3 Ergebnisse

3.1 Nicht-viraler Gentransfer in humane korneale Endothelzellen

3.1.1 Optimierung der Gentransfer-Bedingungen für HCEC

3.1.1.1 Beta-Galaktosidase (β-gal)-Test

▼ 41 

Für die Transfektion der HCEC standen acht verschiedene, kommerziell erhältliche Transfektionsreagenzien (TR) auf Lipid-Basis zur Verfügung (Lipofectin, Lipofectamine, DMRIE-C, Cellfectin, FuGene6, Effectene, Superfect, DAC-30). Für jedes Reagenz musste zunächst geprüft werden, ob und unter welchen Bedingungen es für die Transfektion der HCEC geeignet ist. Die Zellen wurden dazu am Vortag der Transfektion in einer Dichte von 4x104 Zellen/ml in 24-Loch-Zellkulturplatten ausgesät. Am Tag der Transfektion hatten sie eine Konfluenz von 40-60% erreicht, die laut Herstellerangaben für den Einsatz aller verwendeten TR erforderlich war. Es folgte die Transfektion der Zellen mit dem Markergen β-Galaktosidase (β-gal) in verschiedenen Konzentrationen der TR und unterschiedlichen Lipid:DNA-Ratios, die vom Hersteller empfohlen wurden. Tabelle 4 zeigt die für jedes TR getesteten Bedingungen.

Tabelle 4: Überblick über die verwendeten Transfektionsreagenzien (TR).Die Konzentrationen und Lipid:DNA-Ratios für die einzelnen TR wurden nach Angaben der Hersteller eingesetzt und für HCEC optimiert.

Lipid-Name

Abkürzung

Plasmid-Konzentration

Lipid:DNA-Ratio

Lipofectin

LF

0,3-10 µg

6,25:1

Lipofectamine

LFA

0,3-10 µg

6,25:1

DMRIE-C

DM

0,3-10 µg

6,25:1

Cellfectin

CF

0,25-7,5 µg

6,25:1

Fugene

FU

0,3-12 µl

3:2; 3:1; 6:1

Effectene

EF

1-20 µg

10:1; 25:1; 50:1

Superfect

SF

3-60 µg

3:2; 3,75:1; 7,5:1

DAC-30

DAC

0,2-10 µg

2:1; 5:1; 10:1

DAC-30 mit

Protaminsulfat

DPS

0,2-10 µg

2:1; 5:1; 10:1

24h nach Transfektion, erfolgte die Färbung der β-gal-transfizierten Zellen sowie die Anfertigung lichtmikroskopischer Fotografien. Anhand dieser Abbildungen konnte die Effizienz der Markergen-Transfektion, ebenso wie eine eventuelle Toxizität der verwendeten Lipide abgeschätzt werden (Abb. 8).

▼ 42 

Abbildung 8: Transfektion von HCEC mit β-gal und ausgewählten Lipiden. Gezeigt sind Darstellungen von einem repräsentativen Experiment, mit den verwendeten Lipid-Konzentrationen und Lipid:DNA-Ratios.

3.1.1.2 Durchflusszytometrie zur exakten Bestimmung von Effizienz und Toxizität der verwendeten Lipide

Anhand der β-gal-Experimente konnte eine Vorauswahl für geeignete Transfektionsbedingungen eines jeden Lipids getroffen werden. Jeweils drei Lipid-Konzentrationen bzw. Lipid:DNA-Ratios wurden für den Markergentransfer mit EGFP ausgewählt (Abb. 9). Da EGFP-transfizierte Zellen grün fluoreszieren, kann am FACS-Gerät der prozentuale Anteil der transfizierten Zellen bestimmt werden. Um gleichzeitig eine Aussage zur Toxizität zu erhalten, wurden die Zellen unmittelbar vor der Messung mit Propidium-Iodid behandelt, welches avitale Zellen rot fluoreszieren lässt. So konnte in einem Messgang der Einfluss der eingesetzten TR auf die HCEC bezüglich Effizienz und Toxizität der Transfektion ermittelt werden (n=6) (Abb. 9).


Abbildung 9: Durchflusszytometrische Ermittlung von GFP-positiven (Effizienz) und avitalen Zellen (Toxizität). Dargestellt ist der prozentuale Anteil von GFP-positiven und PI-gefärbten Zellen bei verschiedenen Konzentrationen und Lipid:DNA-Ratios der einzelnen TR. Nicht-transfizierte Zellen dienten als Kontrollen. (A) zeigt die für die weiteren Versuche genutzten TR, in (B) sind die drei TR dargestellt, die aufgrund ihrer hohen Toxizität für die weiteren Versuche nicht mehr verwendet wurden (n=6).

