2 Material und Methoden

Das Plasmid p267, das die kodierende DNA-Sequenz für aFGF enthält, wurde von der Arbeitsgruppe Prof. Courtois, INSERM U118, Paris zur Verfügung gestellt. Alle weiteren Klonierungsarbeiten mit diesem Plasmid wurden in der Arbeitsgruppe von Frau Dr. R. Reszka, MDC, Berlin-Buch, durchgeführt. Die aFGF-cDNA wurde nach einer Restriktion mit den Enzymen Xho I und Bgl II in den Vektor pSLV-neo kloniert. Das Plasmid wurde vermehrt und mittels Restriktion und Sequenzierung überprüft. Die Restriktion erfolgte mit den Enzymen Xho I, Bgl II, Bam HI und Hind III. Die Agarosegelelektrophorese bestätigte die erwarteten Fragmente. Die Sequenzanalyse erfolgte nach Sanger et al., (1977). Bei der Sequenzierung der aFGF-cDNA stellte sich heraus, dass ein komplettes Triplett (AGG; entspricht R) fehlt. Damit war die aktive Form des Proteins in Frage gestellt. Um den Fehler zu beheben, wurde eine Reparatur-PCR durchgeführt. Der „repair“-Primer (5‘-GCT TCT CGA GCC ACC ATG AAT TAC AAG AAG CCC AAA CTC CTC TAC TGT AGC-3‘) fügte hierbei das fehlende Triplett in die cDNA-Sequenz ein. Das resultierende Plasmid wurde vermehrt und sequenziert. Die Sequenzierung ergab diesmal die richtige Nukleotidabfolge, sodass für die nachfolgenden Experimente die Aktivität des aFGF gewährleistet war.

Für die Herstellung kompetenter Zellen für Transformationen wurde der E. coli-Stamm DH5 verwendet. Aus einem DH5-Glyzerol-Stock wurden mit einer sterilen Impföse 5ml LB-Medium beimpft und über Nacht bei 37°C im Schüttler inkubiert. Mit 1ml dieser Kultur wurden 100ml LB-Medium als Hauptkultur beimpft und bei 37°C im Schüttler bis zu einer OD₆₀₀ von 0,6 herangezogen. Anschließend wurden die Zellen für 10min auf Eis inkubiert und für weitere 10min bei 4000rpm und 4°C abzentrifugiert. Das Pellet wurde vorsichtig in 10ml eiskaltem 0,1M CaCl₂ resuspendiert und für 5min auf Eis gehalten. Nach wiederholter Zentrifugation unter gleichen Bedingungen wurde das Pellet in 2ml 0,1M CaCl₂ + 10% Glyzerol resuspendiert, in gekühlten und sterilen Reaktionsgefäßen aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefrostet. Die Lagerung erfolgte bei -70°C.

Mittels Transformation kann DNA in Bakterien übertragen werden. Die kompetenten Bakterien wurden langsam auf Eis aufgetaut. Anschließend wurden 140µl davon mit 5µl Plasmid gemischt und für weitere 30min auf Eis gehalten. Es folgte ein Hitzeschock bei 42°C im Wasserbad für genau 45sec, der die Aufnahme der DNA in die Zellen verbessern sollte. Die Zellen wurden 2min auf Eis abgekühlt, nachfolgend mit 1ml LB-Medium versetzt und 1h im Schüttler bei 37°C inkubiert. Auf LB-Agarplatten mit 100µg/ml Ampicillin erfolgte das Ausplattieren von 50µl der transformierten Bakterien, die über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert wurden. Von den gewachsenen Kolonien wurden Einzelkolonien gepickt, in 5ml LB-Medium mit Ampicillin angeimpft und über Nacht unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Über einen Restriktionsverdau erfolgte die Analyse der Kolonien.

Die DNA wurde mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen geschnitten und konnte dadurch charakterisiert werden. Ein 20µl-Restriktionsansatz enthielt 0,1-2,0µg Plasmid-DNA, 2,0µl 10x Puffer, 2-5 Units des Restriktionsenzyms (Bam HI) und eine dem Endvolumen entsprechende Menge an destilliertem Wasser. Die Inkubation des Restriktionsansatzes erfolgte für 1h bei 37°C.

