2 Material und Methoden

2.1 Methoden

2.1.1 Klonierungsarbeiten mit dem aFGF-Plasmid

2.1.1.1 Herstellung des aFGF-Plasmids

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Das Plasmid p267, das die kodierende DNA-Sequenz für aFGF enthält, wurde von der Arbeitsgruppe Prof. Courtois, INSERM U118, Paris zur Verfügung gestellt. Alle weiteren Klonierungsarbeiten mit diesem Plasmid wurden in der Arbeitsgruppe von Frau Dr. R. Reszka, MDC, Berlin-Buch, durchgeführt. Die aFGF-cDNA wurde nach einer Restriktion mit den Enzymen Xho I und Bgl II in den Vektor pSLV-neo kloniert. Das Plasmid wurde vermehrt und mittels Restriktion und Sequenzierung überprüft. Die Restriktion erfolgte mit den Enzymen Xho I, Bgl II, Bam HI und Hind III. Die Agarosegelelektrophorese bestätigte die erwarteten Fragmente. Die Sequenzanalyse erfolgte nach Sanger et al., (1977). Bei der Sequenzierung der aFGF-cDNA stellte sich heraus, dass ein komplettes Triplett (AGG; entspricht R) fehlt. Damit war die aktive Form des Proteins in Frage gestellt. Um den Fehler zu beheben, wurde eine Reparatur-PCR durchgeführt. Der „repair“-Primer (5‘-GCT TCT CGA GCC ACC ATG AAT TAC AAG AAG CCC AAA CTC CTC TAC TGT AGC-3‘) fügte hierbei das fehlende Triplett in die cDNA-Sequenz ein. Das resultierende Plasmid wurde vermehrt und sequenziert. Die Sequenzierung ergab diesmal die richtige Nukleotidabfolge, sodass für die nachfolgenden Experimente die Aktivität des aFGF gewährleistet war.

2.1.1.2 Vermehrung des aFGF-Plasmids

2.1.1.2.1 Herstellung kompetenter Zellen

Für die Herstellung kompetenter Zellen für Transformationen wurde der E. coli-Stamm DH5 verwendet. Aus einem DH5-Glyzerol-Stock wurden mit einer sterilen Impföse 5ml LB-Medium beimpft und über Nacht bei 37°C im Schüttler inkubiert. Mit 1ml dieser Kultur wurden 100ml LB-Medium als Hauptkultur beimpft und bei 37°C im Schüttler bis zu einer OD600 von 0,6 herangezogen. Anschließend wurden die Zellen für 10min auf Eis inkubiert und für weitere 10min bei 4000rpm und 4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde vorsichtig in 10ml eiskaltem 0,1M CaCl2 resuspendiert und für 5min auf Eis gehalten. Nach wiederholter Zentrifugation unter gleichen Bedingungen wurde das Pellet in 2ml 0,1M CaCl2 + 10% Glyzerol resuspendiert, in gekühlten und sterilen Reaktionsgefäßen aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefrostet. Die Lagerung erfolgte bei -70°C.

2.1.1.2.2 Transformation

Mittels Transformation kann DNA in Bakterien übertragen werden. Die kompetenten Bakterien wurden langsam auf Eis aufgetaut. Anschließend wurden 140µl davon mit 5µl Plasmid gemischt und für weitere 30min auf Eis gehalten. Es folgte ein Hitzeschock bei 42°C im Wasserbad für genau 45sec, der die Aufnahme der DNA in die Zellen verbessern sollte. Die Zellen wurden 2min auf Eis abgekühlt, nachfolgend mit 1ml LB-Medium versetzt und 1h im Schüttler bei 37°C inkubiert. Auf LB-Agarplatten mit 100µg/ml Ampicillin erfolgte das Ausplattieren von 50µl der transformierten Bakterien, die über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert wurden. Von den gewachsenen Kolonien wurden Einzelkolonien gepickt, in 5ml LB-Medium mit Ampicillin angeimpft und über Nacht unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Über einen Restriktionsverdau erfolgte die Analyse der Kolonien.

2.1.1.2.3 Restriktionsanalyse

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Die DNA wurde mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen geschnitten und konnte dadurch charakterisiert werden. Ein 20µl-Restriktionsansatz enthielt 0,1-2,0µg Plasmid-DNA, 2,0µl 10x Puffer, 2-5 Units des Restriktionsenzyms (Bam HI) und eine dem Endvolumen entsprechende Menge an destilliertem Wasser. Die Inkubation des Restriktionsansatzes erfolgte für 1h bei 37°C.

2.1.1.2.4 Maxi-Präparation

Der Isolierung und Reinigung von Plasmid-DNA in Mengen von bis zu 500µg diente der Maxi-Prep-Kit der Firma GenomedGmbH(Löhne).

Mittels einer 5ml Vorkultur wurden 200ml LB-Medium (mit 100µg/ml Ampicillin) angeimpft und über Nacht im Schüttler bei 37°C und 220rpm inkubiert. Die Bakterien wurden für 15min bei 5000rpm pelletiert und mit Hilfe der Lösungen des Genomed-Kits resuspendiert, lysiert und neutralisiert. Die Plasmid-Reinigung und -Isolierung erfolgte über Säulen, nach Vorschrift des Kits.

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Das DNA-Pellet wurde in 500µl A. dest. gelöst und bei -20°C aufbewahrt.

2.1.1.2.5 Elektrophoretische Auftrennung von DNA in Agarosegelen

Als negativ geladenes Molekül aufgrund der Phosphatreste, wandert die DNA im elektrischen Feld zum positiven Pol. Je nach Größe der DNA-Fragmente, die in der Gelmatrix aufgetrennt werden sollen, wurde ein 0,8-2,0%iges Agarosegel gegossen. Durch Erhitzen in TAE-Puffer wurde die Agarose geschmolzen, bevor sie beim Abkühlen und nach Zugabe von 20µg/ml Ethidiumbromid polymerisierte. Die DNA-Proben wurden mit 5x Probenpuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in einer horizontalen Gelelektrophoresekammer mit 1xTAE als Laufpuffer. Als Größenstandard dienten 500ng eines 1kb-Markers. Die angelegte Spannung betrug ca. 100V.

