4 Diskussion

▼ 60 (fortgesetzt)

Die Hornhauttransplantation ist heute mit Abstand die häufigste Allotransplantation humanen Gewebes. Durch ausgereifte mikrochirurgische Techniken, ein besseres Verständnis der Hornhautphysiologie und die Anwendung anti-inflammatorischer Medikamente wird der Keratoplastik eine Sonderrolle mit guten postoperativen Ergebnissen eingeräumt. Zu den Problemen die im Zuge der Hornhauttransplantation auftreten können, gehören der nach wie vor akute Spendermangel und eine Transplantatschädigung, die sowohl vor, als auch nach Transplantation auftreten kann. Dabei wird der Mangel an Spender-Hornhäuten vor allem durch einen möglichen Zellverlust am Hornhautendothel während der Langzeitlagerung vor Keratoplastik verstärkt, der die Transplantatqualität stark vermindert und einen Einsatz der entsprechenden Hornhäute für die Transplantation unmöglich macht. Ein anderer wichtiger Aspekt der Transplantatschädigung betrifft immunvermittelte Allograftreaktionen nach Transplantation, die bei bis zur Hälfte der Transplantierten auftreten können und zu einem Verlust des Transplantats führen.

▼ 61 

Lösungsansätze zu beiden Kernproblemen der Keratoplastik, mit Bezug auf das Hornhautendothel, wurden in der vorliegenden Arbeit unter Zuhilfenahme von gentherapeutischen Maßnahmen untersucht. Im ersten Schritt gelang es, die Gentransferbedingungen für verschiedene nicht-virale Transfektionsreagenzien für den Einsatz in HCEC zu optimieren (Abb. 9, Tab. 5). Als nächstes wurde der optimierte nicht-virale Gentransfer des Wachstumsfaktors aFGF dazu eingesetzt, die Proliferation von Hornhautendothelzellen in vitro zu stimulieren, wobei sich DAC-30 und Lipofectin als vielversprechendste Transfektionsreagenzien erwiesen, unabhängig von der erreichten Gentransfereffizienz (Abb. 10). In den transfizierten Zellen konnte aFGF in unterschiedlichen Mengen nachgewiesen werden, jedoch nicht in untransfizierten Zellen und in Zellen, die mit exogenem aFGF behandelt worden waren (Abb. 12). Perspektivisch eröffnet sich damit die Möglichkeit dem Endothelzellverlust vor Transplantation entgegenzuwirken.

Im zweiten Schritt wurde untersucht, ob mit Hilfe des adenoviralen bzw. liposomalen Gentransfers zweier Zytokine (vIL-10, rIL-4) in das Spendergewebe, dieses immunologisch als neue Möglichkeit der Prävention alloreaktiver Immunstimulation nach Keratoplastik modifiziert werden kann. Im Anschluss an die Untersuchung zur Gentransfereffizienz mittels Adenoviren, bei der sich eine sehr gute Transduzierbarkeit von sowohl HCEC in vitro (Abb. 13) als auch Hornhautendothel ex vivo (Abb.14) zeigte, konnte ex vivo auch eine hohe und langanhaltende Zytokinexpression detektiert werden (Abb. 15, Tab. 6). Eine signifikante Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit gelang jedoch weder durch den Einsatz des adenoviral exprimierten vIL-10 (Abb. 17) noch durch die Kombinationstherapie von vIL-10 mit rIL-4 (Abb. 18). In der gemischten Lymphozytenkultur (Abb. 20, 21) und der Immunhistologie (Abb. 22, 23) konnten nur schwache Hinweise auf eine geringfügige Beeinflussung der Immunreaktionen durch den adenoviralen Gentransfer der immunmodulatorischen Zytokine festgestellt werden. Auch die liposomal mit vIL-10 transfizierten Korneae zeigten in vitro eine detektierbare Expression dieses Zytokins (Abb. 24), wobei die Lipidkonzentration, bei der die größte Menge an vIL-10 im Überstand nachweisbar war, auch für die Transfektion vor Keratoplastik eingesetzt wurde. Eine Tendenz zur Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit war durch den liposomalen vIL-10-Gentransfer in ex vivo-kultivierte Korneae vor Keratoplastik sichtbar, jedoch ohne dabei statistische Signifikanz zu erreichen (Abb. 25).

4.1 Das Hornhautendothel als Zielstruktur für die Gentherapie

Das Auge stellt ein interessantes Organ für die Gentherapie dar, da es verschiedene Vorteile gegenüber anderen Organsystemen aufweist. Die exponierte Lage des Auges, sowie seine Transparenz ermöglichen einen guten Zugang zu diesem Organ und visuelle Untersuchungsmöglichkeiten unter verschiedenen Bedingungen. Dies gilt insbesondere für die Kornea, deren Endothelzellschicht den verschiedensten Gentransfertechniken zugänglich ist, die eine relativ einfache Morphologie aufweist und über längere Zeiträume ex vivo kultiviert werden kann. Das Hornhautendothel ist insofern eine bedeutende Zielstruktur für gentherapeutische Ansätze, als es eine für die Funktion der gesamten Kornea entscheidende Zellschicht darstellt, deren Regenerationsfähigkeit stark eingeschränkt ist. Die Problematik der Hornhauttransplantation verdeutlicht dies auf doppelte Weise (siehe oben). Aus diesen Gründen stellt der Gentransfer in das korneale Endothel, mit dem Ziel der Modulation seiner Physiologie, einen interessanten Ansatz dar, diese bedeutsame Zellschicht zu schützen und zu erhalten.
In den vergangenen Jahren wurden etliche Studien durchgeführt, in denen verschiedene virale und nicht-virale Gentransfermethoden am Hornhautendothel getestet wurden.