▼ 43 

Aus den erhaltenen Daten wurden nun die optimalen Transfektionsbedingungen für jedes TR ausgewählt. Ausschlaggebend war eine geringe Toxizität, verbunden mit möglichst hoher Effizienz, nicht jedoch die höchste Effizienz, die von den TR erreicht wurde. Dies scheint für klinische Ansätze sinnvoller, da in jedem Fall möglichst viele Zellen des Hornhautendothels erhalten bleiben sollen. Unter diesen Voraussetzungen wurden folgende Lipid-Konzentrationen und Lipid:DNA-Ratios ausgewählt:

Tabelle 5: Zusammenfassung der ermittelten optimalen Lipidkonzentrationen und Lipid:DNA-Ratios, einschließlich der damit erreichten Effizienzen und Toxizitäten der getesteten Transfektionsreagenzien.

Lipid

Konzentration

Ratio

Effizienz

Toxizität

LF

1,25 µg

6,25:1

17 %

9 %

DM

2,5 µg

6,25:1

11 %

11 %

FU

6 µl

6:1

9 %

11 %

EF

2,5 µg

25:1

9 %

10 %

DAC

1 µg

10:1

7 %

10 %

DPS

1 µg

10:1

9 %

10 %

N

0 %

7 %

Da die unbehandelten Zellen (N) einen normalen Zellverlust von 7% aufwiesen, wurde dieser Wert von den Toxizitäten der mit Lipiden behandelten Zellen abgezogen, sodass eine Lipid-verursachte Toxizität von ca. 3% für die behandelten Zellen resultierte.

▼ 44 

Lipofectamine, Cellfectin und Superfect zeigten extrem hohe Toxizitäten, sodass diese TR als ungeeignet für die Transfektion von HCEC eingestuft und von den weiteren Versuchen ausgeschlossen wurden (Abb. 9).

Es zeigte sich, dass bei allen TR, außer bei Lipofectin, in Abhängigkeit von der Lipid:DNA-Ratio, mit steigenden Lipid-Konzentrationen die höchsten Gentransfer-Effizienzen erreicht wurden, die jedoch mit hoher Toxizität verbunden waren. Bei Effectene erhöhte sich die Toxizität mit abnehmender Lipidkonzentration und geringerer Lipid:DNA-Ratio, ebenso wie die Effizienz. Lipofectin erreichte als einziges TR die höchste Effizienz mit gleichzeitig abnehmender Toxizität, wenn Lipid- und DNA-Konzentration verringert wurden.

3.1.2 Proliferationsanalyse der HCEC nach Gentransfer von aFGF

Da Hornhaut-Endothelzellen normalerweise nicht oder nur in geringem Maße proliferieren, sollte überprüft werden, ob und wie stark die Expression des Wachstumsfaktors aFGF durch die Zellen, ihre Proliferation steigern kann.

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Dazu wurden die zuvor bestimmten optimalen Transfektionsbedingungen für jedes TR eingesetzt. Um die Zellproliferation zu testen, wurden die Zellen am 4. und 7. Tag nach Transfektion gezählt. Die ermittelten Zahlen wurden prozentual bezogen auf nicht-transfizierte Kontroll-Zellen dargestellt (Abb. 10). Als Positivkontrollen dienten mit jeweils 10 ng/ml bovinem und humanem rekombinanten aFGF behandelte HCEC. Als Negativ-Kontrolle wurden HCEC, transfiziert mit pcDNA-βgal ausgezählt.

Abbildung 10: Proliferation von HCEC nach Transfektion mit dem aFGF-Expressionsvektor und verschiedenen Transfektionsreagenzien. (A) Zellen, die mit DAC-30 transfiziert wurden, zeigen den stärksten proliferativen Effekt, gefolgt von DAC-30 + PS und Lipofectin (n=11). Nahezu keine Proliferationssteigerung ist nach Gentransfer mit Fugene, Effectene und DMRIE-C ersichtlich (n=11). Exogene Zugabe von humanem rekombinantem (n=6) und bovinem aFGF (n=13) diente mit 10ng/ml als Positivkontrolle in nicht-transfizierten Zellen. Mit β-gal-transfizierte Zellen (n=5) als Negativkontrolle. (B) zeigt als weitere Kontrolle die Behandlung der Zellen mit den jeweiligen Lipiden ohne Plasmid (n=5). N=nicht-transfizierte Zellen (n=9); Signifikanz: *p<0,05, **p<0,006 bezogen auf nicht-transfizierte Zellen.

Die Unterschiede der erreichten und ausgewählten Gentransfer-Effizienzen (7-17 %) und Toxizitäten (3 %) zwischen den einzelnen TR waren relativ gering. Trotzdem zeigten sich nach aFGF-Gentransfer signifikante Unterschiede im Proliferationsverhalten der transfizierten HCEC (Abb.10). Interessanterweise steigerte DAC-30/aFGF-Gentransfer die Zellproliferation um 45 % an Tag 4 und um 35 % an Tag 7 nach Transfektion, obwohl dieses Lipid die niedrigste Gentransfer-Effizienz (7 %) erreichte. Mit DAC-30 + PS (40 % Tag 4; 30 % Tag 7) und Lipofectin (30 % Tag 4; 20 % Tag 7), die jeweils 9 % bzw. 17 % der Zellen transfizierten, konnte ebenfalls eine deutliche Steigerung der Wachstumsrate der Zellen erzielt werden. Fugene/aFGF zeigte an Tag 4 eine stimulierende Wirkung (14 %), die jedoch an Tag 7 nicht mehr nachweisbar war und mit DMRIE-C und Effectene konnte weder am 4. noch am 7. Tag eine Erhöhung der Proliferationsrate der transfizierten Zellen festgestellt werden.