Durch Interkalation des Ethidiumbromids in die DNA konnte sie über einen Transilluminator mittels UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert werden. Die Konzentration der DNA konnte anhand eines Gel Imagers und der Analyse-Software E.A.S.Y. (Herolab, Wiesloch) im Verhältnis zu den Größenstandards berechnet werden.

2.1.1.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

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Neben der Quantifizierung mit dem Gel Imager kann die Konzentration einer Nukleinsäure-Lösung auch photometrisch mittels Spektralphotometer bestimmt werden. Dabei wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 260nm gemessen. Die Konzentration konnte dann über Multiplikation des Absorptionswertes mit dem Faktor 50 für dsDNA in µg/ml errechnet werden (1 OD260 = 50µg/ml dsDNA). Der Proteingehalt der Probe wurde bei einer OD von 280nm ermittelt. Lag das Verhältnis der Extinktion (OD260/OD280) bei einem Quotienten von 1,8-2,0, konnte von einer sauberen Probe, ohne Proteinverunreinigungen, ausgegangen werden.

2.1.2 Kultivierung der humanen kornealen Endothelzelllinie

2.1.2.1 HCEC-Zellkultur

Die humane korneale Endothelzelllinie HCEC GVO 12/96L wurde von Herrn Dr. Bednarz und Frau Prof. Engelmann aus der Universitätsaugenklinik Hamburg Eppendorf etwa in der 100. Passage zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden unter Standardbedingungen im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Als Medium diente DMEM mit 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamin und lediglich 2% FKS. Das serumreduzierte Medium sollte ein optimales Wachstum der Zellen verhindern und damit der Situation von Primärkulturen möglichst nahe kommen. Alle Versuche wurden mit Zellen von der 100. bis ca. 130. Passage durchgeführt.

2.1.2.2 Kryokonservierung und Auftauen der Zellen

Zur Langzeitlagerung wurden ca. 5x106 Zellen in 1ml Einfriermedium aufgenommen und nach einem Gefrierschritt bei –80°C in flüssigem Stickstoff bei –196°C gelagert. Das Einfriermedium enthält 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), welches die Kristallisation von intrazellulärem Wasser und die damit verbundene Zerstörung der Zellmembranen durch die wasserbedingte Volumenzunahme verhindern kann. Da DMSO bei RT toxisch auf die Zellen wirkt, wurden alle Einfrierschritte auf Eis bzw. bei 4°C durchgeführt.

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Zum Auftauen wurden die Zellen zügig im Wasserbad bei 37°C erwärmt, tropfenweise in kaltes Kulturmedium überführt und abzentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in Kulturmedium resuspendiert und in geeigneter Zelldichte in Kulturgefäße ausgesät.

2.1.3 Lipid-vermittelter Gentransfer in HCEC

2.1.3.1 Transfektionen von HCEC

Die Übertragung von Fremd-DNA in die Zellen erfolgte mit Hilfe verschiedener kommerziell erhältlicher Transfektionsreagenzien auf Lipid-Basis. Bei Lipofectin, Lipofectamine, DMRIE-C, Cellfectin (Invitrogen) und DAC-30 handelt es sich um Liposomen, bei Superfect, Effectene (Qiagen) und FuGene6 (Roche) um nicht-liposomale Transfektionsreagenzien. Alle Transfektionen erfolgten nach Angaben der Hersteller. Um die Effizienz der Genübertragung von DAC-30 zu erhöhen, wurde Protaminsulfat (PS, 1mg/ml) 1:50 zugesetzt.

Tabelle 2: Eine Auswahl der verwendeten Transfektionsreagenzien und ihrer Helferlipide

Reagenz

Name / Helfer-Lipid

Lipofectin

N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchloride (DOTMA) / DOPE

DMRIE-C

1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxy ethyl ammonium bromide (DMRIE) / Cholesterol

DAC-30

3[N-(N,N‘-dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterol / DOPE

FuGENE6

Multi-Komponenten-Lösung auf Lipidbasis

Effectene

nicht-liposomale Lipidlösung in Verbindung mit einem speziellen DNA- kondensierenden Enhancer

2.1.3.1.1 Marker-Gentransfer

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Um die besten Transfektionsbedingungen für jedes Reagenz zu bestimmen, wurden zunächst Markergene (E. coli β-Galaktosidase [β-gal], Enhanced Green Fluorescent Protein [EGFP]) in HCEC übertragen und die Effizienz des Gentransfers sowie die Toxizität der Reagenzien ermittelt. Lipide und Plasmid-DNA wurden in verschiedenen Konzentrationen und Mischungsverhältnissen in ihrer Wirkung auf die Zellen ausgetestet. Von β-gal transfizierten Zellen wurden Fotos angefertigt und der EGFP-Gentransfer am Durchflusszytometer (FACS) charakterisiert.

2.1.3.1.2 β-Galaktosidase-Färbung

Die Effizienz des β-Galaktosidase-Gentransfers wurde 24h nach Transfektion durch Färbung der transfizierten Zellen ermittelt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in einer Formaldehyd[2%]/Glutaraldehyd[0,2%]-Lösung für 10min bei 4°C fixiert. Die Zellen wurden erneut gewaschen und anschließend in einer 1%igen X-gal-Lösung inkubiert. Nach 24h bei 37°C folgte ein weiterer Waschschritt und die Zellen konnten in PBS bei 4°C aufbewahrt werden. Zur Dokumentation der Gentransfer-Effizienz wurden Fotografien angefertigt.