Der Isolierung und Reinigung von Plasmid-DNA in Mengen von bis zu 500µg diente der Maxi-Prep-Kit der Firma GenomedGmbH(Löhne).

Mittels einer 5ml Vorkultur wurden 200ml LB-Medium (mit 100µg/ml Ampicillin) angeimpft und über Nacht im Schüttler bei 37°C und 220rpm inkubiert. Die Bakterien wurden für 15min bei 5000rpm pelletiert und mit Hilfe der Lösungen des Genomed-Kits resuspendiert, lysiert und neutralisiert. Die Plasmid-Reinigung und -Isolierung erfolgte über Säulen, nach Vorschrift des Kits.

Das DNA-Pellet wurde in 500µl A. dest. gelöst und bei -20°C aufbewahrt.

Als negativ geladenes Molekül aufgrund der Phosphatreste, wandert die DNA im elektrischen Feld zum positiven Pol. Je nach Größe der DNA-Fragmente, die in der Gelmatrix aufgetrennt werden sollen, wurde ein 0,8-2,0%iges Agarosegel gegossen. Durch Erhitzen in TAE-Puffer wurde die Agarose geschmolzen, bevor sie beim Abkühlen und nach Zugabe von 20µg/ml Ethidiumbromid polymerisierte. Die DNA-Proben wurden mit 5x Probenpuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in einer horizontalen Gelelektrophoresekammer mit 1xTAE als Laufpuffer. Als Größenstandard dienten 500ng eines 1kb-Markers. Die angelegte Spannung betrug ca. 100V.

Durch Interkalation des Ethidiumbromids in die DNA konnte sie über einen Transilluminator mittels UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert werden. Die Konzentration der DNA konnte anhand eines Gel Imagers und der Analyse-Software E.A.S.Y. (Herolab, Wiesloch) im Verhältnis zu den Größenstandards berechnet werden.

Neben der Quantifizierung mit dem Gel Imager kann die Konzentration einer Nukleinsäure-Lösung auch photometrisch mittels Spektralphotometer bestimmt werden. Dabei wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 260nm gemessen. Die Konzentration konnte dann über Multiplikation des Absorptionswertes mit dem Faktor 50 für dsDNA in µg/ml errechnet werden (1 OD₂₆₀ = 50µg/ml dsDNA). Der Proteingehalt der Probe wurde bei einer OD von 280nm ermittelt. Lag das Verhältnis der Extinktion (OD₂₆₀/OD₂₈₀) bei einem Quotienten von 1,8-2,0, konnte von einer sauberen Probe, ohne Proteinverunreinigungen, ausgegangen werden.

Die humane korneale Endothelzelllinie HCEC GVO 12/96L wurde von Herrn Dr. Bednarz und Frau Prof. Engelmann aus der Universitätsaugenklinik Hamburg Eppendorf etwa in der 100. Passage zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden unter Standardbedingungen im Brutschrank bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Als Medium diente DMEM mit 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamin und lediglich 2% FKS. Das serumreduzierte Medium sollte ein optimales Wachstum der Zellen verhindern und damit der Situation von Primärkulturen möglichst nahe kommen. Alle Versuche wurden mit Zellen von der 100. bis ca. 130. Passage durchgeführt.

Zur Langzeitlagerung wurden ca. 5x10⁶ Zellen in 1ml Einfriermedium aufgenommen und nach einem Gefrierschritt bei –80°C in flüssigem Stickstoff bei –196°C gelagert. Das Einfriermedium enthält 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), welches die Kristallisation von intrazellulärem Wasser und die damit verbundene Zerstörung der Zellmembranen durch die wasserbedingte Volumenzunahme verhindern kann. Da DMSO bei RT toxisch auf die Zellen wirkt, wurden alle Einfrierschritte auf Eis bzw. bei 4°C durchgeführt.

Zum Auftauen wurden die Zellen zügig im Wasserbad bei 37°C erwärmt, tropfenweise in kaltes Kulturmedium überführt und abzentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in Kulturmedium resuspendiert und in geeigneter Zelldichte in Kulturgefäße ausgesät.