4.1.1 Nicht-viraler Gentransfer in das Hornhautendothel

▼ 62 

Zu dennicht-viralen Gentransfer-Methoden, die am Hornhautendothel erprobt worden sind, gehören die Elektroporation (Oshima et al., 2002, Blair-Parks et al., 2002), Liposomen und eine alternative Variante, genannt „Lipoadenofection“. Dabei kommt eine Kombination aus Liposomen und Adenoviren zur Anwendung, wodurch die Effizienz der Liposomen erhöht und die Immunogenität des Vektors, gegenüber einer viralen Applikation, verringert wird. Den Autoren gelang es, ein Gen effizient in die Hornhaut von Kaninchen zu übertragen (Arancibia-Cárcamo et al., 1998). Die Effizienz der Genübertragung war dabei etwa 14 mal höher, als bei der Anwendung von Liposomen allein. Der Nutzen der Lipoadenofection liegt darin, dass sie Vorteile des liposomalen und adenoviralen Gentransfers verbindet und so z.B. die Immunogenität der viralen Vektoren reduzieren kann. Dies reicht jedoch nicht aus, alle Entzündungsreaktionen zu verhindern, da Lipoadenofection eine Form des „Virus-verstärkten“ Gentransfers darstellt und so nicht wirklich nicht-viral ist.

Bei der Verwendung von Liposomen treten nur geringfügige unspezifische Immunreaktionen auf (Komplementaktivierung), desweiteren sind sie kommerziell erhältlich und problemlos zu handhaben (George et al, 2000, Pleyer und Dannowski, 2002). Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass Liposomen vielversprechende Vektoren für den Gentransfer an kornealen Endothelzellen sind (Tan et al., 2001, Pleyer et al., 2001b, Tan et al., 2003).

4.1.1.1 Einsatz verschiedener Lipide für den Gentransfer in HCEC

In der vorliegenden Arbeit wurden acht verschiedene nicht-virale Transfektionsreagenzien (TR) eingesetzt, um eine Zelllinie, die von humanen kornealen Endothelzellen (HCEC) abgeleitet wurde, zu transfizieren. Alle eingesetzten Transfektionsreagenzien bestehen aus Lipiden, wobei ein Teil liposomaler (Lipofectin, Lipofectamine, DMRIE-C, Cellfectin, DAC-30) und der andere Teil nicht-liposomaler (Fugene, Effectene, Superfect) Herkunft ist. Für den Lipid-vermittelten Gentransfer ist sowohl die Bedeutung der Lipid:DNA Ratio, als auch der Lipid-Konzentration beschrieben (Felgner et al., 1994, Lee et al., 1996). Aus diesem Grund wurden für jedes TR verschiedene Transfektionsbedingungen ausgetestet. Dies erfolgte mit Hilfe des Markergentransfers (EGFP), anschließender Propidiumiodid-Färbung und Messung des prozentualen Anteils grün und rot fluoreszierender Zellen an der Gesamtpopulation per Durchflusszytometer (Chen et al., 1999, Nunez et al., 2001). In deren Verlauf zeigte sich, dass Lipofectamine, Cellfectin und Superfect aufgrund ihrer Zytotoxizität unter den getesteten Bedingungen nicht für die Transfektion der HCEC geeignet sind. Daher erfolgte ein Ausschluss dieser drei TR von den weiteren Untersuchungen. Für die übrigen fünf Lipide konnten die optimalen Gentransferbedingen, hinsichtlich geringer Toxizität, verbunden mit guter Gentransfereffizienz, bestimmt werden. Dabei zeigte sich, dass in Abhängigkeit von der Lipid:DNA-Ratio, hohe Lipid-Konzentrationen mit großer Gentransfereffizienz, aber auch mit starker Toxizität verbunden waren. Mit abnehmenden Lipidkonzentrationen konnte eine Verminderung der Toxizitäten, aber gleichzeitig auch der Gentransfereffizienzen verzeichnet werden. Die einzige Ausnahme bildete Lipofectin, welches mit abnehmender Lipidkonzentration zwar eine verminderte Toxizität, jedoch eine gleichzeitig erhöhte Gentransfereffizienz zeigte. So erreichte Lipofectin mit 17 % die höchste Transfektionseffizienz unter den getesteten Lipiden. DMRIE-C, Fugene und Effectene erzielten ca. 10 % Effizienz. DAC-30 war mit 7 % das schwächste Lipid, jedoch effizienter als bei der Transfektion von bovinen kornealen Endothelzellen (Pleyer et al., 2001b).

4.1.1.2 Einsatz von Protaminsulfat zur Steigerung der Gentransfereffizienz

▼ 63 

Protaminsulfat ist ein polykationisches Peptid, dass sehr effektiv negativ geladene DNA-Moleküle verdichten und so in Verbindung mit monokationischen Liposomen die Übertragung in verschiedene Zelltypen verstärken kann. Gentransfer mittels Liposomen ist durch eine relativ problemlose Aufnahme der Transfektionskomplexe in die Zelle gekennzeichnet. Auch die Expression der DNA im Zellkern kann relativ effizient stattfinden. Der kritischste Schritt ist die effiziente Übertragung der DNA vom Zytoplasma in den Zellkern (Zabner et al., 1995, Xu und Szoka, 1996). Protaminsulfat ist ein natürlicher Bestandteil des Spermas und hat dort die Aufgabe, durch Bindung von DNA, eine kompakte Struktur zu bilden und auf diese Weise das Erbmaterial nach der Befruchtung zum Nukleus der Eizelle zu übertragen. Da genau dies eine Schwierigkeit des Liposomen-vermittelten Gentransfer darstellt, scheint der Einsatz von Protaminsulfat eine ausgezeichnete Lösungsmöglichkeit für dieses Problem zu sein. Als günstig erweist sich weiterhin die geringe Toxizität und Immunogenität dieser Verbindung. Li et al. (1998) konnten zeigen, dass Protaminsulfat signifikant die Größe der Lipoplexe verringert und dadurch zu einer Steigerung der Transfektionseffizienz beitragen kann. Um die beschriebene (Sorgi et al., 1997) Gentransfer-verstärkende Wirkung der polykationischen Substanz Protaminsulfat auf den Lipid-vermittelten Gentransfer zu testen, wurde dieses Peptid dem schwächsten TR (DAC-30) im Verhältnis 1:50 zugesetzt. DAC-30 + Protaminsulfat (DPS) erzielte eine Gentransfereffizienz von 10 % und wies damit eine um 3 % bessere Effizienz auf, als DAC-30 allein.