2.1.3.1.3 Durchflusszytometrische Analyse zur Ermittlung von Effizienz und Toxizität nach Gentransfer

Fluoreszierende Zellen können mit Hilfe des Durchflusszytometers (FACS) untersucht werden. Es erfasst Farbstoffe, die das gleiche Anregungsspektrum besitzen (488nm), jedoch unterschiedliche Emissionsspektren aufweisen. EGFP-transfizierte Zellen fluoreszieren grün (508nm) und lassen sich in der 1. Fluoreszenz messen. Eine Färbung mit Propidiumiodid (PI) ist bei Zellen möglich, die ihre Membranintegrität verloren haben. PI weist eine besondere Affinität zu Nukleinsäuren auf und kann durch permeable Membranen in die Zelle diffundieren und dort die DNA rot anfärben. Dies lässt Rückschlüsse auf die Toxizität der Untersuchungen zu. Die rote, PI-vermittelte, Fluoreszenz (620nm) kann in der 2. und 3. Fluoreszenz gemessen werden. 24h nach Transfer des EGFP-Plasmids in HCEC mit Hilfe der verschiedenen Reagenzien in unterschiedlichen Versuchsansätzen, erfolgte die Quantifizierung der grün und rot fluoreszierenden Zellen. Die HCEC wurden hierfür trypsiniert, pelletiert und in 200µl PI (50µg/ml in PBS) resuspendiert. Es folgte eine Inkubation von 20min auf Eis unter Lichtausschluss. Bei der anschließenden FACS-Messung wurde parallel der prozentuale Anteil von grün (transfiziert) und rot (avital) fluoreszierenden Zellen pro Ansatz ermittelt. Daraus konnten direkt Rückschlüsse auf Effizienz und Toxizität der Versuche gezogen werden.

2.1.3.2 Gentransfer von aFGF

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Anschließend erfolgte der Gentransfer des Fibroblasten-Wachstumsfaktors-1 (FGF-1, aFGF) unter den für jedes Transfektionsreagenz ermittelten optimalen Bedingungen. Nach der Transfektion wurden die Zellen über eine Woche in Kultur gehalten und an den Tagen 4 und 7 mit Hilfe der Trypanblau-Färbung in der Zählkammer quantifiziert.

2.1.3.2.1 Raster-Elektronen-Mikroskopie

Zur optischen Beurteilung der Morphologie der HCEC an den Tagen 4 und 7 nach aFGF-Gentransfer wurden in der Augenklinik von Frau Sänger elektronen-mikroskopische Aufnahmen angefertigt. Dazu wurden die Zellen vor der Transfektion in 24-Loch-Platten ausgesät, die 13mm Zell-Kultur Deckgläschen enthielten. An den Tagen 4 und 7 wurden die transfizierten Zellen in 2,5% Glutaraldehyd fixiert und in 2% Osmiumtitroxid nachfixiert. Anschließend erfolgte ein Entwässerungs- und Trocknungsschritt in Alkohol und Hexamethyldiselazane. Die Deckgläschen, auf denen sich die Zellen befanden, wurden auf Präparatehalter aufgeklebt und mit Gold besprüht. Anschließend konnten die Aufnahmen angefertigt werden.

2.1.4 Expressionsuntersuchungen auf Protein-Ebene

2.1.4.1 Zelllyse

Für den biochemischen Nachweis des aFGF-Proteins in den transfizierten Zellen, wurden diese lysiert. Dafür wurden die Gentransfer-Experimente in 6cm-Schalen durchgeführt, um ausreichend große Mengen an Zellextrakt für den Proteinnachweis zu gewinnen. An den Tagen 4 und 7 nach Transfektion wurden die Zellen trypsiniert, pelletiert, 1x mit PBS gewaschen und in 50µl kaltem Lysispuffer, der Proteinase-Inhibitoren enthielt, resuspendiert. Die Fragmente wurden erneut pelletiert und der die löslichen Zellproteine enthaltende Überstand gesammelt und bei –80°C eingefroren.

2.1.4.2 Gesamtproteinbestimmung

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Die Gesamtproteinbestimmung erfolgte mit dem Micro-BCA-Protein Test der Firma Pierce. Damit können Proteinkonzentrationen von 0,5-20µg/ml erfasst werden. Dieser Test beruht auf der Eigenschaft von Proteinen, mit Cu2+-Ionen im alkalischen Milieu blaue Farbkomplexe zu bilden. Die photometrische Messung dieser Komplexe erfolgte bei 562nm. Untersucht wurde der Proteingehalt von aFGF-transfizierten HCEC. Um in dem Messbereich des Tests zu bleiben, mussten die lysierten Zellen 1:50 in PBS verdünnt werden. Über eine BSA-Verdünnungsreihe wurde eine Eichkurve erstellt, aus der der Proteingehalt der Proben direkt abgelesen werden konnte. Über die eingesetzte Probenmenge konnte die Gesamtproteinkonzentration in 1ml Probe ermittelt werden.

2.1.4.3 Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blot

Für die Auftrennung der Proteine wurden 100µg Gesamtprotein von jedem Zelllysat pro Geltasche aufgetragen. Zuvor wurde das entsprechende Lysatvolumen 1:1 mit Probenpuffer versetzt und 3 min bei 95°C aufgekocht. Nach Beendigung des Gellaufs folgte der Transfer der aufgetrennten Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran. Zur Überprüfung wurde diese nach dem Transfer in Ponçeau-Lösung überführt, wobei die Proteinbanden rot angefärbt wurden. Nach dem Blocken (4°C ü.N. oder RT 1h) in 5% Milchpulver in TBST konnte die Antikörper-Färbung durchgeführt werden. Die Antikörper wurden in 3% BSA/TBST verdünnt, anti-aFGF 0,1 mg/ml, das Peroxidase-Konjugat 1:10 000. Die Inkubationszeit betrug jeweils 1 h. Nach einer abschließenden Spülung in TBST erfolgte die Entwicklung des Blots mit Hilfe des ECL-Assays von Amersham. Die entwickelte Membran wurde in eine Filmkassette eingelegt und anschließend in der Dunkelkammer entwickelt.

2.1.5 Gentransfer in der Keratoplastik

2.1.5.1 Adenovirus-vermittelter Gentransfer

Die adenoviralen Vektoren, die in dieser Arbeit Anwendung fanden, wurden in der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. Thomas Ritter, Institut für Medizinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin, hergestellt.