Die Übertragung von Fremd-DNA in die Zellen erfolgte mit Hilfe verschiedener kommerziell erhältlicher Transfektionsreagenzien auf Lipid-Basis. Bei Lipofectin, Lipofectamine, DMRIE-C, Cellfectin (Invitrogen) und DAC-30 handelt es sich um Liposomen, bei Superfect, Effectene (Qiagen) und FuGene6 (Roche) um nicht-liposomale Transfektionsreagenzien. Alle Transfektionen erfolgten nach Angaben der Hersteller. Um die Effizienz der Genübertragung von DAC-30 zu erhöhen, wurde Protaminsulfat (PS, 1mg/ml) 1:50 zugesetzt.

Tabelle 2: Eine Auswahl der verwendeten Transfektionsreagenzien und ihrer Helferlipide

Um die besten Transfektionsbedingungen für jedes Reagenz zu bestimmen, wurden zunächst Markergene (E. coli β-Galaktosidase [β-gal], Enhanced Green Fluorescent Protein [EGFP]) in HCEC übertragen und die Effizienz des Gentransfers sowie die Toxizität der Reagenzien ermittelt. Lipide und Plasmid-DNA wurden in verschiedenen Konzentrationen und Mischungsverhältnissen in ihrer Wirkung auf die Zellen ausgetestet. Von β-gal transfizierten Zellen wurden Fotos angefertigt und der EGFP-Gentransfer am Durchflusszytometer (FACS) charakterisiert.

Die Effizienz des β-Galaktosidase-Gentransfers wurde 24h nach Transfektion durch Färbung der transfizierten Zellen ermittelt. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in einer Formaldehyd[2%]/Glutaraldehyd[0,2%]-Lösung für 10min bei 4°C fixiert. Die Zellen wurden erneut gewaschen und anschließend in einer 1%igen X-gal-Lösung inkubiert. Nach 24h bei 37°C folgte ein weiterer Waschschritt und die Zellen konnten in PBS bei 4°C aufbewahrt werden. Zur Dokumentation der Gentransfer-Effizienz wurden Fotografien angefertigt.

Fluoreszierende Zellen können mit Hilfe des Durchflusszytometers (FACS) untersucht werden. Es erfasst Farbstoffe, die das gleiche Anregungsspektrum besitzen (488nm), jedoch unterschiedliche Emissionsspektren aufweisen. EGFP-transfizierte Zellen fluoreszieren grün (508nm) und lassen sich in der 1. Fluoreszenz messen. Eine Färbung mit Propidiumiodid (PI) ist bei Zellen möglich, die ihre Membranintegrität verloren haben. PI weist eine besondere Affinität zu Nukleinsäuren auf und kann durch permeable Membranen in die Zelle diffundieren und dort die DNA rot anfärben. Dies lässt Rückschlüsse auf die Toxizität der Untersuchungen zu. Die rote, PI-vermittelte, Fluoreszenz (620nm) kann in der 2. und 3. Fluoreszenz gemessen werden. 24h nach Transfer des EGFP-Plasmids in HCEC mit Hilfe der verschiedenen Reagenzien in unterschiedlichen Versuchsansätzen, erfolgte die Quantifizierung der grün und rot fluoreszierenden Zellen. Die HCEC wurden hierfür trypsiniert, pelletiert und in 200µl PI (50µg/ml in PBS) resuspendiert. Es folgte eine Inkubation von 20min auf Eis unter Lichtausschluss. Bei der anschließenden FACS-Messung wurde parallel der prozentuale Anteil von grün (transfiziert) und rot (avital) fluoreszierenden Zellen pro Ansatz ermittelt. Daraus konnten direkt Rückschlüsse auf Effizienz und Toxizität der Versuche gezogen werden.

Anschließend erfolgte der Gentransfer des Fibroblasten-Wachstumsfaktors-1 (FGF-1, aFGF) unter den für jedes Transfektionsreagenz ermittelten optimalen Bedingungen. Nach der Transfektion wurden die Zellen über eine Woche in Kultur gehalten und an den Tagen 4 und 7 mit Hilfe der Trypanblau-Färbung in der Zählkammer quantifiziert.