Die gleichzeitig zu diesen Gentransfereffizienzen ermittelten Lipid-verursachten Toxizitäten betrugen für jedes einzelne Lipid ca. 3 %. Diese geringe Toxizität mit den entsprechenden Effizienzen wurde als optimal ausgewählt, da der Zweck dieses Versuches darin bestand, dem Endothelzellverlust entgegenzuwirken und nicht durch zu hohe Konzentrationen und den damit verbundenen toxischen Effekten der Lipide, zusätzlich Zellen zu verlieren.

4.1.1.3 Gentransfer von aFGF und Wirkung auf die Proliferation von Hornhautendothelzellen

aFGF wird in der Zelle als Protein gebildet, dem die Signalsequenz für die klassische Ausschleusung aus der Zelle fehlt (Abraham et al., 1986, Jaye et al., 1986). Trotzdem kann es als Antwort auf Stress von der Zelle sekretiert werden (Jackson et al., 1992). In der Literatur wird ein alternativer exozytose-ähnlicher Weg zur Ausschleusung von FGF diskutiert (Mignatti et al., 1992), da auf der Zelloberfläche, auch von HCEC, FGF-Rezeptoren existieren, die gegen eine ausschließlich intrazelluläre Wirkung sprechen. Eine Wirkung von aFGF sowohl intrazellulär als auch an der Zell-Oberfläche wurde beschrieben (Imamura et al., 1990, Zhan et al., 1992, Wiedlocha et al., 1996). Dabei unterscheidet man zwischen sogenannten Hochaffinitätsrezeptoren (FGFR1 bis FGFR5) und Niedrigaffinitätsrezeptoren, den Heparansulfat-Proteoglykanen, die an der Ausbildung eines Ternärkomplexes beteiligt sind und die Aufnahme von extrazellulärem FGF fördern. Eine weitere Möglichkeit für das Vorhandensein von extrazellulärem FGF beruht auf der Annahme, dass intrazelluläres FGF durch die Zerstörung von Zellen freigesetzt wird und so die verbliebenen Zellen durch Stimulation eine bessere Überlebenschance bzw. Förderung der Wundheilung erhalten.

▼ 64 

Zur Übertragung des Gens für den Wachstumsfaktor aFGF in HCEC wurden die für jedes TR ermittelten optimalen Gentransferbedingungen eingesetzt. Mit Hilfe der Liposomen DAC-30 und Lipofectin konnte die Proliferation der HCEC gesteigert werden. Protaminsulfat konnte zwar in Verbindung mit DAC-30 dessen Gentransfereffizienz verbessern, die Proliferation der HCEC wurde jedoch nicht in gleichem Maße erhöht. Auch Lipofectin, das die höchste Gentransfereffizienz unter den getesteten Lipiden erreichte, blieb bei der Proliferationssteigerung der Zellen hinter DAC-30 zurück, welches die geringste Gentransfereffizienz erzielt hatte. Mit DMRIE-C, Effectene und Fugene konnte nahezu keine proliferationsfördernde Wirkung durch aFGF-Gentransfer beobachtet werden.

Unsere Expressionsuntersuchungen nach Gentransfer von aFGF zeigten, dass das Protein zwar in allen transfizierten Zellen nachweisbar war, jedoch in unterschiedlicher Quantität. In mit Lipofectin transfizierten Zellen lag aFGF in den größten Mengen vor, gefolgt von DAC-30 + PS und DAC-30. Eine geringe Expression des Wachstumsfaktors konnte in den Zellen, die mit DMRIE-C, Effectene und Fugene transfiziert worden waren, detektiert werden. Diese Ergebnisse lassen auf eine dosisabhängige Wirkung von aFGF schließen. Lipofectin und DAC-30 + PS, die bessere Gentransfereffizienzen als DAC-30 erreichten, bilden das Protein auch in entsprechender Menge, stimulieren jedoch die Proliferation der Zellen nicht in dem Maße wie DAC-30. Es scheint also für die Wirkung von aFGF eine Höchstdosis zu geben, die stimulierend auf die Zellproliferation wirkt. Mengen, die darüber hinausgehen, können auf diese Weise wieder abnehmende Effekte bewirken. Dies wird durch Studien mit bFGF, dem nahe verwandten basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, bestätigt. Rieck et al., (1995) konnten nachweisen, dass primär kultivierte HCEC auf die Gabe von exogenem bFGF bis zu einer bestimmten Dosis, ihre Proliferation steigerten und bei weiter erhöhten Mengen des Wachstumsfaktors eine Hemmung dieses Prozesses eintrat. Diese Beobachtungen könnten durch eine Herunter-Regulation von FGF-Hoch- und -Niedrig-Affinitäts-Rezeptoren erklärt werden (Ornitz et al., 1992, Mascarelli et al., 1993). Durch den Einsatz von anti-FGF Rezeptor-1 Antikörpern könnte diese Interpretation in weiterführenden Studien untermauert werden. Auch Nabel et al. (1993) zeigten, dass relativ geringe Effizienzen für eine erfolgreiche Sekretion von aFGF und damit verbundene messbare Effekte ausreichend sind.