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Über homologe Rekombination der Zielgen-DNA aus dem rekombinanten pACCMV-Vektor in die E1-Region des adenoviralen Plasmids pJM17 entstanden während einer Ko-Transfektion mittels Kalzium-Phosphat in eine Verpackungszelllinie (911, 293) rekombinante Adenoviren, die jedoch außerhalb der Verpackungszelllinie replikationsdefizient sind. Rekombinante Adenoviren weisen aus Gründen der biologischen Sicherheit und zur Steigerung der Verpackungskapazität eine Deletion im, für die Virusreplikation wichtigen, E1-Leserahmen auf und sind damit nur in speziellen Verpackungszelllinien, die die adenoviralen E1A- und E1B-Proteine konstitutiv exprimieren, in der Lage, sich zu replizieren. Nach Überprüfung, Vermehrung und Aufreinigung im Cäsium-Chlorid-Gradienten konnten die adenoviralen Konstrukte in weiterführenden Studien eingesetzt werden. Folgende Konstrukte kamen in den Experimenten zur Anwendung: AdvIL-10, AdrIL-4, AdEGFP, Adβ-gal und Ad dl 312 (Ad0). Nach persönlicher Mitteilung von Dr. Ritter konnten die Bioaktivitäten der Virus-kodierten vIL-10 (Dissertation von Frau Dipl.-Biol. Christine Brandt) und IL-4 Zytokingene nachgewiesen werden.

2.1.5.1.1 Adenoviraler Marker-Gentransfer in HCEC

Die Zellen wurden am Tag vor der Transduktion ausgesät, sodass sie für den adenoviralen Gentransfer eine Konfluenz von 80% aufwiesen. Pro Vertiefung wurden in 300µl DMEM mit 2% FKS 50-1000 plaque forming units (pfu) AdEGFP und zusätzlich 8µg/ml Polybren zur Erhöhung der Transduktionseffizienz pipettiert (Plaque forming unit ist ein Standard-Ausdruck für die Fähigkeit der hergestellten rekombinanten Viren, auf der Verpackungszelllinie infektiöse Plaques auszubilden). Nach einer zweistündigen Inkubationszeit wurde das Medium gewechselt und die Zellen 24h später durchflusszytometrisch auf ihre GFP-Expression hin untersucht.

2.1.5.1.2 Adenoviraler Gentransfer in ex vivo kultivierte Ratten-Korneae

Aus dem Spendertier (Wistar-Furth Ratte) wurde mit Hilfe eines 3,5mm Trepans die zentrale Hornhaut ausgestanzt und sofort in 24-Loch-Zellkulturplatten mit je 1ml DMEM ohne FKS überführt. Es wurde darauf geachtet, dass die Endothelzellschicht der Kornea nach oben zeigte. Das Medium wurde entfernt und gegen 500µl Transduktionslösung mit 1x108 pfu/Kornea ausgetauscht. Dabei war es wichtig, dass die Hornhaut vollständig mit der Transduktionslösung bedeckt war. Nach drei Stunden Inkubation im Brutschrank bei 37°C wurde die Lösung vorsichtig abgezogen und die Hornhaut dreimal zur Entfernung freier Viruspartikel gewaschen. Anschließend wurde die Kornea mit 500µl DMEM ohne FKS versetzt und weitere drei Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit konnten die Hornhäute entweder nach Zugabe von DMEM mit 2 % FKS und Amphotherizin B (1:1000) weiter ex vivo kultiviert und der Überstand zu verschiedenen Zeitpunkten zur Analyse der Zytokinproduktion entnommen werden, oder direkt der allogenen Hornhauttransplantation zugeführt werden.

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Abbildung 7: Schematische Darstellung der Methode der ex vivo-Transduktion einer Rattenhornhaut aus: PD Dr. T. Ritter (Habilitationschrift).

2.1.5.2 Liposomaler Gentransfer in ex vivo kultivierte Ratten-Korneae

Zur Bildung der Transfektions-Komplexe wurde parallel zur Kornea-Entnahme das Liposom Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in verschiedenen Konzentrationen, 10µg Transferrin (Sigma) und 1µg des Plasmids pcDSRα-BCRF1 (PD Dr. Thomas Ritter, Berlin), das unter der Kontrolle eines SV40-Promotors für vIL-10 kodiert, zusammenpipettiert und mit serumfreiem Opti-MEM®-Medium auf ein Gesamtvolumen von 250µl aufgefüllt. Diese Mischung wurde 30min zur Komplexbildung bei RT inkubiert. Die frisch entnommenen Hornhäute wurden mit PBS gespült und anschließend in jeweils 250µl Opti-Mem und Transfektionslösung aufgenommen.
Auch hier wurde darauf geachtet, dass die Hornhaut vollständig mit der Transfektionslösung bedeckt war. Nach drei Stunden Inkubation im Brutschrank bei 37°C wurde die Lösung vorsichtig abgezogen und die Hornhaut dreimal zur Entfernung der Komplexe gewaschen. Anschließend wurde die Kornea mit 500µl DMEM ohne FKS versetzt und weitere drei Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit konnten die Hornhäute entweder nach Zugabe von DMEM mit 2 % FKS und Amphotherizin B (1:1000) weiter ex vivo kultiviert und der Überstand zu verschiedenen Zeitpunkten zur Analyse der Zytokinproduktion entnommen werden, oder direkt der allogenen Hornhauttransplantation zugeführt werden.