Zur optischen Beurteilung der Morphologie der HCEC an den Tagen 4 und 7 nach aFGF-Gentransfer wurden in der Augenklinik von Frau Sänger elektronen-mikroskopische Aufnahmen angefertigt. Dazu wurden die Zellen vor der Transfektion in 24-Loch-Platten ausgesät, die 13mm Zell-Kultur Deckgläschen enthielten. An den Tagen 4 und 7 wurden die transfizierten Zellen in 2,5% Glutaraldehyd fixiert und in 2% Osmiumtitroxid nachfixiert. Anschließend erfolgte ein Entwässerungs- und Trocknungsschritt in Alkohol und Hexamethyldiselazane. Die Deckgläschen, auf denen sich die Zellen befanden, wurden auf Präparatehalter aufgeklebt und mit Gold besprüht. Anschließend konnten die Aufnahmen angefertigt werden.

Für den biochemischen Nachweis des aFGF-Proteins in den transfizierten Zellen, wurden diese lysiert. Dafür wurden die Gentransfer-Experimente in 6cm-Schalen durchgeführt, um ausreichend große Mengen an Zellextrakt für den Proteinnachweis zu gewinnen. An den Tagen 4 und 7 nach Transfektion wurden die Zellen trypsiniert, pelletiert, 1x mit PBS gewaschen und in 50µl kaltem Lysispuffer, der Proteinase-Inhibitoren enthielt, resuspendiert. Die Fragmente wurden erneut pelletiert und der die löslichen Zellproteine enthaltende Überstand gesammelt und bei –80°C eingefroren.

Die Gesamtproteinbestimmung erfolgte mit dem Micro-BCA-Protein Test der Firma Pierce. Damit können Proteinkonzentrationen von 0,5-20µg/ml erfasst werden. Dieser Test beruht auf der Eigenschaft von Proteinen, mit Cu²⁺-Ionen im alkalischen Milieu blaue Farbkomplexe zu bilden. Die photometrische Messung dieser Komplexe erfolgte bei 562nm. Untersucht wurde der Proteingehalt von aFGF-transfizierten HCEC. Um in dem Messbereich des Tests zu bleiben, mussten die lysierten Zellen 1:50 in PBS verdünnt werden. Über eine BSA-Verdünnungsreihe wurde eine Eichkurve erstellt, aus der der Proteingehalt der Proben direkt abgelesen werden konnte. Über die eingesetzte Probenmenge konnte die Gesamtproteinkonzentration in 1ml Probe ermittelt werden.

Für die Auftrennung der Proteine wurden 100µg Gesamtprotein von jedem Zelllysat pro Geltasche aufgetragen. Zuvor wurde das entsprechende Lysatvolumen 1:1 mit Probenpuffer versetzt und 3 min bei 95°C aufgekocht. Nach Beendigung des Gellaufs folgte der Transfer der aufgetrennten Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran. Zur Überprüfung wurde diese nach dem Transfer in Ponçeau-Lösung überführt, wobei die Proteinbanden rot angefärbt wurden. Nach dem Blocken (4°C ü.N. oder RT 1h) in 5% Milchpulver in TBST konnte die Antikörper-Färbung durchgeführt werden. Die Antikörper wurden in 3% BSA/TBST verdünnt, anti-aFGF 0,1 mg/ml, das Peroxidase-Konjugat 1:10 000. Die Inkubationszeit betrug jeweils 1 h. Nach einer abschließenden Spülung in TBST erfolgte die Entwicklung des Blots mit Hilfe des ECL-Assays von Amersham. Die entwickelte Membran wurde in eine Filmkassette eingelegt und anschließend in der Dunkelkammer entwickelt.

Die adenoviralen Vektoren, die in dieser Arbeit Anwendung fanden, wurden in der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. Thomas Ritter, Institut für Medizinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin, hergestellt.