▼ 46 

Die ermittelte Proliferationssteigerung hatte ihr Maximum an Tag 4 nach Transfektion und nahm bis zum Tag 7 um ca. 10 % ab. Am 14. Tag nach Transfektion war kein Effekt mehr sichtbar (ohne Abb.).

Zusätzlich wurden Raster-Elektronen-mikroskopische Aufnahmen der Zellen an den Tagen 4 und 7 nach Gentransfer von aFGF angefertigt (Abb. 11). DAC-30 (A+E), Lipofectin (B+F) und nicht-transfizierte Zellen (C+G) zeigen keine negativen Effekte auf die Zell-Morphologie, während FuGene-behandelte Zellen (D+H) am Tag 7 zytopathische Effekte entwickeln.

3.1.3 Expression von aFGF nach Gentransfer in HCEC

▼ 47 

Da aFGF keine klassische Signalsequenz zur Sekretion aus der Zelle besitzt, wurde zur Überprüfung der aFGF-Expression nach Gentransfer durch die verschiedenen Lipide ein Western Blot der Zelllysate durchgeführt. Dazu wurden Tag 4- und Tag 7-Lysate der transfizierten Zellen hergestellt und mit gleicher Gesamtproteinkonzentration (100 µg) aufgetragen und getestet. Das aFGF-Protein konnte in allen transfizierten Zellen nachgewiesen werden, unabhängig vom verwendeten Lipid (Abb. 12). Es konnte jedoch weder in Zellen, denen aFGF exogen zugeführt worden war noch in nicht-transfizierten Zellen nachgewiesen werden. Die an Tag 7 festgestellte abnehmende Wirkung von aFGF auf die Zellproliferation konnte hier mit einer verringerten Expression des Wachstumsfaktors an Tag 7 im Vergleich zu Tag 4 bestätigt werden. Zusätzlich konnten die mit DAC, DPS und LF transfizierten Zellen als stärkste aFGF-Produzenten identifiziert werden, was ebenfalls durch die Proliferationsergebnisse Bestätigung findet.

Abbildung 12: Western Blot zur Bestimmung der Expression von aFGF.Die Expression von aFGF ist in transfizierten HCEC an Tag 4 (A) und 7 (B) mit Lipofectin (LF), DAC-30 (DAC), DAC-30 + PS (DPS) und Kontrollen dargestellt. Als Positivkontrolle dienten 50ng humanes rekombinantes aFGF (PC). Expression wurde in allen transfizierten Zellen festgestellt, mit abnehmender Quantität von Tag 4 zu Tag 7. Keine Expression zeigte sich in nicht-transfizierten Zellen (non) und Zellen, die mit 10ng/ml exogenem humanen rekombinanten aFGF (hr aFGF exogen) behandelt worden waren.

3.2 Einsatz von Gentransfermethoden in der Keratoplastik

3.2.1 Adenoviraler Gentransfer

Als eine weitere Möglichkeit des Gentransfers in korneale Endothelzellen wurden adenovirale Vektoren genutzt. Adenoviren führen ebenso wie der liposomale Gentransfer zu einer transienten Genexpression, die optimal für eine Modulation des Zytokinprofils (Th1/Th2) unmittelbar nach der Transplantation geeignet ist. Zytokin-exprimierende adenovirale Vektoren wurden bereits erfolgreich in Modellen von Herz- und Nierentransplantationen eingesetzt. Der Vorteil adenoviraler Vektoren gegenüber dem liposomalen Gentransfer liegt in ihrer wesentlich höheren Gentransfereffizienz. Zudem standen die für diese Arbeit verwendeten Adenoviruskonstrukte (AdvIL-10, AdrIL-4) bereits zur Verfügung, sodass die zeitaufwändigen Klonierungsarbeiten entfallen konnten.

▼ 48 

Zunächst wurde die Effizienz des adenoviralen Gentransfers in HCEC mit Hilfe des Reportergenkonstruktes AdEGFP und anschließender FACS-Analyse bestimmt. Da sich dies als überaus erfolgreich erwies und das Hornhautendothel eine wichtige Zielstruktur bei der Abstoßung kornealer Transplantate ist, wurden im nächsten Schritt Rattenhornhäute ex vivo mit demselben Konstrukt (AdEGFP) transduziert und Gewebeschnitte angefertigt, um mittels Fluoreszenzmikroskopie die transduzierten Zellen bzw. Gewebe nachzuweisen.