2.1.5.3 Untersuchungen zur Zytokinexpression mittels ELISA

Zur Quantifizierung der Zytokinproduktion durch die adenoviral transduzierten oder liposomal transfizierten Hornhäute wurden die Überstände der Korneae zu verschiedenen Zeitpunkten nach Gentransfer geerntet und mittels ELISA analysiert. Die Messung der vIL-10-Produktion erfolgte über den kommerziell erhältlichen ELISA-Kit der Firma Coulter-Immunotech (Hamburg). Der rIL-4-ELISA wurde am Institut für Medizinische Immunologie (Charité-Universitätsmedizin Berlin) in der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. T. Ritter etabliert. Hierfür wurde ein aus OX-81 Hybridoma Zellen gewonnener anti-Ratten-IL-4 monoklonaler Antikörper (0,81mg/ml 1:500 in 0,1M Karbonatpuffer, 50µl/Loch) über Nacht bei 4°C an eine 96-Loch-Platte gebunden. Am nächsten Tag wurde der Beschichtungspuffer verworfen und die Platte mit 100µl Blockpuffer/Loch für 2h bei Raumtemperatur geblockt. Anschließend wurden Standard (rekombinantes Ratten IL-4) und Proben in entsprechenden Verdünnungen mit 50µl/Loch aufgetragen und 2h schüttelnd bei RT im Dunkeln inkubiert. Nach vier Waschschritten wurde der sekundäre Antikörper (anti-Ratten-IL-4-biotinyliert, 0,5mg/ml) 1:500 in Verdünnungspuffer zu je 50µl/Loch aufgetragen und für 1h inkubiert. Nach weiteren 4 Waschschritten wurde Streptavidin-Peroxidase (0,64mg/ml) 1:2000 verdünnt und mit je 50 µl/Loch in die Vertiefungen pipettiert. Nach der einstündigen Inkubationszeit und den 4 Waschschritten wurden 50µl Substrat A+B (1:1) pro Vertiefung zugegeben und 30 min inkubiert. Schließlich wurde die Reaktion mit 1M Schwefelsäure (50µl/Loch) abgestoppt und die Extinktion bei 450nm gemessen.

2.1.5.4 Transplantation von Rattenhornhäuten

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Alle Tierversuche wurden nach den Anforderungen der „Guiding Principles in the Care of Animals“ des National Institute of Health, Bethesda und den Richtlinien der Senatsverwaltung Berlin, durchgeführt. Es wurde nur jeweils ein Auge transplantiert, sodass die Tiere auf der anderen Seite ihre Sehkraft behielten.

Die Korneatransplantationen der adenoviral transduzierten Hornhäute wurden von Frau MUDr. Klará Sedláková, die der liposomal transfizierten Hornhäute von Dr. Nianqiao Gong durchgeführt.
Für die Versuche wurden 8-10 Wochen alte, weibliche Ratten mit einem Gewicht von 200-250g verwendet. Es wurden Zuchtlinien verwendet, die sich in ihren MHC Klasse I und II Histokompatibilitätsantigenen unterscheiden (Gill et al., 1987).

Das Spendertier (Wistar Furth, WF) wurde durch eine Inhalationsnarkose eines Gemischs von CO2 und Lachgas in einer in der tierexperimentellen Anlage vorhandenen Einrichtung getötet. Nachfolgend wurde mit einem 3,5mm Trepan die Hornhaut entnommen und ex vivo transduziert oder transfiziert. Das Empfängerauge wurde vor dem Eingriff mit 1% Atropin Sulfat weitgetropft, um Irisschäden während der Transplantation zu vermeiden. Die Empfängertiere erhielten eine intramuskuläre Injektion einer Kombination aus Ketavet (16,5 mg/Tier (200g)) und Rompun (0,7 ng/Tier (200g)) zur Anästhesie. Mit einem 3,0mm Trepan wurde aus dem Empfängertier die rechte Hornhaut ausgestanzt und die transduzierte Spenderhornhaut mittels durchgehender Naht eingesetzt. Um die Augenvorderkammer zu stabilisieren und Linsen- und Iris-Schädigungen zu vermeiden, wurde eine viskoelastische Substanz (Healon) eingebracht, die vor dem Verschluss der Wunde wieder entfernt wurde. Eine kleine Luftblase, die anschließend in die Vorderkammer eingebracht wurde, diente dazu, die frisch eingesetzte Kornea von der Iris zu trennen (Pleyer et al., 1995). Das Nahtmaterial verblieb bis zum Versuchsende im Auge. Die transplantierten Tiere wurden unter dem Operationsmikroskop dreimal innerhalb der ersten postoperativen Woche und anschließend täglich kontrolliert. Der Grad der Korneatrübung diente als Indikator für die Transplantat-Abstoßung. Bei einer Bewertungs-Skala von 0-4 galt eine Trübung von 3 oder höher als abgestoßen. Am Tag der Abstoßung bzw. 10 Tage post OP wurden bei einigen Gruppen das Transplantat, die drainierenden Lymphknoten und die Milzen entnommen. Die Transplantate wurden für die Histologie in OCT eingebettet. Mit Lymphknoten und Milzen wurde am Tag der Entnahme eine gemischte Lymphozytenkultur angesetzt.

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Als Kontrollen dienten nicht-transduzierte allogene (WF) und syngene (Lewis, Lew) Hornhauttransplantate, sowie mit einem Adenoviruskonstrukt ohne therapeutisches Gen (Ad0) bzw. mit Adβ-gal transduzierte syngene und allogene Hornhäute. In der Liposomenkontrollgruppe wurden Hornhäute verwendet, die nur mit dem Liposom und Transferrin, ohne Plasmid behandelt worden waren.

2.1.5.5 Gemischte Lymphozytenkultur zur Überprüfung der Immunreaktionen im Transplantatempfänger

2.1.5.5.1 Lymphozytengewinnung und Ficoll-Gradient

Für die gemischte Lymphozytenkultur wurden die drainierenden zervikalen Lymphknoten und die Milzen der Kornea-transplantierten Lewis-Ratten am Tag der Abstoßung bzw. am Tag 10 post OP entnommen und bearbeitet. Zunächst erfolgte die Isolation der Lymphozyten, indem die Lymphknoten durch Nylon-Zellsiebe (100µm und 40µm) gestrichen wurden. Die Lymphozyten wurden in PBS oder Medium gesammelt, zentrifugiert (1200rpm, 4°C, 5min) und in 3ml frischem PBS resuspendiert.

Die Milzen wurden durch ein grobes Metallsieb und anschließend durch ein 40µm Nylon-Zellsieb passiert, in PBS gewaschen und in 20ml PBS resuspendiert. Anschließend wurden 3ml Ficoll mit 4ml der Milzzellsuspension überschichtet (Pancoll Ratte: Dichte 1,091g/ml) und der Gradient bei Raumtemperatur und 370xg für 40min ausgebildet. Nach der Zentrifugation konnte der helle, die Lymphozyten enthaltende Ring in der Mitte des Gradienten abgesaugt und in ein neues Röhrchen überführt werden. Es folgten zwei Waschschritte mit Medium und vor der Färbung ein weiterer Waschschritt mit PBS, bevor die Zellen in 20ml PBS resuspendiert wurden.