Über homologe Rekombination der Zielgen-DNA aus dem rekombinanten pACCMV-Vektor in die E1-Region des adenoviralen Plasmids pJM17 entstanden während einer Ko-Transfektion mittels Kalzium-Phosphat in eine Verpackungszelllinie (911, 293) rekombinante Adenoviren, die jedoch außerhalb der Verpackungszelllinie replikationsdefizient sind. Rekombinante Adenoviren weisen aus Gründen der biologischen Sicherheit und zur Steigerung der Verpackungskapazität eine Deletion im, für die Virusreplikation wichtigen, E1-Leserahmen auf und sind damit nur in speziellen Verpackungszelllinien, die die adenoviralen E1A- und E1B-Proteine konstitutiv exprimieren, in der Lage, sich zu replizieren. Nach Überprüfung, Vermehrung und Aufreinigung im Cäsium-Chlorid-Gradienten konnten die adenoviralen Konstrukte in weiterführenden Studien eingesetzt werden. Folgende Konstrukte kamen in den Experimenten zur Anwendung: AdvIL-10, AdrIL-4, AdEGFP, Adβ-gal und Ad dl 312 (Ad0). Nach persönlicher Mitteilung von Dr. Ritter konnten die Bioaktivitäten der Virus-kodierten vIL-10 (Dissertation von Frau Dipl.-Biol. Christine Brandt) und IL-4 Zytokingene nachgewiesen werden.

Die Zellen wurden am Tag vor der Transduktion ausgesät, sodass sie für den adenoviralen Gentransfer eine Konfluenz von 80% aufwiesen. Pro Vertiefung wurden in 300µl DMEM mit 2% FKS 50-1000 plaque forming units (pfu) AdEGFP und zusätzlich 8µg/ml Polybren zur Erhöhung der Transduktionseffizienz pipettiert (Plaque forming unit ist ein Standard-Ausdruck für die Fähigkeit der hergestellten rekombinanten Viren, auf der Verpackungszelllinie infektiöse Plaques auszubilden). Nach einer zweistündigen Inkubationszeit wurde das Medium gewechselt und die Zellen 24h später durchflusszytometrisch auf ihre GFP-Expression hin untersucht.

Aus dem Spendertier (Wistar-Furth Ratte) wurde mit Hilfe eines 3,5mm Trepans die zentrale Hornhaut ausgestanzt und sofort in 24-Loch-Zellkulturplatten mit je 1ml DMEM ohne FKS überführt. Es wurde darauf geachtet, dass die Endothelzellschicht der Kornea nach oben zeigte. Das Medium wurde entfernt und gegen 500µl Transduktionslösung mit 1x10⁸ pfu/Kornea ausgetauscht. Dabei war es wichtig, dass die Hornhaut vollständig mit der Transduktionslösung bedeckt war. Nach drei Stunden Inkubation im Brutschrank bei 37°C wurde die Lösung vorsichtig abgezogen und die Hornhaut dreimal zur Entfernung freier Viruspartikel gewaschen. Anschließend wurde die Kornea mit 500µl DMEM ohne FKS versetzt und weitere drei Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit konnten die Hornhäute entweder nach Zugabe von DMEM mit 2 % FKS und Amphotherizin B (1:1000) weiter ex vivo kultiviert und der Überstand zu verschiedenen Zeitpunkten zur Analyse der Zytokinproduktion entnommen werden, oder direkt der allogenen Hornhauttransplantation zugeführt werden.

	Abbildung 7: Schematische Darstellung der Methode der ex vivo-Transduktion einer Rattenhornhaut aus: PD Dr. T. Ritter (Habilitationschrift).

Zur Bildung der Transfektions-Komplexe wurde parallel zur Kornea-Entnahme das Liposom Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in verschiedenen Konzentrationen, 10µg Transferrin (Sigma) und 1µg des Plasmids pcDSRα-BCRF1 (PD Dr. Thomas Ritter, Berlin), das unter der Kontrolle eines SV40-Promotors für vIL-10 kodiert, zusammenpipettiert und mit serumfreiem Opti-MEM^®-Medium auf ein Gesamtvolumen von 250µl aufgefüllt. Diese Mischung wurde 30min zur Komplexbildung bei RT inkubiert. Die frisch entnommenen Hornhäute wurden mit PBS gespült und anschließend in jeweils 250µl Opti-Mem und Transfektionslösung aufgenommen.
Auch hier wurde darauf geachtet, dass die Hornhaut vollständig mit der Transfektionslösung bedeckt war. Nach drei Stunden Inkubation im Brutschrank bei 37°C wurde die Lösung vorsichtig abgezogen und die Hornhaut dreimal zur Entfernung der Komplexe gewaschen. Anschließend wurde die Kornea mit 500µl DMEM ohne FKS versetzt und weitere drei Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit konnten die Hornhäute entweder nach Zugabe von DMEM mit 2 % FKS und Amphotherizin B (1:1000) weiter ex vivo kultiviert und der Überstand zu verschiedenen Zeitpunkten zur Analyse der Zytokinproduktion entnommen werden, oder direkt der allogenen Hornhauttransplantation zugeführt werden.