Der Ermittlung des Transduktionserfolgs für das Hornhautendothel auch an der ganzen Kornea folgten weitere ex vivo-Transduktionen mit adenoviralen Konstrukten für die immunregulatorisch wirkenden Zytokingene vIL-10 und der Kombination aus vIL-10 und rIL-4, mit jeweils anschließender Bestimmung der Zytokinproduktion durch die Hornhäute. Diese Versuche waren die Basis für den nachfolgenden in vivo-Einsatz der mit diesen Zytokingenen transduzierten Korneae, zur Modulation der Immunreaktion nach Keratoplastik.

3.2.1.1 Adenoviraler Marker-Gentransfer in HCEC und ex vivo kultivierte Rattenhornhäute

Die Expressionsqualität und -kinetik der adenoviralen Vektoren wurde zunächst mit Hilfe des Reporterkonstrukts AdEGFP sowohl in HCEC als auch in ex vivo kultivierten Ratten-Korneae getestet. Unter Zugabe von Polybren zur Verbesserung der Gentransfereffizienz (Doebis et al., 2002) zeigte sich bereits bei 50 pfu, dass fast 100 % der HCEC ohne Auftreten zytotoxischer Effekte transduziert werden konnten (Abb. 13), womit sich diese Zellen als optimale „Zielzellen“ für den adenoviralen Gentransfer erwiesen.

▼ 49 

Abbildung 13: Gentransfereffizienz von HCEC, die mit verschiedenen Konzentrationen von AdEGFP und 8µg/ml Polybren transduziert wurden.

Um zu untersuchen, welche Zellen der gesamten Kornea nach adenoviralem Gentransfer in ex vivo verstärkt transduziert werden, wurde erneut das Reporterkonstrukt (AdEGFP) eingesetzt. 48 Stunden nach dem Gentransfer von 1x108 pfu/Kornea wurden die Hornhäute in OCT eingefroren, Gewebeschnitte angelegt und mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass durch adenoviralen Gentransfer vor allem das Endothel transduziert wurde, jedoch nicht das Hornhautepithel bzw. Keratozyten im Hornhautstroma (Abb. 14).

Abbildung 14: Darstellung einer Kornea nach adenoviralem Gentransfer von EGFP. Auf der linken Seite ist das transduzierte Hornhautendothel sehr gut zu erkennen. Keratozyten und Epithelzellen weisen keine EGFP-Expression auf. Die Kornea wurde mit 1x10 8 pfu AdEGFP transduziert und nach 48 h in OCT eingefroren. Es wurden Gefrierschnitte angefertigt, die unter dem Fluoreszenzmikroskop fotografiert werden konnten. Die Pfeile zeigen das grün fluoreszierende Endothel.

3.2.1.2  In vitro-Untersuchungen zur Genexpression nach adenoviralem Gentransfer

▼ 50 

Im Vorfeld dieser Arbeit konnte gezeigt werden (Ritter et al., 1999a), dass bereits 24 Stunden nach Applikation von AdrIL-4 an ex vivo kultivierten Hornhäuten signifikante Konzentrationen von IL-4 im Überstand detektierbar sind. Zusätzlich wurde der Nachweis erbracht, dass unter den gewählten Bedingungen die Expression des therapeutischen Gens über mehr als 6 Tage erhalten bleibt (Ritter et al., 1999a).

Ähnliche Ergebnisse konnten auch bzgl. der Expression von vIL-10 nach adenoviralem Gentransfer in ex vivo kultivierten Korneae erzielt werden. Dazu wurden 6 Ratten-Hornhäute mit jeweils 1x108pfu AdvIL-10 / 500µl / Kornea transduziert. Nach drei Stunden wurden die adenoviralen Bestandteile durch vorsichtiges, aber gründliches Spülen der Hornhäute entfernt und diese mit 2% FKS-haltigem Medium versetzt. Die Zytokinexpression wurde mittels ELISA an verschiedenen Zeitpunkten überprüft (Abb. 15).

Abbildung 15: Expression von vIL-10 nach ex vivo-Transduktion von 6 Korneae. Die Hornhäute wurden mit jeweils 1x10 8 pfu AdvIL-10 transduziert und zu den verschiedenen Zeitpunkten der Zytokingehalt des Kulturüberstandes bestimmt; n=6.

3.2.1.3 Kombinierter adenoviraler Gentransfer (AdvIL-10/AdrIL-4)

▼ 51 

Zur Überprüfung der Ko-Expression von vIL-10 und rIL-4 nach kombiniertem adenoviralem Gentransfer wurden drei Rattenhornhäute mit den adenoviralen Konstrukten für beide Zytokine mit jeweils 1x108 pfu/ml/Kornea gleichzeitig transduziert. Eine Kornea diente als Kontrolle und wurde nicht transduziert. Nach dreistündiger Inkubation wurden alle Virusbestandteile durch vorsichtiges, aber gründliches Spülen entfernt und die Hornhäute mit 2% FKS-haltigem Medium versetzt. Nach 48 Stunden wurde das Medium gewechselt und der entnommene Überstand zur Analyse des Zytokingehalts eingefroren (Tab. 6).