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Für die Präparation von Stimulatorzellen (allogene Wistar-Furth-Zellen und syngene Lewis-Zellen zur Stimulation über Donor-Antigene), schloss sich ein Bestrahlungsschritt zur Hemmung der Proliferation an, bei dem die Zellen 30 Gray ausgesetzt und anschließend bei -80°C eingefroren wurden.

2.1.5.5.2 Färbung mit CFDA-SE (5,6-carboxyfluorescein diacetate, succhinimidyl ester)

Bei CFDA-SE handelt es sich um einen grün fluoreszierenden Membranfarbstoff, der bei Zellteilungen mit abnehmender Intensität an die Tochterzellen weitergegeben wird. Dies lässt sich per Durchflusszytometrie messen und erlaubt Aussagen über die Zellteilungsaktivität der stimulierten Lymphozyten. Die präparierten Lymphozyten wurden gezählt und anschließend mit 1ml 2,5µM CFDA-SE/1x107 Zellen für exakt 3min gefärbt. Nach der Färbung folgten drei Waschschritte mit Medium und ein erneutes Zählen, da bei der Färbeprozedur viele Zellen zugrunde gehen. Nach Ermittlung der endgültigen Zellzahl wurden die gefärbten Lymphozyten mit bestrahlten Stimulatorzellen (Lewis-Milz-Lymphozyten bzw. Wistar-Furth-Milz-Lymphozyten) ko-kultiviert. Dazu wurden je 3x105 Stimulator- und Responderzellen in 96-Loch-Rundbodenplatten in 200µl T-Zell-Medium mit 2% autologem (Lewis-) Serum pipettiert und für 4 Tage im Brutschrank kultiviert. Zur Gewinnung des autologen Serums wurde das kardial gewonnene Blut bei 4500 rpm und 4°C für 10 min zentrifugiert und der so entstandene Serumüberstand abgenommen. Am Tag 1 nach Versuchsansatz folgte die Einstellung der zu analysierenden Proben am FACS-Gerät.

2.1.5.5.3 FACS-Analyse zur Messung der Lymphozyten-Proliferation

Durch Färbung mit CFDA-SE sollten Unterschiede in den Immunreaktionen zwischen den verschiedenen Transplantationsgruppen sichtbar gemacht werden. Die Antikörperfärbung gegen TCR und die Isotypenkontrolle wurden gemäß den Herstellerangaben für die Färbung eingesetzt. Die Antikörperfärbung erfolgte nach sorgfältigem Durchmischen der Proben bei 4°C für 15 min. Die Messungen wurden an einem FACSort Durchflusszytometer (Becton Dickinson) durchgeführt und mit Hilfe der Cellquest-Software (Becton Dickinson) ausgewertet. Aufgrund der Vielzahl der Messungen und der natürlich bedingten Abweichungen im biologischen System wurden für die Auswertung der FACS-Messungen individuelle „Gates“ gesetzt (nach Rücksprache mit Herrn PD Dr. F. Kern, Institut für Medizinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin, Berlin).

2.1.5.6 Histologie

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Sämtliche histologischen Untersuchungen wurden von Frau Nadine Schmidt durchgeführt und sind Bestandteil ihrer Dissertation zum Dr. med.. Die Hornhäute der Ratten wurden an den Tagen 10, 17 und 24 nach Transplantation entnommen, OCT-fixiert und kryokonserviert. Nach Anfertigung von Gewebeschnitten erfolgte mit Hilfe der Avidin-Biotin-Komplex-Methode die monoklonale Antikörperfärbung für CD4, CD8, CD25, CD45, NK-Zellen und Monozyten. In dieser Arbeit sind nur die Färbungen für CD4 und CD8 dargestellt.

2.1.6 Statistische Auswertung

Alle Ergebnisse sind, wenn nicht anders angegeben, als Mittelwerte plus/minus Standardfehler (standard error mean, SEM) dargestellt. Die Angabe der mittleren Überlebenszeit nach Transplantation erfolgte als Median. Aussagen zur statistischen Signifikanz wurden nach Anwendung des Student’s T-Tests bzw. nach Berechnung von Chi-Quadrat Werten während der postoperativen Nachbeobachtungszeit getroffen (Log-Rank-Test).

2.2 Materialien

Die Chemikalien für die Lösungen wurden von den Firmen Roth (Karlsruhe, D), Fluka (Deisenhofen, D), Serva (Heidelberg, D), Merck (Darmstadt, D), Boehringer (Mannheim, D), Gibco BRL (Gaithersburg, USA), Riedel-de Haen (Seelze, D), Baker (Deventer, NL), Invitrogen (Groningen, NL), DIFCO (Detroit, USA), Heraeus (Osterode, D), Pharmacia (Uppsala, S), AGS (Heidelberg,D) und Sigma (Deisenhofen, D) bezogen.

2.2.1 Lösungen und Puffer

2.2.1.1 Puffer für Plasmidpräparation

▼ 32 

Puffer 1

25mM Tris, pH 8,0
10mM EDTA

Puffer 2

0,2M NaOH
1% SDS

Puffer 3

3M Natriumacetat, pH 5,5

2.2.1.2 Puffer für Agarose-Gelelektrophorese

TAE (50x)

10mM Tris-Base

1mM EDTA

1,6mM Eisessig

6xLadepuffer

0,25% Bromphenolblau

40% Sucrose in H2O

Ethidiumbromid-Stammlösung

10mg/ml in H2O

DNA-Marker

50 µl 1kb-Marker

100µl Ladepuffer

350µl TAE-Puffer

2.2.1.3 Puffer für SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Zell-Lysispuffer

100mM Tris

0,9% NaCl

5mM EDTA

1% Triton X-100

Proteaseinhibitoren

SDS-Page-Laufpuffer

3,0285 g/l Tris-Base

14,64 g/l Glycin

1 g/l SDS

Probenpuffer

10% Glycerin

5% β-Mercaptoethanol

3% SDS

125mM Tris-HCl pH 6,8

0,6% Bromphenolblau

Proteaseninhibitoren

▼ 33 

Tabelle 3: Zusammensetzungvon Trenn- und Sammelgel in den verwendeten Konzentrationen.

