromalen Keratozyten (Caruelle et al, 1989, Wilson et al., 1994, Lovicu et al. 1997). Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression von aFGF mit aktiver Migration in epithelialen Wundheilungsprozessen korreliert ist (Dabin und Courtois, 1991). In der Organkultur der humanen Hornhaut zeigte sich ebenfalls ein heilungsbeschleunigender Effekt von exogen zugegebenem bFGF nach Wundläsion (Schilling-Schön et al., 2000). Auch die Präsenz von endogenem bFGF in kornealen Endothelzellen spielt für die Migration dieser Zellen nach Wundläsion eine entscheidende Rolle. Erste Versuche weisen außerdem auf einen Apoptose-inhibierenden Effekt dieses Wachstumsfaktors hin. So konnte nach exogener Zugabe von bFGF die Qualität von Hornhauttransplantaten nach Langzeitlagerung in serumfreiem Medium verbessert werden (Rieck et al., 2003). Arbeiten an retinalen Pigmentepithelzellen lassen erwarten, dass aFGF eine noch stärkere zellprotektive Wirkung vermittelt, als bisher von bFGF erreicht wurde (Prof. Courtois, Paris, persönliche Mitteilung).

1.2.7 Modulation der immun-vermittelten Transplantatabstoßung

1.2.7.1 Das Th1-/Th2-„Paradigma“

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Zytokine sind lösliche Mediatoren, die eine zentrale Rolle bei der Regulation von Immunantworten spielen. CD4+ T-Zellen können je nach ihrer Zytokinsekretion und der nachfolgenden Effektorfunktion, z.B. in Th1- und Th2-Zellen unterteilt werden (Mosmann und Coffman, 1989, Swain, 1995). Das Überwiegen von Th1- oder Th2-Antworten kann Einfluss auf Infektions- und Autoimmunkrankheiten nehmen, aber auch auf den Verlauf von Transplantationen. So gibt es Studien, die belegen, dass eine Akzeptanz von Transplantaten mit der erhöhten Produktion von Th2-Zytokinen einhergeht (Takeuchi et al., 1992, Sayegh et al., 1995). Eine Transplantat-Abstoßung ist eng mit der Expression von Th1-Zytokinen verbunden, während Th2-Zytokine dabei nur in geringen Mengen oder gar nicht gefunden werden (Dallman et al., 1991). Auch bei der Abstoßung kornealer Transplantate handelt es sich um einen CD4+ Th1-vermittelten Prozess (Qian und Dana, 2001). In vivo führt die Depletion von CD4+ und nicht von CD8+ T-Zellen mit Hilfe monoklonaler Antikörper zu einem verlängerten Transplantatüberleben (He et al., 1991, Pleyer et al., 1995, Coupland et al., 1995). Zusätzlich zeigen Mäuse, deren CD4-Gen ausgeschaltet wurde, eine verminderte Fähigkeit zur Abstoßung von kornealen Transplantaten. Im Gegensatz dazu tritt bei Mäusen mit ausgeschaltetem CD8-Gen eine Abstoßungsrate auf, die der von Wildtyp-Mäusen entspricht (Yamada et al., 1999, Haskova et al., 2000, Yamada et al., 2001). Der Mechanismus, durch den korneale Allo-Transplantate abgestoßen werden, ist mit der Fähigkeit assoziiert, starke DTH-Antworten (Hypersensitivität des verzögerten Typs) auszubilden (Joo et al., 1995, Hedge und Niederkorn, 2000). Auch die Zytokine, die in der Kornea oder im Kammerwasser von abgestoßenen Transplantaten vorkommen, sind vom Th1-Typ (Yamagami et al., 1998, Sano et al., 1998, King et al., 2000).

Typische Th1-Zytokine wie IL-2 und IFN-γsind für Zell-vermittelte Immunreaktionen verantwortlich. Zu den Th2-Zytokinen zählen IL-4, IL-5, IL-10, die die Regulation von humoralen Immunreaktionen beeinflussen.

In Toleranzmodellen kann, verglichen mit einer Abstoßungsreaktion, in den meisten Fällen eine verminderte Expression der Th1-Zytokine IL-2 und IFN-γ beobachtet werden, während die Rolle der Th-2 Zytokine umstritten ist, da einige Gruppen eine signifikante Erhöhung und andere eine schwache Expression von IL-4 und/oder IL-10 beschreiben (Nickerson et al., 1997, Piccotti et al., 1997). Wahrscheinlich ist, dass eine Beeinflussung der Immunantwort in Richtung Th2 teilweise zu einer Transplantatakzeptanz beitragen kann, ohne jedoch Toleranz zu induzieren.

1.2.7.2 Interleukin-4 (IL-4)

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IL-4 gehört zu den Zytokinen, die die Proliferation, Maturation und Differenzierung von lymphoiden Zellen induzieren und koordinieren (Paul, 1991). In der Induktionsphase einer Immunantwort ist IL-4 für die Differenzierung von CD4+ T-Zellen in Th2-Zellen bedeutsam. Hohe in vitro-Konzentrationen von IL-4 können naive T-Lymphozyten (Th0-Zellen) in Richtung einer Th2-Antwort beeinflussen. Es nimmt somit eine zentrale Rolle bei der Induktion von Th2-Antworten ein (Abehsira-Amar et al., 1992). IL-4 wirkt auch auf B-Zellen und regt die Produktion von Immunglobulinen (IgG1 und IgE) und den Wechsel zwischen verschiedenen Ig-Isotypen an (Chomarat und Banchereau, 1997). Bei Monozyten und Makrophagen kann IL-4 die Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen verringern, aktiviert jedoch gleichzeitig die Expression anderer Moleküle (MHC-II) und die anti- oder pro-inflammatorischen Effekte von IL-4 werden noch diskutiert (David et al., 1998, Goerdt und Orfanos, 1999).