Zur Quantifizierung der Zytokinproduktion durch die adenoviral transduzierten oder liposomal transfizierten Hornhäute wurden die Überstände der Korneae zu verschiedenen Zeitpunkten nach Gentransfer geerntet und mittels ELISA analysiert. Die Messung der vIL-10-Produktion erfolgte über den kommerziell erhältlichen ELISA-Kit der Firma Coulter-Immunotech (Hamburg). Der rIL-4-ELISA wurde am Institut für Medizinische Immunologie (Charité-Universitätsmedizin Berlin) in der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. T. Ritter etabliert. Hierfür wurde ein aus OX-81 Hybridoma Zellen gewonnener anti-Ratten-IL-4 monoklonaler Antikörper (0,81mg/ml 1:500 in 0,1M Karbonatpuffer, 50µl/Loch) über Nacht bei 4°C an eine 96-Loch-Platte gebunden. Am nächsten Tag wurde der Beschichtungspuffer verworfen und die Platte mit 100µl Blockpuffer/Loch für 2h bei Raumtemperatur geblockt. Anschließend wurden Standard (rekombinantes Ratten IL-4) und Proben in entsprechenden Verdünnungen mit 50µl/Loch aufgetragen und 2h schüttelnd bei RT im Dunkeln inkubiert. Nach vier Waschschritten wurde der sekundäre Antikörper (anti-Ratten-IL-4-biotinyliert, 0,5mg/ml) 1:500 in Verdünnungspuffer zu je 50µl/Loch aufgetragen und für 1h inkubiert. Nach weiteren 4 Waschschritten wurde Streptavidin-Peroxidase (0,64mg/ml) 1:2000 verdünnt und mit je 50 µl/Loch in die Vertiefungen pipettiert. Nach der einstündigen Inkubationszeit und den 4 Waschschritten wurden 50µl Substrat A+B (1:1) pro Vertiefung zugegeben und 30 min inkubiert. Schließlich wurde die Reaktion mit 1M Schwefelsäure (50µl/Loch) abgestoppt und die Extinktion bei 450nm gemessen.

Alle Tierversuche wurden nach den Anforderungen der „Guiding Principles in the Care of Animals“ des National Institute of Health, Bethesda und den Richtlinien der Senatsverwaltung Berlin, durchgeführt. Es wurde nur jeweils ein Auge transplantiert, sodass die Tiere auf der anderen Seite ihre Sehkraft behielten.

Die Korneatransplantationen der adenoviral transduzierten Hornhäute wurden von Frau MUDr. Klará Sedláková, die der liposomal transfizierten Hornhäute von Dr. Nianqiao Gong durchgeführt.
Für die Versuche wurden 8-10 Wochen alte, weibliche Ratten mit einem Gewicht von 200-250g verwendet. Es wurden Zuchtlinien verwendet, die sich in ihren MHC Klasse I und II Histokompatibilitätsantigenen unterscheiden (Gill et al., 1987).