Trenngel 15%

Sammelgel 5%

30 % Acrylamid/0,8 % Bisacrylamid Stammlösung

3,0 ml

0,33 ml

1,88M Tris/HCl pH8,8

1,2 ml

0,625M Tris/HCl pH 6,8

0,4 ml

0,5% SDS

1,2 ml

0,4 ml

A. dest

0,6 ml

0,87 ml

TEMED

5 µl

2 µl

APS 10%

30 µl

10 µl

Multicolored Protein Markers

NENLife Science Products, Boston, MA, USA

2.2.1.4 Puffer für Western-Blot

Transfer-Puffer

3,0285 g/l Tris-Base

11,265 g/l Glycin

10% Methanol

pH 8,3

TBST (10x)

320 g/4l NaCl

96,8 g/4l Tris-Base

40 ml/4l Tween-20

pH 7,6

Milchpulver

5 % in TBST

Ponceau S Lösung

Sigma, St. Lois, MO, USA

2.2.1.5 Puffer für IL-4 ELISA

▼ 34 

Beschichtungspuffer

0,14% Na2CO3

0,3% NaHCO3

Blockpuffer

20 ml/l Tris, 0,1 M, pH 7,5

29,22 g/l NaCl (0,9 %)

1 ml/l Tween 20 (0,1 %)

+1:10 Genosys (Pharmingen)

Waschpuffer

41,25g/5 l Na2HPO4 x 2 H2O

5,5 g/5 l NaH2PO4 x H2O

438,5 g/5 l NaCl

0,1 % Tween-20

pH 7,4

Streptavidin-POD

Biosource, Camarillo, CA, USA

Substrat A+B

Pharmingen, San Diego, CA, USA

Verdünnungspuffer (Diluent)

Pharmingen, San Diego, CA, USA

Stopplösung

1N H2SO4

2.2.1.6 Lösungen für β-Galaktosidase-Färbung

Stocklösungen:

Ferricyanide/Ferrocyanide Stocklösung (je 125mM in A.dest)

1:1 Mischung von 250mM K3(Fe(CN)6) und K4(Fe(CN)6) in A.dest

1M MgCl2 in A.dest

50mg/ml X-gal in DMSO

Fixierlösung:

2% Formaldehyd (Stocklösung 37%)

0,2% Glutaraldehyd (Stocklösung 25%)

in PBS

Färbelösung:

19,3 ml PBS

40µl MgCl2

400µl Ferri/Ferro-Lösung

200µl X-gal (in DMSO)

2.2.1.7 Lösungen für MLR

T-Zell-Medium:

1% Natriumpyruvat

10% FKS

2% autologes Rattenserum (Lew)

1% Penicillin/Streptomycin

1% Glutamin

0,4% β-Mercapto-Ethanol (Stock: 1:1000 in DMEM) in DMEM

L-NMMA

Alexis, Carlsbad, CA, USA

Pancoll Rat

PAN Biotech GmbH, Aidenbach, D

2.2.1.8 Lösungen für FACS-Analyse

▼ 35 

FACS-Puffer:

2% FKS

0,1% Natriumazid

in PBS

FACS Flow

Becton Dickinson, San Jose, USA

FACS Rinse

Becton Dickinson, San Jose, USA

FACS Clean

Becton Dickinson, San Jose, USA

2.2.2 Fluoreszenzfarbstoffe

Propidium Iodid

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, D

5-(and-6)-CFDA-SE

Molecular Probes, Leiden, NL

2.2.3 Antikörper

anti-rat , TCR mAb PE

Pharmingen, San Diego, CA, USA

anti-goat IgG (Rabbit) PO-Konjugat

Calbiochem, San Diego, CA, USA

anti-aFGF-goat IgG-Antikörper

RD Systems, Minneapolis, MN, USA

anti rat IL-4 mAb

(aus Ox-81 Hybridoma-Zellen gewonnen)

ECACC, Salisbury, UK

anti-rat IL-4-biotinyliert

Pharmingen, San Diego, CA, USA

2.2.4 Transfektionsmaterialien

▼ 36 

Lipofectin® Reagenz

Invitrogen, Life technologies, Karlsruhe, D

LipofectAmine Reagenz

Invitrogen, Life technologies, Karlsruhe, D

DMRIE-C Reagenz

Invitrogen Life technologies, Karlsruhe, D

CellFectin® Reagenz

Invitrogen Life technologies, Karlsruhe, D

Effectene

Qiagen, Hilden, D

Superfect

Qiagen, Hilden, D

FuGene6

Roche, Mannheim, D

Lipofectamine2000

Invitrogen Life technologies, Karlsruhe, D

Protaminsulfat

Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D

Polybren

Sigma, Steinheim, D

Transferrin

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, D

Opti-MEM®

Gibco/Invitrogen, Life technologies, Karlsruhe, D

2.2.5 DNA-Vektoren

p267aFGF

Prof. Y. Courtois, Paris

pEGFP-N1

PD Dr. T. Ritter, Berlin

pcDNAβgal

PD Dr. T. Ritter, Berlin

pcDSRα-BCRF1

PD Dr. T. Ritter, Berlin

2.2.6 Adenovirale Konstrukte

AdvIL-10

PD Dr. T. Ritter, Berlin

AdrIL-4

PD Dr. T. Ritter, Berlin

Ad dl 312 (Ad0)

Dr. J.K. Kolls, New Orleans, LO, USA

AdEGFP

Dr. A. Flügel, Martinsried

Adβ-gal

Dr. J.K. Kolls, New Orleans, LO, USA

2.2.7 Proteine

▼ 37 

rekombinantes humanes aFGF

PAN Biotech GmbH, Aidenbach, D

RD Systems, Minneapolis, MN, USA

bovines aFGF

Sigma, St. Lois, MO, USA

RD Systems, Minneapolis, MN, USA

rekombinantes rat IL-4

Biosource, Camarillo, CA, USA

2.2.8 Elektronenmikroskopie

Glutaraldehyd 25% in Wasser

Boehringer Ingelheim Bioproducts, Ingelheim, D

Osmiumtitroxid 2%

Paesel und Lorei GmbH & Co, Hanau, D

Hexamethyldiselazane

Sigma, Deisenhofen, D

13mm Zell-Kultur Deckgläschen,

Nunc, Roskilde, DK

2.2.9 Transplantationsmaterialien

Rompun (Xylazin)