4.1.1.4 Beeinflussung des nicht-viralen Gentransfers durch Ladungsunterschiede und Helfer-Lipid

In unseren Experimenten wurden klassische monovalente Liposomen (DAC-30, Lipofectin, DMRIE-C) und neu entwickelte Lipidformulationen (Fugene, Effectene) eingesetzt. Einige Studien demonstrieren erhöhte Transfektionsaktivitäten bei einem Einsatz multivalenter gegenüber monovalenten Liposomen (Behr, et al., 1989, Hawley-Nelson et al., 1993, Pleyer et. al., 2001b). In unseren Untersuchungen erwies sich das multivalente Liposom Lipofectamine, verglichen mit den monovalenten Liposomen, als hochtoxisch. Abul-Hassan et al. (2000) teilten ähnliche Beobachtungen an retinalen Pigment-Epithelzellen mit. So wurden auch in dieser Studie mit Lipofectin deutlich bessere Transfektionseffizienzen als mit Lipofectamine erzielt. Desweiteren konnte auch die geringere Transfektionseffizienz von DMRIE-C bestätigt werden. In unseren Untersuchungen zeigte DMRIE-C zwar eine gute Transfektionseffizienz, blieb aber bei der aFGF-Expression (Western Blot) hinter den beiden anderen monovalenten Liposomen (Lipofectin, DAC-30) zurück und zeigte keinerlei proliferationsteigernden Effekt nach aFGF-Gentransfer. Eine Erklärung dafür sind die unterschiedlichen Helferlipide, die in den verschiedenen Liposomenherstellungen enthalten sind (siehe Tabelle 2). Neutrale Helferlipide wie DOPE oder Cholesterol werden oftmals bei der Herstellung von Lipidformulationen zur Verbesserung der Gentransfereffizienz eingesetzt. Für DOPE wird angenommen, dass es die Freisetzung der Lipoplexe aus den Endosomen fördert, da es die Eigenschaft besitzt, Membranfusionen zu verursachen. Dies geschieht durch eine strukturelle Umwandlung einer stabilen Doppelschicht-Phase in eine instabile fusogene Phase bei endosomalem pH-Wert (Felgner et al., 1994, Zhou und Huang 1994, Farhood et al., 1995). Dadurch kann die kationische Doppelschicht der Lipoplexe mit der anionischen Doppelschicht des Endosoms fusionieren, wobei die verbleibenden Lipoplexe ins Zytoplasma freigesetzt werden. Cholesterol dagegen neigt dazu, Lipid-Doppelschichten zu verstärken (Regelin et al., 2000).

▼ 65 

Lipofectin und DAC-30 enthalten mit 50 % bzw. 70 % das Helferlipid DOPE, während DMRIE-C zu 50 % aus Cholesterol besteht. So liegt die Vermutung nahe, dass Cholesterol als Helferlipid einen limitierenden Faktor für die effiziente Übertragung des aFGF-Gens in HCEC darstellt.

Bei Fugene handelt es sich um eine sogenannte Multi-Komponenten-Lösung auf Lipid-Basis. Die genaue Zusammensetzung ist nur dem Hersteller bekannt. Der aFGF-Gentransfer mit Hilfe von Fugene führte nur zu einer geringen Proliferationsteigerung an Tag 4, die zum Tag 7 hin nicht mehr nachweisbar war. Effectene ist ein nicht-liposomales Lipid und führte zu keiner nachweisbar erhöhten Proliferation nach aFGF-Gentransfer. Thanh et al. (2002) nutzten Fugene zur Übertragung des Reportergens GFP in korneale Endothelzellen des Kaninchens. Sie demonstrierten eine 30 %ige Gentransfereffizienz am dritten Tag nach Transfektion. In unserer Studie wurde die Gentransfereffizienz des Markergentransfers bereits 24 Stunden nach Transfektion ermittelt. In der Studie von Thanh et al. (2002) konnten ansteigende Fluoreszenzintensitäten von Tag 1 bis Tag 3 nachgewiesen werden, was die Unterschiede zwischen beiden Untersuchungen erklären könnte. An den Tagen 3-5 blieb die Fluoreszenzintensität konstant und schwächte sich anschließend ab, was durch den transienten Gentransfer bedingt war. In unserer Studie sahen wir einen ähnlichen Effekt nach Gentransfer von aFGF, der an Tag 4 seine größte Wirkung zeigte und zum Tag 7 hin sowohl in der Expression als auch in der Wirkung auf die Zellproliferation nachließ.

4.1.1.5 Die extrazelluläre Matrix und ihr Einfluss auf die Wirkung von aFGF

Obwohl die Transfektionseffizienzen und Toxizitäten der getesteten TR in einem ähnlichen Bereich lagen, war der Effekt des aFGF-Gentransfers auf die HCEC-Proliferation sehr unterschiedlich und reichte von nahezu keiner Wirkung bis zu einer Erhöhung, die ähnlich der Zugabe von 10ng exogenem aFGF war. Wie schon weiter oben erörtert, scheint die Zusammensetzung der Lipide einen Einfluss auf den Erfolg des aFGF-Gentransfers auszuüben. Es gibt Untersuchungen, die zu der Erkenntnis führten, dass die Transfektion kationischer Lipide von Zell-Oberflächen-Proteoglykanen abhängig ist (Belting und Petersson, 1999). Aufgrund ihrer polyanionischen Natur und Assoziation mit der Zellmembran, sind Proteoglykane potentielle Kandidaten für die Bindung und Aufnahme von positiv geladenen kationischen Liposomen und polybasischen Peptiden. Gleichzeitig sind Heparansulfat-Proteoglykane, als fundamentale Komponenten von Zelloberflächen und der extrazellulären Matrix, Regulatoren von Fibroblasten-Wachstumsfaktoren. So spielt Heparansulfat, durch direkte Assoziation mit FGF und FGF-Rezeptor in einem Ternärkomplex auf der Zelloberfläche, eine essentielle Rolle in der FGF-Signaltransduktion (Ornitz, 2000). Rieck et al. (1995) konnten zeigen, dass FGF-2 in der extrazellulären Matrix vorliegt und diese matrixgebundene Form von FGF-2 einen stimulierenden Einfluss auf das zelluläre Wachstum und Überleben von primär kultivierten HCEC ausübt.