Tabelle 6: Analyse des Zytokingehalts in Überständen von mit rIL-4 und vIL-10 transduzierten Korneae.

rIL-4 ng/ml

vIL-10 ng/ml

Kornea 1

> 100

> 200

Kornea 2

> 100

> 200

Kornea 3

> 55

> 175

Kornea 4 (Kontrolle)

n.d.

n.d.

3.2.1.4 Adenoviraler Gentransfer zur Modulation der Abstoßungsreaktion transplantierter Ratten-Hornhäute

Nachdem die oben beschriebenen ex vivo-Untersuchungen gezeigt hatten, dass der adenovirale Gentransfer immunregulatorisch wirkender Proteine an organkultivierten Korneae sehr effizient ist, sollte weiterhin untersucht werden, ob sich damit die Abstoßungsreaktion nach allogener Keratoplastik beeinflussen lässt. Erfahrungen aus tierexperimentellen Untersuchungen der letzten Jahre zeigen, dass die Induktion der allogenen Transplantatabstoßung vor allem in der Milz, aber auch regional, d.h. im Transplantat, angrenzender Empfängerhornhaut und regionalem lymphoiden Gewebe erfolgt. Durch die Möglichkeit, Hornhauttransplantate längere Zeit zu konservieren, liegen ideale Voraussetzungen des ex vivo-Gentransfers zur Immunmodulation vor.

▼ 52 

Im Vorfeld dieser Arbeit wurde dies mit Transplantaten versucht, die ex vivo mit dem adenoviralen Konstrukt für IL-4 transduziert worden waren. Hierbei zeigte sich, dass der IL-4 Gentransfer zu keiner signifikant nachweisbaren Immunmodulation der Transplantatrejektion führte (Pleyer et al., 2000). Da in einem allogenen Ratten-Modell der Nierentransplantation nach Ko-Transduktion von IL-4 mit vIL-10 (in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Kupiec-Weglinski, Los Angeles, USA) ein signifikanter Effekt auf das Transplantatüberleben erzielt werden konnte, nachdem sich auch dort der alleinige IL-4-Gentransfer als nicht erfolgreich herausgestellt hatte, sollten diese Ergebnisse auch im Modell der Keratoplastik überprüft werden (Kato et al., 1999).

Um die Frage zu klären, ob der ex vivo-Gentransfer zu einer lokalen und/oder systemischen Beeinflussung der Immunreaktion nach Transplantation führt, sollten an verschiedenen Zeitpunkten (Tag 10 und Tag der Abstoßung) lymphatische Organe (drainierende und nicht-drainierende Lymphknoten, Milz) entnommen und gemischte Lymphozytenkulturen angesetzt werden. Zusätzlich wurde das Transplantat explantiert und mit Hilfe der Immun-Histochemie auf infiltrierende Effektorzellen untersucht.

3.2.1.5 Adenoviraler Gentransfer von vIL-10 in der Keratoplastik

3.2.1.5.1 Einfluss der vIL-10-Produktion durch transduzierte Hornhäute auf die Transplantatüberlebenszeit

Für die Transplantationen wurden die Spender-Hornhäute mit jeweils 1x108 pfu der adenoviralen Vektoren (Ad0 als Kontrollvektor ohne therapeutisches Gen, AdvIL-10) ex vivo transduziert. Als zweite Kontrollgruppe dienten nicht-transduzierte Hornhäute. Die transplantierten Tiere wurden 2, 4 und 7 Tage nach OP und anschließend über 4 Wochen täglich kontrolliert. Die Hornhauttrübung wurde in einer Skala von 0-4 beurteilt, wobei eine Bewertung ab 3 als abgestoßen galt (Abb. 16).

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Abbildung 16: Darstellung von Hornhauttransplantaten im Tier. Links: ein klares Transplantat, Bewertung 0; rechts ein abgestoßenes, trübes Transplantat, Bewertung 4.

Das verwendete Transplantationsmodell WF auf Lew ist ein starkes Abstoßungsmodell und weist einen kompletten „Mismatch“ innerhalb der MHC-I- und MHC-II-Gene auf. Die durchschnittliche Überlebenszeit (Median) der Transplantate ohne Behandlung (n=6) lag bei 17 Tagen, die der mit Ad0 transduzierten Korneae (n=6) bei 20,5 Tagen. Der ex vivo vIL-10-Gentransfer in die Spenderkorneae führte zu keiner signifikant verlängerten Transplantatüberlebenszeit. Hier lag die mittlere Transplantatüberlebenszeit (Median) bei 15 Tagen (n=7) (Abb. 17).


Abbildung 17: Kaplan-Meier-Kurve zur Darstellung der Transplantatüberlebenszeiten nach Transduktion mit AdvIL-10, Kontrollvektor (Ad0) und unbehandelten Hornhäuten. Der Einsatz des therapeutischen Gens führte zu keiner Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit, jedoch wird ein verlängernder Effekt durch die Behandlung mit dem Kontrollvektor (Ad0) sichtbar; Sine=unbehandelt, post-Tx=nach Transplantation; p>0,05.