Das Spendertier (Wistar Furth, WF) wurde durch eine Inhalationsnarkose eines Gemischs von CO₂ und Lachgas in einer in der tierexperimentellen Anlage vorhandenen Einrichtung getötet. Nachfolgend wurde mit einem 3,5mm Trepan die Hornhaut entnommen und ex vivo transduziert oder transfiziert. Das Empfängerauge wurde vor dem Eingriff mit 1% Atropin Sulfat weitgetropft, um Irisschäden während der Transplantation zu vermeiden. Die Empfängertiere erhielten eine intramuskuläre Injektion einer Kombination aus Ketavet (16,5 mg/Tier (200g)) und Rompun (0,7 ng/Tier (200g)) zur Anästhesie. Mit einem 3,0mm Trepan wurde aus dem Empfängertier die rechte Hornhaut ausgestanzt und die transduzierte Spenderhornhaut mittels durchgehender Naht eingesetzt. Um die Augenvorderkammer zu stabilisieren und Linsen- und Iris-Schädigungen zu vermeiden, wurde eine viskoelastische Substanz (Healon) eingebracht, die vor dem Verschluss der Wunde wieder entfernt wurde. Eine kleine Luftblase, die anschließend in die Vorderkammer eingebracht wurde, diente dazu, die frisch eingesetzte Kornea von der Iris zu trennen (Pleyer et al., 1995). Das Nahtmaterial verblieb bis zum Versuchsende im Auge. Die transplantierten Tiere wurden unter dem Operationsmikroskop dreimal innerhalb der ersten postoperativen Woche und anschließend täglich kontrolliert. Der Grad der Korneatrübung diente als Indikator für die Transplantat-Abstoßung. Bei einer Bewertungs-Skala von 0-4 galt eine Trübung von 3 oder höher als abgestoßen. Am Tag der Abstoßung bzw. 10 Tage post OP wurden bei einigen Gruppen das Transplantat, die drainierenden Lymphknoten und die Milzen entnommen. Die Transplantate wurden für die Histologie in OCT eingebettet. Mit Lymphknoten und Milzen wurde am Tag der Entnahme eine gemischte Lymphozytenkultur angesetzt.

Als Kontrollen dienten nicht-transduzierte allogene (WF) und syngene (Lewis, Lew) Hornhauttransplantate, sowie mit einem Adenoviruskonstrukt ohne therapeutisches Gen (Ad0) bzw. mit Adβ-gal transduzierte syngene und allogene Hornhäute. In der Liposomenkontrollgruppe wurden Hornhäute verwendet, die nur mit dem Liposom und Transferrin, ohne Plasmid behandelt worden waren.

Für die gemischte Lymphozytenkultur wurden die drainierenden zervikalen Lymphknoten und die Milzen der Kornea-transplantierten Lewis-Ratten am Tag der Abstoßung bzw. am Tag 10 post OP entnommen und bearbeitet. Zunächst erfolgte die Isolation der Lymphozyten, indem die Lymphknoten durch Nylon-Zellsiebe (100µm und 40µm) gestrichen wurden. Die Lymphozyten wurden in PBS oder Medium gesammelt, zentrifugiert (1200rpm, 4°C, 5min) und in 3ml frischem PBS resuspendiert.

Die Milzen wurden durch ein grobes Metallsieb und anschließend durch ein 40µm Nylon-Zellsieb passiert, in PBS gewaschen und in 20ml PBS resuspendiert. Anschließend wurden 3ml Ficoll mit 4ml der Milzzellsuspension überschichtet (Pancoll Ratte: Dichte 1,091g/ml) und der Gradient bei Raumtemperatur und 370xg für 40min ausgebildet. Nach der Zentrifugation konnte der helle, die Lymphozyten enthaltende Ring in der Mitte des Gradienten abgesaugt und in ein neues Röhrchen überführt werden. Es folgten zwei Waschschritte mit Medium und vor der Färbung ein weiterer Waschschritt mit PBS, bevor die Zellen in 20ml PBS resuspendiert wurden.

Für die Präparation von Stimulatorzellen (allogene Wistar-Furth-Zellen und syngene Lewis-Zellen zur Stimulation über Donor-Antigene), schloss sich ein Bestrahlungsschritt zur Hemmung der Proliferation an, bei dem die Zellen 30 Gray ausgesetzt und anschließend bei -80°C eingefroren wurden.