▼ 66 

Die toxischen Effekte der Lipide wurden bereits 24 Stunden nach Gentransfer untersucht. Die Zytotoxizität von Lipid:DNA-Komplexen findet jedoch nicht nur durch einen akuten toxischen Effekt auf die Zellmembran Ausdruck, sondern auch durch die Aufnahme der Transfektionskomplexe in die Zelle und die nachfolgende Genexpression (Uchida et al., 2002). Dies wird durch unsere elektronenmikroskopischen Aufnahmen belegt, in denen Fugene noch 7 Tage nach aFGF-Gentransfer zu Zellschäden führte, obwohl Untersuchungen zu früheren Zeitpunkten eine sehr geringe Toxizität für Fugene ergeben hatten.

Belting und Petersson (1999) konnten eine protektive Rolle von Heparansulfat-Proteoglykanen gegen die durch kationische Liposomen vermittelte Zytotoxizität in Ovarienzellen chinesischer Hamster belegen. So war die Aufnahme der Transfektionskomplexe in Zellen, die keine Proteoglykane bilden nicht eingeschränkt, während die Expression des übertragenen Reportergens und die Zellproliferation bei höheren Lipid-Konzentrationen stark vermindert waren. Proteoglykan-haltige Zellen zeigten dabei eine uneingeschränkte Reportergen-Expression. Dies zeigt, dass Proteoglykan-defiziente Zellen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber toxischen Effekten durch kationische Liposomen aufweisen und dass Heparansulfat-Proteoglykane Zellen gegen diese toxischen Effekte schützen können. Durch Bindung von kationischen Liposomen könnten Heparansulfat-Proteoglykane also deren toxische Effekte mildern, stehen dann aber nicht mehr für die FGF-Signaltransduktion zur Verfügung. Dies könnte eine Erklärung dafür sein, dass beim Einsatz größerer Lipidkonzentrationen (DMRIE-C 2,5µg; Effectene 2,5µg; Fugene 6µl) im Vergleich zu geringeren Mengen (Lipofectin 1,25µg; DAC-30 1µg; DAC-30 + PS 1µg), aFGF keinen Einfluss auf die Proliferation nehmen kann, da die Niedrig-Affinitäts-Rezeptoren für die FGF-Signaltransduktion nicht zur Verfügung stehen.

4.2 
Gentransfer in der Keratoplastik

4.2.1 Viraler Gentransfer in das Hornhautendothel

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde geprüft, ob eine lokale Überexpression der immunmodulatorischen Zytokine vIL-10 und rIL-4 in kornealen Transplantaten zu einer Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führen kann. Für den Gentransfer wurden in diesem Fall zunächst adenovirale Vektoren eingesetzt. Etliche Arbeiten belegen die Fähigkeit adenoviraler Vektoren, das korneale Endothel verschiedenster Spezies effektiv zu transduzieren (Budenz et al., 1995, Larkin et al., 1996, Borras et al., 1996, Oral et al., 1997, Ritter et al., 1999a). Der Vorteil adenoviraler Vektoren gegenüber Liposomen liegt in ihrer wesentlich höheren Gentransfereffizienz und der damit verbundenen hohen Genexpression.

▼ 67 

Aufgrund von Untersuchungen im Tiermodell konnte die bedeutende Rolle von T-Lymphozyten bei der Abstoßung kornealer Transplantate belegt werden (Pleyer et al., 1995). Insbesondere CD4+ T-Zellen, die sich aufgrund ihrer Zytokinsekretion in zwei unterschiedliche T-Helfer Subpopulationen (Th1- und Th2-Zellen) unterteilen lassen, nehmen Einfluss auf den Verlauf von Abstoßungsreaktionen. Die Analyse von Th1- und Th2-Zytokinprofilen transplantierter Organe erlaubt Rückschlüsse auf die Immunbiologie des transplantierten Organs. Während die Expression von Th1-Zytokinen (IL-2, IFN-γ) im Zusammenhang mit Abstoßungsreaktionen gesehen wird (Dallman, 1993), scheinen Th2-Antworten keinen schädigenden Einfluss auf das Transplantat auszuüben. Vorangegangene Untersuchungen der Zytokinexpressionsmuster nach Keratoplastik zeigen, dass dies auch für die Kornea gilt (Torres et al., 1996, Sano et al., 1998, Yamagami et al., 1998). Bei der kornealen Abstoßung konnten von Torres et al. (1996) IL-2- und IFN-γ-mRNA nachgewiesen werden, was die dominante Rolle der Th1-Zytokine für die Transplantatabstoßung belegt. Auch Yamada et al. (1999) konnten diese Zytokine im Kammerwasser sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene nachweisen. Dies verdeutlicht die Rolle dieser pro-inflammatorischen Zytokine bzw. der produzierenden Zellen als Effektoren der kornealen Abstoßung, denn sie wurden nur in abgestoßenen Transplantaten nachgewiesen. Eine Hemmung der Th1-Antworten könnte deshalb von besonderem Interesse für die Modulation der Immunreaktion gegen korneale Transplantate sein.

Zudem wirken Th1- und Th2-Zytokine als Wachstumsfaktoren für die eigene Zellpopulation und gleichzeitig als Inhibitoren auf den anderen Zelltyp (Gajewski und Fitch, 1988). Aus diesem Grund wurden immunmodulatorische Th2-Zytokine, zu denen auch IL-10 und IL-4 gehören, in verschiedenen Transplantationsmodellen eingesetzt, allerdings mit unterschiedlichem Erfolg.