3.2.1.6 Kombinierter adenoviraler Gentransfer von vIL-10 und rIL-4 in der Keratoplastik

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Die Spender-Hornhäute (WF) wurden ex vivo mit jeweils 1x108 pfu/ml adenoviralen Vektoren transduziert, die für die Zytokine vIL-10 (AdvIL-10) und rIL-4 (AdrIL-4), sowie als Kontrollvektor für β-Galaktosidase (Adβ-gal) kodieren und in die Empfängertiere (Lew) transplantiert. Die Verwendung des Adβ-gal-Kontrollvektors in diesem Versuchsansatz beruhte auf der Feststellung, dass der Einsatz des Kontrollvektors Ad0 zu einer längeren Transplantat-Überlebenszeit führte als der des therapeutischen adenoviralen Vektors AdvIL-10. Der Versuch wurde 32 Tage post OP beendet, da davon ausgegangen wurde, dass zu diesem Zeitpunkt ein Langzeitüberleben vorliegt. Auch die Tiere, die ihr Transplantat noch nicht abgestoßen hatten, wurden am Tag 32 getötet. Dabei besaß jeweils ein Tier in den Kontrollgruppen (ohne Behandlung, Adβ-gal) ein klares Transplantat, in der AdvIL-10/AdrIL-4-Gruppe zeigten zwei Tiere keinerlei Hornhauttrübungen. Aus der unterschiedlichen Versuchsdauer im AdvIL-10- und im AdvIL-10/AdrIL-4-Versuch ergaben sich unterschiedliche Überlebensmediane für die unbehandelte Kontrollgruppe. Diese Unterschiede sind jedoch nicht auf Operationsfehler zurückzuführen und trotz zahlenmäßiger Differenz nicht signifikant. Die mittlere Überlebenszeit (Median) der Transplantate betrug in der allogenen nicht-transduzierten Kontrollgruppe (n=6) 13,5 Tage. Die mit dem Kontrollvektor Adβ-gal transduzierten Korneae (n=6) wurden nach durchschnittlich (Median) 12 Tagen abgestoßen. Die ko-transduzierten Hornhäute (n=7) überlebten mit 15 Tagen zwar länger als die Kontrollen, dies reichte aber nicht zu einem statistisch signifikanten Effekt aus (Abb. 18).

Abbildung 18: Kaplan-Meier-Kurve zur Darstellung der Transplantatüberlebenszeiten nach Ko-Transduktion mit AdvIL-10 und AdrIL-4. Der Einsatz des therapeutischen Gens führte zu keiner Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit; Sine=unbehandelt, post-Tx=nach Transplantation; p>0,05.

3.2.1.7 Einfluss des adenoviral exprimierten Zytokins vIL-10 durch ex vivo transduzierte Hornhäute auf die Immunreaktion nach Keratoplastik

Um zu untersuchen, ob der Gentransfer die Immunreaktion lokal und/oder systemisch beeinflussen kann, wurden am Tag 10 nach Transplantation, sowie am Tag der Abstoßung in zwei verschiedenen Versuchsgruppen die drainierenden Lymphknoten (lokale Effekte) sowohl auf der transplantierten Seite als auch auf der nicht-transplantierten Seite, sowie die Milz (systemische Effekte) entnommen. Die isolierten Lymphozyten wurden mit dem Membranfarbstoff CFDA-SE gefärbt, um ihre Proliferationsaktivität nach Stimulation mit dem Donor-Antigen im FACS sichtbar machen zu können. Bei der Zellteilung wird dieser Farbstoff zu gleichen Teilen an die Tochterzellen weitergegeben, sodass die Abnahme der Fluoreszenzintensität ein Maß für die Proliferationsstärke der Lymphozyten darstellt. Nach 4 Tagen erfolgte die Auswertung am Durchflusszytometer anhand der mit CFDA-SE markierten Lymphozyten.

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Als Kontrolle dienten die Lymphozyten eines nicht-transplantierten Tieres (Lew), die sowohl syngen (Lew) als auch allogen (WF) stimuliert wurden (Abb. 19). Syngen stimulierte Lymphozyten zeigten kaum Proliferation, während, wie zu erwarten war, allogen stimulierte Lymphozyten eine erhöhte Zellteilungsaktivität aufwiesen.

Abbildung 19: Darstellung der Proliferation von T-Zellen einer nicht-transplantierten Lewis-Ratte. Aus (drainierenden) zervikalen Lymphknoten (DLK), Lymphknoten aus der Leistengegend (LK) und Milz (Mz) wurden Lymphozyten isoliert und nach Färbung mit CFDA-SE syngen mit bestrahlten Lewis-Milzzellen und allogen mit bestrahlten WF-Milzzellen stimuliert. Nach 4 Tagen Inkubation erfolgte die Messung am Durchflusszytometer (n=4 Tiere). syn=syngen; allo=allogen; stim.=stimuliert.