Bei CFDA-SE handelt es sich um einen grün fluoreszierenden Membranfarbstoff, der bei Zellteilungen mit abnehmender Intensität an die Tochterzellen weitergegeben wird. Dies lässt sich per Durchflusszytometrie messen und erlaubt Aussagen über die Zellteilungsaktivität der stimulierten Lymphozyten. Die präparierten Lymphozyten wurden gezählt und anschließend mit 1ml 2,5µM CFDA-SE/1x10⁷ Zellen für exakt 3min gefärbt. Nach der Färbung folgten drei Waschschritte mit Medium und ein erneutes Zählen, da bei der Färbeprozedur viele Zellen zugrunde gehen. Nach Ermittlung der endgültigen Zellzahl wurden die gefärbten Lymphozyten mit bestrahlten Stimulatorzellen (Lewis-Milz-Lymphozyten bzw. Wistar-Furth-Milz-Lymphozyten) ko-kultiviert. Dazu wurden je 3x10⁵ Stimulator- und Responderzellen in 96-Loch-Rundbodenplatten in 200µl T-Zell-Medium mit 2% autologem (Lewis-) Serum pipettiert und für 4 Tage im Brutschrank kultiviert. Zur Gewinnung des autologen Serums wurde das kardial gewonnene Blut bei 4500 rpm und 4°C für 10 min zentrifugiert und der so entstandene Serumüberstand abgenommen. Am Tag 1 nach Versuchsansatz folgte die Einstellung der zu analysierenden Proben am FACS-Gerät.

Durch Färbung mit CFDA-SE sollten Unterschiede in den Immunreaktionen zwischen den verschiedenen Transplantationsgruppen sichtbar gemacht werden. Die Antikörperfärbung gegen TCR und die Isotypenkontrolle wurden gemäß den Herstellerangaben für die Färbung eingesetzt. Die Antikörperfärbung erfolgte nach sorgfältigem Durchmischen der Proben bei 4°C für 15 min. Die Messungen wurden an einem FACSort Durchflusszytometer (Becton Dickinson) durchgeführt und mit Hilfe der Cellquest-Software (Becton Dickinson) ausgewertet. Aufgrund der Vielzahl der Messungen und der natürlich bedingten Abweichungen im biologischen System wurden für die Auswertung der FACS-Messungen individuelle „Gates“ gesetzt (nach Rücksprache mit Herrn PD Dr. F. Kern, Institut für Medizinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin, Berlin).

Sämtliche histologischen Untersuchungen wurden von Frau Nadine Schmidt durchgeführt und sind Bestandteil ihrer Dissertation zum Dr. med.. Die Hornhäute der Ratten wurden an den Tagen 10, 17 und 24 nach Transplantation entnommen, OCT-fixiert und kryokonserviert. Nach Anfertigung von Gewebeschnitten erfolgte mit Hilfe der Avidin-Biotin-Komplex-Methode die monoklonale Antikörperfärbung für CD4, CD8, CD25, CD45, NK-Zellen und Monozyten. In dieser Arbeit sind nur die Färbungen für CD4 und CD8 dargestellt.

Alle Ergebnisse sind, wenn nicht anders angegeben, als Mittelwerte plus/minus Standardfehler (standard error mean, SEM) dargestellt. Die Angabe der mittleren Überlebenszeit nach Transplantation erfolgte als Median. Aussagen zur statistischen Signifikanz wurden nach Anwendung des Student’s T-Tests bzw. nach Berechnung von Chi-Quadrat Werten während der postoperativen Nachbeobachtungszeit getroffen (Log-Rank-Test).

Die Chemikalien für die Lösungen wurden von den Firmen Roth (Karlsruhe, D), Fluka (Deisenhofen, D), Serva (Heidelberg, D), Merck (Darmstadt, D), Boehringer (Mannheim, D), Gibco BRL (Gaithersburg, USA), Riedel-de Haen (Seelze, D), Baker (Deventer, NL), Invitrogen (Groningen, NL), DIFCO (Detroit, USA), Heraeus (Osterode, D), Pharmacia (Uppsala, S), AGS (Heidelberg,D) und Sigma (Deisenhofen, D) bezogen.

Tabelle 3: Zusammensetzungvon Trenn- und Sammelgel in den verwendeten Konzentrationen.

Nach Autoklavieren und Abkühlen kann das entsprechende Antibiotikum (Stammlösung 100mg/ml) in einer Konzentration von 100µg/ml hinzugefügt werden.

für Hornhäute zusätzlich Amphoterizin B 1:1000