Larkin et al. (1996) konnten zeigen, dass der adenovirale Gentransfer in Hornhäute auf das korneale Endothel beschränkt ist und das Reportergen ex vivo stabil über einen längeren Zeitraum exprimiert wird. Auch Ritter et al. (1999a) zeigten, dass die Expression von IL-4 nach AdrIL-4-Transduktion von Ratten-Hornhäuten früh einsetzt und über mindestens 6 Tage anhält. Demgegenüber stehen in vivo-Untersuchungen, die zeigen, dass bereits 4 Tage nach Gentransfer und Transplantation der Hornhäute keine Expression mehr nachweisbar zu sein scheint (Larkin et al., 1996).

▼ 68 

Der Hauptvorteil der Gentransfermethoden gegenüber exogener Applikation von Zytokinen liegt darin, dass die kurze Halbwertzeit und die damit verbundene stark begrenzte Bioverfügbarkeit (Ma et al., 1996) durch kontinuierliche Sekretion in das transplantierte Organ umgangen werden kann, wobei zusätzlich die, bei systemischer Applikation auftretenden, Nebenwirkungen verhindert werden können. Ohne Immunsuppression erfolgt die Abstoßung kornealer Transplantate im Rattenmodell (WF auf Lew) nach ca. 10 Tagen (Dr. J. Yang, persönliche Mitteilung). Die Expression des therapeutischen Gens (IL-12p40) konnte in seiner Studie über mindestens 14 Tage in ex vivo kultivierten Korneae nachgewiesen werden. Aus diesem Grund scheint die Verwendung adenoviraler Vektoren zur Übertragung und Expression von Zytokingenen in kornealen Transplantaten, eine gute Möglichkeit für die Modulation von Abstoßungsreaktionen zu sein, wenn es gelingt, auch in vivo eine entsprechend lange Zytokingenexpression zu erreichen.

4.2.1.1 Einsatz der immunmodulatorischen Zytokine vIL-10 und rIL-4 in Transplantationsmodellen

In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe des adenoviralen und liposomalen Gentransfers zwei verschiedene Zytokingene in ex vivo-kultivierte Korneae übertragen. Dabei handelte es sich um vIL-10 und um die Kombination von vIL-10 und rIL-4. Auch in Modellen von Herz- (Qin et al.,1997a, Guillot et al., 1999, Ke et al., 2000, David et al., 2000) und Nierentransplantationen (Kato et al., 2000, Yang et al., 2003) sowie bei der Keratoplastik (Pleyer et al., 2000, Klebe et al., 2001) kam ihre Expression über adenovirale Vektoren bereits zur Anwendung.

Der Einsatz von IL-4 ermöglichte ein verlängertes Überleben in Haut-, Nieren- und Herztransplantationsmodellen (Mottram et al., 1995, Takeuchi et al., 1997, He et al., 1998). Dabei führte sowohl die lokale Überexpression, als auch eine systemische Applikation von IL-4 zu einer Verlängerung des Transplantatüberlebens (Takeuchi et al., 1997, He et al., 1998). Auch ein synergistischer Effekt von IL-4 und IL-10 im Nierentransplantationsmodell der Ratte bei der Verlängerung der Transplantatakzeptanz war nachweisbar, interessanterweise nachdem in diesem starken Abstoßungsmodell (WF auf Lew) IL-4 allein keinen Effekt erzielt hatte (Kato et al., 1999). Im Keratoplastikmodell konnte nach Übertragung des IL-4-Gens mit adenoviralen Vektoren im gleichen Rattenmodell (WF auf Lew) ebenfalls keine Verlängerung des Transplantatüberlebens erzielt werden (Pleyer et al., 2000). Ritter et al. (1999b) zeigten, dass IL-4 weder ausreichend noch notwendig für die Toleranzinduktion in Herztransplantationsmodellen ist. Der Grund dafür ist unklar. Möglicherweise tritt in vivo eine Inaktivierung des Promotors auf. Es wird spekuliert, dass u.a. Zytokine an der schnellen Herunterregulation des therapeutischen Gens beteiligt sind (Stein et al., 1993, Qin et al., 1997b, Ritter et al., 2000, Sung et al., 2001). Qin et al. (1997b) konnten diesen Effekt für die Zytokine IFN-γ und TNF-α nachweisen, deren Expression durch spezifische und unspezifische Immunreaktionen gegen virale Promotoren/Enhancer ausgelöst wird. Möglicherweise könnte die Expression anti-inflammatorischer oder Th2-Zytokine diesen Effekt verhindern. Eine wirkungsvolle Alternative wäre auch die Verwendung nicht-viraler Promotoren. Außerdem spielt die Dosis des Zytokins (David et al., 1997) sowie der genetische Hintergrund und das Alter des Empfängers eine Rolle bei der Toleranzinduktion.

▼ 69 

Gentransfer von IL-10 in Allotransplantationsmodellen beeinträchtigt die effektive Antigen-Präsentation, reduziert die Immunogenität des Transplantats und hemmt Entzündungsreaktionen. Im Gegensatz zu zellulärem IL-10 zeigt das Epstein-Barr-Virus (EBV) kodierte IL-10-Homolog (vIL-10) nur diese immunsuppressiven Eigenschaften, jedoch keine stimulatorischen Effekte auf natürliche Killerzellen und zytotoxische T-Zellen (Qin et al., 1997a). Aus diesem Grund ist vIL-10 als wirkungsvolleres Immunsuppressivum anzusehen.
Gentransferuntersuchungen mit vIL-10 führten im Herztransplantationsmodell zu einem verlängerten Transplantatüberleben, auch in starken Abstoßungsmodellen (Zuo et al., 2001).