Als zusätzliche Kontrollen dienten syngen transplantierte Tiere (Lew auf Lew) aller Behandlungsgruppen (ohne Behandlung, Ad0, AdvIL-10), von denen am Tag der Abstoßung des am gleichen Tag allogen transplantierten Partnertieres, die Lymphozyten isoliert und in der gemischten Lymphozytenkultur (MLR) allogen stimuliert wurden (Abb. 20a). In der unbehandelten Gruppe ist die Reaktion der Zellen aus den drainierenden Lymphknoten weniger stark als die Reaktion der adenoviral behandelten Tiere. In den vom Transplantat weiter entfernten Organen (Lymphknoten der Leistengegend und Milz) verhalten sich die Lymphozyten aller drei Gruppen ähnlich. Die Proliferation der gleichen Zellen nach syngener Stimulation in einem zweiten Versuchsansatz lag deutlich unter der dargestellten allogen stimulierten Proliferation (nicht gezeigt).

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Abbildung 20: Vergleich der Immunreaktionen von syngen und allogen transplantierten Tieren am Tag der Abstoßung, nach allogener Stimulation der isolierten Lymphozyten.Aus den drainierenden Lymphknoten der transplantierten rechten (DLKr, n=7-8) und der nicht-transplantierten linken Seite (DLKl, n=7-8), den Lymphknoten der Leistengegend (LK, n=2-6) und der Milz (Mz, n=7-8) wurden am Tag der Abstoßung die Lymphozyten isoliert und allogen mit bestrahlten WF-Milzzellen stimuliert. Nach 4 Tagen in Kultur wurde die Intensität von CFDA-SE in den Immunzellen gemessen und daraus ihre Proliferationsaktivität berechnet.

Die eigentlichen Behandlungsgruppen wurden allogen nach ex vivo-Gentransfer mit Ad0 oder AdvIL-10 bzw. untransduziert transplantiert (Abb. 20b). Hier ist im Vergleich zu den syngen transplantierten Tieren eine Steigerung der Proliferationsaktivität der Lymphozyten aller Behandlungsgruppen in den drainierenden Lymphknoten auf der transplantierten Seite und der Milz ersichtlich. Die Lymphozyten der drainierenden Lymphknoten der nicht-transplantierten Seite verhalten sich wie im syngen transplantierten Tier, während die der nicht-drainierenden Lymphknoten in der Ad0-Gruppe eine gesteigerte Proliferation zeigen. Eine Hemmung der Lymphozyten-Proliferation durch das adenoviral exprimierte vIL-10 konnte somit nicht erreicht werden.

In einem zweiten Versuchsansatz wurden die Tiere 10 Tage nach Transplantation getötet, um zu einem früheren Zeitpunkt zu untersuchen, ob eine lokale oder systemische Beeinflussung der Lymphozyten-Proliferation nachweisbar ist. Zu diesem Zeitpunkt zeigte kein Transplantat Hinweise auf eine Abstoßungsreaktion. Nach Lymphozyten-Isolation wurde erneut eine MLR angesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass auch 10 Tage nach Transplantation kein immunsuppressiver Effekt von vIL-10 im Vergleich zu den Kontrollgruppen erreicht werden konnte (Abb. 21).

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Abbildung 21: Proliferationsanalyse der T-Lymphozyten der drei Behandlungsgruppen 10 Tage nach Transplantation. Aus den drainierenden Lymphknoten der transplantierten rechten (DLKr, n=4-5) und der nicht-transplantierten linken Seite (DLKl, n=4-5), den Lymphknoten der Leistengegend (LK, n=4-5) und der Milz (Mz, n=3-5) wurden 10 Tage nach Transplantation die Lymphozyten isoliert und allogen mit bestrahlten WF-Milzzellen stimuliert. Nach 4 Tagen in Kultur wurde die Intensität von CFDA-SE in den Immunzellen gemessen und daraus ihre Proliferationsaktivität berechnet.

DLKr

Drainierende Lymphknoten rechts (transplantierte Seite)

DLKl

Drainierende Lymphknoten links (untransplantierte Seite)

LK

Lymphknoten aus der Leistengegend

Mz

Milz

3.2.1.8 Immunhistologische Untersuchungen

Zur Beurteilung zellulärer Infiltrate im Transplantat wurden zu jedem Versuchsansatz immunhistologische Untersuchungen durchgeführt. Hierzu wurden Transplantate zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Tag 10, 17, 24) nach dem Eingriff kryofixiert und mit spezifischen monoklonalen Antikörpern inkubiert. Die detaillierten Ergebnisse dazu sind in der Dissertation zum Dr. med. von Frau Nadine Schmidt nachzulesen. Hier wird nur eine kurze Gegenüberstellung von Korneaschnitten der verschiedenen Behandlungsgruppen zu unterschiedlichen Zeitpunkten am Beispiel von infiltrierenden CD4+ (Abb. 22) und CD8+ T-Zellen (Abb. 23) abgebildet. Die Anzahl dieser Zellen war am Tag 10 nach Transplantation in der AdvIL-10 Gruppe verringert; dieser Effekt war jedoch für CD8+ T-Zellen am Tag 17 und für CD4+ T-Zellen am Tag 24 nicht mehr nachweisbar.