BayerVital, Leverkusen, D

Ketavet (Ketamin)

Parke Davis GmbH, Freiburg, D

Atropin-Sulfat-Tropfen 1%

Ciba Vision, Wefling, D

Healon

Pharmacia, Erlangen, D

Ofloxacin, Floxal

Mann Pharma GmbH, Berlin, D

Nahtmaterial 11-0 Mersilene

Alcon, Freiburg, D

3,5 und 3,0mm Trepan, Hornhaut-Scheren

2.2.10 Biologische Materialien

2.2.10.1 Zelllinien und Medien

▼ 38 

DH5:

supE44, Δ lacU169 (Φ80lacZΔM15), hsdR17 , recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1

Stratagene, Heidelberg, D

LB-Medium:

10g Bactotrypton, 5g Yeast Extract, 5g NaCl, H2O ad 1l

LB-Agar:

15g/l Agar in LB-Medium

Nach Autoklavieren und Abkühlen kann das entsprechende Antibiotikum (Stammlösung 100mg/ml) in einer Konzentration von 100µg/ml hinzugefügt werden.

Humane korneale Endothelzelllinie immortalisiert durch SV40 T-Antigen

Dr. J. Bednarz, Hamburg

▼ 39 

DMEM:

1% Glutamin

1% Pen/Strep

1% Natriumpyruvat

2% FKS

für Hornhäute zusätzlich Amphoterizin B 1:1000

2.2.10.2 Versuchstiere

Inzucht-Ratten, weiblich, 200-250g, mit komplettem MHC-Mismatch

Lewis (LEW/RT1l)

MB, Ry, DK

Charles River, Bad Sulzfeld, D

Wistar-Furth (WF/RT1u)

MB, Ry, DK

Harlan Winkelmann, Borchen, D

2.2.11 Versuchssysteme (Kits) und Enzyme

▼ 40 

Plasmid-Präparations-Kit Jet Star

Genomed, Gaithersburg, USA

Restriktionsendonukleasen, Puffer

Pharmacia, Uppsala, S

Restriktionsendonukleasen mit 5-Buffer-System

AGS, Heidelberg, D

BCA-Kit

Pierce, Rockford, USA

RNase A

Boehringer-Mannheim, D

ECLDetection Reagents

Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK

vIL-10 ELISA Kit

Coulter-Immunotech, Hamburg, D

2.2.12 Verbrauchsmaterialien

1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml Pipetten

Greiner, Nürtingen, D

verstellbare Pipetten mit Spitzen

Eppendorf, Hamburg, D

Eppendorfgefäße: 0,5ml, 1,5ml, 2,0ml

Eppendorf, Hamburg, D

Einfrierampullen

Greiner, Nürtingen, D

Zellkulturschalen

Nunc, Roskilde, DK,

Polypropylenröhrchen 15, 50ml

Falcon, Oxnard, USA

Einmalspritzen 5, 10ml

Braun, Melsungen, D

Einmalkanülen

Braun, Melsungen, D

Sterilfilter 0,2µm

Schleicher Schuell, Dassel, D

Sephadex-Säulchen

Pharmacia, Uppsala, S

Blotpapier

Schleicher Schuell, Dassel, D

Blotfolie HybondECL

Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, D

Maxisorb ELISA-Platten

Nunc, Roskilde, DK

96-Loch-Rundbodenplatten Nunclon Surface

Nunc, Roskilde, DK

96-Loch-Zellkulturplatten

Falcon, Oxnard, USA

24-Loch-Zellkulturplatten

Falcon ,Oxnard, USA

6-Loch-Zellkulturplatten

Falcon, Oxnard, USA

Zell-Sieb 40µm Nylon

Falcon, Oxnard, USA

Zell-Sieb 100µm Nylon

Falcon, Oxnard, USA

Cellstar TC-Röhrchen 14ml

Greiner, Nürtingen, D

5ml Polystyren-Röhrchen

Falcon, Oxnard, USA

Polypropylen-Röhrchen Linbro Liquisystem

ICN Flow, Whippany, NJ, USA

Neubauer-Zählkammer

Fein-Optik, Blankenburg, D

Deckgläschen 20x26mm

Menzel-Gläser, Braunschweig, D

2.2.13 Geräte, Messgeräte

Blockthermostat BT 100

Kleinfeld Labortechnik, Berlin, D

Brutschrank IG 150

Jouan, Unterhaching, D

Elektronen-Mikroskop Zeiss DSM 982 Gemini

Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, D

Electrophoresis Power Supply 200

Pharmacia, Uppsala, S

ELISA-Reader

Dynatech MRW Laboratories, Michigan, USA

FACSort

Becton Dickinson, Heidelberg, D

Gel Imager E.A.S.Y. Enhanced Analyses System

Herolab, Wiesloch, D

Hyperkassette

Amersham Life Science, Arlington Hts., IL, USA

Mikroskop

Nikon, Düsseldorf, D

pH-Meter MultiCal

WTW, Weilheim, D

Protein-Gelelektrophorese-Kammer

AGS, Heidelberg, D

Schüttler

GFL, Burgwedel, D

Spectrophotometer 4053 Kinetics netraspec K

LKB Biochrom, Camebridge, GB

Stromversorgungsgerät EPS 500/400

Pharmacia LKB, Freiburg, D

Thermomixer comfort

Eppendorf, Hamburg, D

Tisch-Zentrifuge

Eppendorf, Hamburg, D

Vakuum-Zentrifuge Concentrator 5301

Eppendorf, Hamburg, D

Waagen

Sartorius, Göttingen, D

Wasserbad

GFL, Burgwedel, D

Zentrifuge GR 422

Jouan, Unterhaching, D


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29.11.2004