Bei der Keratoplastik gelang es Klebe et al. (2001) im Schafsmodell, ein verlängertes Überleben der mit IL-10 adenoviral transduzierten Hornhauttransplantate zu erzielen. Im Gegensatz dazu steht die Studie von Torres et al. (1999). Die Autoren konnten nach Injektion von rekombinantem murinem IL-10 (subconjunctival, intraperitoneal) im Rattenmodell keine Verlängerung des Transplantatüberlebens verzeichnen.

Die Wirkung von IL-10 und vIL-10 scheint dosis- und zeitabhängig zu sein (Blazar et al., 1998). So besteht die Möglichkeit, dass die Expression des therapeutischen Gens zu hoch oder zu gering ist und dadurch ein gegenteiliger Effekt erzielt wird.

4.2.2 Kritische Betrachtung der eigenen Ergebnisse

▼ 70 

In der vorliegenden Arbeit konnte keine signifikante Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit nach adenoviralem und liposomalem vIL-10-Gentransfer im Rattenmodell nachgewiesen werden. Ebensowenig bei der kombinierten Anwendung von adenoviral kodiertem vIL-10 und rIL-4.

Da im vIL-10-Versuch der Einsatz des Kontrollvektors Ad0 zu einer längeren Transplantatüberlebenszeit führte als der therapeutische Vektor, wurde für den kombinierten Gentransfer von vIL-10 und rIL-4 das Adβ-gal-Konstrukt als Kontrollvektor verwendet. Ad0 ist zwar als besserer Kontrollvektor anzusehen, da er als Leervektor nur adenovirale Bestandteile ohne zusätzlich inseriertes Gen enthält. Allerdings scheint dieser Vektor anti-apoptotische Eigenschaften zu besitzen. Dies könnte auf der nicht-deletierten E3-Region beruhen. Aus der E3-Region von Adenoviren werden mehrere mRNA-Transkripte generiert, die für Proteine kodieren, welche die Antigen-Präsentation auf infizierten Zellen und die Zytokin-induzierte Apoptose dieser Zellen verhindern (Wold und Gooding, 1991). Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Expression von E3-Genen in pankreatischen Insel-β-Zellen transgener Mäuse das Überleben von Inselzell-Transplantaten verlängerte (Efrat et al., 1995). Zudem konnte in einem diabetischen Mausmodell die Häufigkeit der Krankheit verringert und ihre Entwicklung verzögert werden (Efrat et al., 2001). Bei den eingesetzten adenoviralen Therapiegen-Vektoren handelte es sich um E1/E3-deletierte Vektoren. So wurde im zweiten Versuchsansatz Adβ-gal als Kontrollvektor verwendet, der ebenfalls keine E1/E3-Region mehr besitzt.

Die Resultate zur Transplantat-Überlebenszeit nach adenoviralem Gentransfer fanden durch die Ergebnisse der gemischten Lymphozytenkultur am Tag der Abstoßung und am Tag 10 nach Transplantation Bestätigung. Ziel dieses Versuchsansatzes war es, mehr über die Mechanismen zu erfahren, die bei Transplantatakzeptanz bzw. –abstoßung eine Rolle spielen. So wurde überprüft, ob durch den lokalen Gentransfer eine regionale und/oder systemische Immunmodulation erzielt werden kann. Wie aus den Ergebnissen ersichtlich (Abb. 20b + 21), wurde durch den adenoviralen Gentransfer des immunmodulatorischen Zytokins vIL-10 keine Modulation der Proliferation von lokalen (Lymphknoten) und systemischen (Milz) Lymphozyten erreicht. Die am Tag der Abstoßung erhöhte Proliferation der adenoviral behandelten, im Vergleich zu den unbehandelten Tieren könnte durch einen Kontakt der Spendertiere für die Stimulatorzellen mit Adenoviren ausgelöst worden sein (Abb. 20).

▼ 71 

Die Ergebnisse des adenoviralen Zytokin-Gentransfers, die in dieser Arbeit generiert wurden und die durch den lokalen liposomalen Gentransfer bestätigt werden konnten, sind ein weiterer Hinweis dafür, warum der lokale Gentransfer von vIL-10 nicht funktionieren kann. Sie lassen vermuten, dass das therapeutische Genprodukt von der transduzierten Kornea nicht in die regionalen Lymphknoten gelangen kann, was möglicherweise eine Voraussetzung für eine Immunmodulation wäre. So wird die allogene Immunantwort nicht ausschließlich im transplantierten Organ initiiert, sondern auch in den sekundären lymphatischen Organen. Es wäre somit denkbar, dass eine lokale Genexpression ausschließlich im Transplantat keinen Einfluss auf die immunologische Aktivierung der T-Zellen in den regionalen Lymphknoten nimmt, sodass es trotzdem zu einer Abstoßung des Organs kommen kann.