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Abbildung 22: Darstellung von CD4+-Zellen in Transplantaten der verschiedenen Behandlungsgruppen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Anzahl der infiltrierenden CD4+-Zellen ist in der Therapiegruppe (AdvIL-10) am Tag 10 nach Transplantation verringert, der Unterschied zwischen den Gruppen ist jedoch am Tag 24 nach Transplantation nicht mehr sichtbar. (Die CD4-positiven Zellen erscheinen braungefärbt.)

Abbildung 23: Darstellung von CD8+-Zellen in Transplantaten der verschiedenen Behandlungsgruppen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Anzahl der infiltrierenden CD8+-Zellen ist in der Therapiegruppe (AdvIL-10) am Tag 10 nach Transplantation verringert, der Unterschied zwischen den Gruppen ist jedoch bereits am Tag 17 nach Transplantation nicht mehr sichtbar. (Die CD8-positiven Zellen erscheinen braungefärbt.)

3.2.2 Liposomaler Gentransfer von vIL-10 in der Keratoplastik

Die adenoviral übertragenen Zytokingene führten zu keiner nennenswerten Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit. Auch in der MLR und der Histologie konnten keine Hinweise auf eine Beeinflussung der Immunantwort durch den lokalen Gentransfer gefunden werden. Aus diesem Grund sollte in einem abschließenden Versuch geklärt werden, ob der lokale ex vivo vIL-10-Gentransfer mit Hilfe von Liposomen die Transplantatüberlebenszeit von transplantierten Korneae verlängern kann. Da die Liposomenformulation Lipofectamine 2000 in der Zellkultur weit höhere Effizienzen erreichte (ca. 50%, Prof. A.J. George, London, persönliche Mitteilung), als die in dieser Arbeit untersuchten Lipide, und sich dieser Effekt durch den Einsatz von Transferrin noch verstärken ließ, wurde Lipofectamine 2000 als Liposom für den ex vivo-Zytokingentransfer vor Keratoplastik eingesetzt.

3.2.2.1  In vitro-Untersuchungen zur Genexpression nach liposomalem Gentransfer

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Zur Überprüfung der vIL-10-Expression in den transfizierten Hornhäuten wurden an den Tagen 1, 2, 4, 6 und 8 nach ex vivo-Transfektion, die Überstände entnommen und durch frisches Medium ersetzt. Der Zytokingehalt der Überstände wurde per ELISA ermittelt und ist in Abbildung 24 dargestellt. Dabei ist zu beachten, dass für Tag 1 und 2 die 24h-Expression abgebildet ist, für die übrigen Tage jeweils die Expression von 48h. Trotzdem wird deutlich, dass zum Tag 8 hin der vIL-10-Gehalt bei Einsatz von 2,5 bzw. 5µg Lipofectamine 2000 ansteigt und dabei 5µg die höchste Expression unter sonst konstanten Bedingungen (1µg pcDSRα-BCRF1 + 10µg Transferrin) erreichen.

Abbildung 24: vIL-10-Konzentrationen im Überstand liposomal transfizierter Hornhäute. Die Korneae wurden frisch entnommen und sofort mit unterschiedlichen Konzentrationen von Lipofectamine 2000, 10µg Transferrin und 1µg pcDSRα-BCRF1 transfiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde der Überstand komplett entnommen und durch frisches Medium ersetzt. Der vIL-10-Gehalt der Überstände wurde mittels ELISA bestimmt und als Mittelwert±Standardabweichung dargestellt, n=3.

3.2.2.2 Einfluss der vIL-10-Produktion durch liposomal transfizierte Hornhäute auf die Transplantatüberlebenszeit

Die höchste vIL-10-Produktion liposomal transfizierter Korneae wurde unter in vitro-Bedingungen durch den Einsatz von 5µg Lipofectamine 2000 erzielt. Aus diesem Grund fanden diese Versuchsbedingungen auch für die Transfektion der Hornhäute vor Transplantation Anwendung.

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Die Ergebnisse weisen zwar auf eine tendenzielle Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit hin, jedoch konnte auch unter Verwendung von Liposomen für den lokalen Gentransfer in der Keratoplastik keine Signifikanz der Ergebnisse erreicht werden (Abb. 25).

Abbildung 25: Kaplan-Meier-Kurve zur Darstellung der Transplantatüberlebenszeiten nach liposomaler vIL-10-Transfektion, Kontroll-Transfektion mit Liposom und Transferrin ohne Plasmid (K-Liposom) und unbehandelten Hornhäuten. Der Einsatz des therapeutischen Gens führte auch hier zu keiner signifikanten Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit; Sine=unbehandelt, K-Liposom=Liposom-Kontrolle, post-Tx=nach Transplantation; p>0,05.


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29.11.2004