IL-4 scheint wesentlich für die Akzeptanz von Transplantaten zu sein (Mottram et al., 1995). In dieser Rolle könnte die Produktion von IL-4 und IL-10 durch Th2-Zellen für die Hemmung der Th1-Funktion verantwortlich sein. Die Expression von IL-4 und die Abwesenheit von IL-2 sind wichtige Toleranzmarker (Nickerson et al., 1993), jedoch nicht ausreichend für die Induktion von Toleranz (Steiger et al., 1995).

1.2.7.3 Interleukin-10 (IL-10)

IL-10 kann ebenfalls eine Verschiebung von Th1- zu Th2-vermittelten Immun-Mechanismen verursachen (Cua et al., 1996). Es fördert die Entwicklung von regulatorischen T-Zellen, die große Mengen von IL-10 und TGF-β sekretieren und so Immunantworten hemmen können (Groux et al., 1997). IL-10 wirkt indirekt herunterregulierend auf Th1-Zellen, da es die IL-12 Expression von APZ hemmt (Kennedy et al., 1994).

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IL-10 wird von Th2-Zellen und Makrophagen produziert und spielt eine immunsuppressive Rolle durch Verminderung der Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen und MHC-II-Antigenen und der APZ-Zellfunktion (deWaal Malefyt und Moore, 1998). Diese Eigenschaften können auch bei systemischer Verabreichung beobachtet werden (deWaal Malefyt et al., 1991, Fiorentino et al., 1991a, Fiorentino et al., 1991b), dafür muss IL-10 jedoch anhaltend und in hohen Konzentrationen vorliegen (Powrie et al., 1993).

Virales IL-10 (vIL-10) ist das IL-10-Homolog aus dem Epstein-Barr-Virus, das ähnliche anti-inflammatorische Eigenschaften besitzt wie das zelluläre IL-10 von Säugetieren, aber die Th1-vermittelte Immunität hemmt, ohne gleichzeitig Th2-Antworten zu stimulieren (deVries, 1995).

1.2.7.4 Gentransfer von IL-4 und IL-10 zur Modulation der Transplantatabstoßung

Bei IL-4 und IL-10 handelt es sich um pleiotrope Zytokine, die verschiedene immunsuppressive und immunmodulierende Eigenschaften zeigen. Aufgrund dieser Eigenschaften stellen sie vielversprechende Kandidaten für eine Überexpression in der lokalen Mikroumgebung von Transplantaten dar, um zu überprüfen, ob sie das Transplantatüberleben verlängern können. Gentransfer ist eine gute Möglichkeit, das Problem der kurzen Halbwertzeit von Zytokinen durch kontinuierliche Produktion über einige Zeit hinweg zu umgehen. Im allogenen Nierentransplantationsmodell der Ratte konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von IL-4 zu einer deutlichen Verlängerung des Transplantatüberlebens führte (Kato et al., 2000). Andere Arbeiten konnten diesen Effekt nicht bestätigen (Smith et al., 1997, Mueller et al., 1997). Die Bedeutung von IL-10 für den Gentransfer ist weniger umstritten. So konnte wiederholt gezeigt werden, dass die Überexpression von TGF-β und vIL-10 zur Verlängerung der Transplantatakzeptanz in verschiedenen allogenen Herztransplantationsmodellen führt (Qin et al., 1995, Josien et al., 1998). Auch die Ko-Applikation von IL-4 und vIL-10 mit Hilfe rekombinanter Adenoviren konnte das Überleben allogener Nierentransplantate in einem starken Abstoßungsmodell signifikant verlängern (Kato et al., 1999), bei dem zuvor der IL-4-Gentransfer allein keinen Erfolg hatte.


Aufgabenstellung

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In vorangegangenen Studien konnte die bedeutende Rolle des Hornhautendothels für die Physiologie der Kornea belegt werden. Eine grundsätzliche Besonderheit dieser wichtigen Zellschicht ist die fehlende Zellteilungsaktivität, die durch normalen Zellverlust während des Alterungsprozesses oder nach Verletzungen zu einer Einschränkung der Sehfähigkeit führen kann. Auch bei Hornhauttransplantationen stellt diese Eigenschaft des Hornhautendothels ein großes Problem dar; so tritt ein Endothelzellverlust zum einen vor Transplantation bereits während der Hornhautkonservierung, zum anderen im Zuge von immun-vermittelten Abstoßungsreaktionen oder in Folge chronischer Vorgänge nach Keratoplastik auf. Dieser Verlust ist irreversibel und kann zur Eintrübung des Transplantats führen. Aus diesem Grund wird vor der Transplantation einer Kornea eine möglichst hohe Endothelzelldichte angestrebt.

In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss eines Wachstumsfaktors (aFGF) auf die Endothelzellfunktion und zweier Zytokine (vIL-10, rIL-4) auf die Beeinflussung von Immunreaktionen nach Keratoplastik untersucht werden. Zu diesem Zweck erfolgte der Einsatz unterschiedlicher Gentransfer-Methoden an humanen kornealen Endothelzellen (HCEC) in vitro und ex vivo an Korneae der Ratte. Es sollten zwei grundlegende Fragestellungen bearbeitet werden:

  1. Ist es möglich, die Proliferation der Endothelzellen durch Expression von aFGF zu induzieren und damit eine mögliche Rolle dieses Wachstumsfaktors zur Verbesserung der prä-operativen Ausgangssituation zu klären?
  2. Kann durch die im Transplantat lokal und temporär überexprimierten Th2-Zytokine vIL-10 und rIL-4 eine Modulation der Immunreaktionen nach Keratoplastik erzielt werden, die ein längeres Transplantatüberleben ermöglichen?


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29.11.2004