Die korneale Abstoßung wird von dem indirekten Weg der Allogenerkennung dominiert, da in der Kornea nur wenige dendritische Zellen vorhanden sind. Der indirekte Weg hängt von Antigen-präsentierenden Zellen in der Kornea und den drainierenden Lymphknoten ab. Boisgerault et al. (2001) konnten die kritische Rolle der drainierenden Lymphknoten bei der Aktivierung von alloreaktiven T-Zellen belegen, d.h., dass diese Aktivierung verhindert werden sollte, um ein Transplantatüberleben erreichen zu können. Die Übertragung immunregulatorischer Moleküle in korneale Transplantate ohne eine Manipulation der drainierenden Lymphknoten ist so wahrscheinlich nicht ausreichend für die Vermeidung des Abstoßungsprozesses. In der Studie von Yang et al. (zur Veröffentlichung eingereicht) wurde das immunregulatorische Zytokin IL-12p40 zur lokalen Überexpression in kornealen Transplantaten eingesetzt. Dabei konnte eine reduzierte Infiltration von T-Zellen in das Transplantat, sowie eine verminderte Th1-Zytokinfreisetzung beobachtet werden. Auch in der vorliegenden Studie konnte die frühe Infiltration von CD4+ und CD8+ T-Zellen durch die Expression von vIL-10 im Transplantat verringert werden (Abb. 22, 23). Dieser Effekt war jedoch nur von kurzer Dauer und konnte die Transplantatüberlebenszeit nicht entscheidend beeinflussen.
In beiden Studien war die Expression der immunmodulatorischen Zytokine nicht ausreichend, um das Transplantatüberleben zu verlängern. Die Modifikation der drainierenden Lymphknoten könnte ein wichtiger Schritt zu einem verbesserten Transplantationsergebnis sein. Diese Hypothese wird auch durch Untersuchungen von Rayner et al. (2001) unterstützt. TNF-α ist ein anderer wichtiger Mediator von Abstoßungsreaktionen. Durch adenovirale Überexpression eines löslichen TNF-Rezeptors im kornealen Transplantat konnte jedoch ebenfalls keine Verbesserung des Transplantatüberlebens erzielt werden.

Ein weiterer kritischer Punkt, durch den der Erfolg des lokalen Gentransfers möglicherweise beschränkt wird, ist das Erreichen der Zytokin-Dosis, die für eine Beeinflussung der T-Zellen erforderlich wäre. Somit bleibt zu überprüfen, ob die systemische Applikation von vIL-10 Erfolge bei der Verlängerung der Transplantatakzeptanz in der Keratoplastik bringen kann. Erste Untersuchungen dazu zeigten tatsächlich einen immunmodulatorischen Effekt bei intraperitonealer Applikation von vIL-10 in dem von uns verwendeten Rattenmodell (PD Dr. T. Ritter, persönliche Mitteilung). Die Applikation des Vektors erfolgte hier bereits einen Tag vor Keratoplastik. Somit liegt nahe, dass auch der Zeitpunkt der Applikation, wahrscheinlich im Hinblick auf eine wirkungsvolle Zytokindosis, einen entscheidenden Einfluss auf den Transplantationserfolg nehmen kann. Daraus würde sich ergeben, dass der lokale Gentransfer nicht funktionieren kann, wenn der Zeitpunkt der Applikation des Vektors mit der Transplantation zusammenfällt. Hier könnten neue Ansätze greifen, die auch eine lokale Applikation des Vektors bereits vor Transplantation ermöglichen, im Fall der Keratoplastik z.B. durch Injektion des Vektors in die Augenvorderkammer oder den Glaskörper des Auges (Abraham et al., 1995).

4.3 Fazit und Ausblick

▼ 72 

Die genauen Mechanismen, die dem Endothelzellverlust während der Hornhautkonservierung und nach Transplantation zugrunde liegen, sind noch nicht vollständig verstanden. Jedoch zeigte sich der Einsatz des aFGF-Gentransfers in vitro als vielversprechende Möglichkeit, die Endothelvitalität durch Proliferationsförderung der transfizierten Zellen zu erhöhen. Die Liposomen DAC-30 und Lipofectin haben sich bei der Übertragung von aFGF als gute Transportvehikel gezeigt, wenn auch die Gentransfer-Effizienz gering ist und aufwändige Voruntersuchungen nötig sind, um die optimalen Gentransferbedingungen für jedes Liposom festzulegen. In weiterführenden Studien sollte sich die Testung dieses Wachstumsfaktors an humanen Hornhäuten anschließen. Hier wäre es denkbar, dass sowohl die Endotheldichte vor Transplantation verbessert, als auch durch gentherapeutische Maßnahmen einem Endothelzellverlust nach Transplantation vorgebeugt werden kann. Damit könnte die Prognose für den Transplantationserfolg deutlich verbessert werden. Für beide Ansätze wäre eine vorübergehende Expression des Wachstumsfaktors ausreichend, wie sie durch Liposomen, aber auch durch adenovirale Vektoren erreicht wird.

Die lokale Überexpression von Zytokinen zur Modulation der Immunreaktion nach Keratoplastik zeigte in dieser Arbeit weder nach adenoviraler noch liposomaler Applikation Erfolg. Als mögliche Gründe dafür wurden der Ort und der Zeitpunkt der Applikation des therapeutischen Vektors, sowie die Zytokindosis diskutiert.

Neben der Überexpression von Zytokinen im Transplantat stellt auch der Einsatz von Molekülen, die Signal 2 der T-Zellaktivierung modulieren, einen interessanten Therapieansatz dar. CTLA4-Ig kann die allogene Transplantatabstoßung verhindern, allerdings gelang dies bei der Kornea nur nach systemischer Applikation. Hier sollte bemerkt werden, dass adenovirale Vektoren für die systemische Applikation nur unter Vorbehalt einsetzbar sind. Es ist bekannt, dass diese Vektoren toxische und immunaktivierende Effekte auslösen können (Kay et al., 2001).

▼ 73 

So kann es selbst nach lokaler Applikation zu einer nicht-spezifischen Immunantwort gegen die adenoviralen Bestandteile kommen (Yang et al, zur Veröffentlichung eingereicht). Dies könnte den Nutzen der durch die übertragenen immunregulatorischen Moleküle erzielt werden kann, stark beschränken. Eine Alternative dazu wäre der Einsatz von Adenoviren der 2. und 3. Generation, bei denen weitere virale Gene entfernt wurden und die aus diesem Grund zu einer deutlich verlängerten Genexpression und zu reduzierten Entzündungsreaktionen führen (Kay et al., 2001). Auch das Ausweichen auf weniger immunogene Vektorsysteme, wie Lentiviren, Adenoassoziierte Viren oder Liposomen wäre denkbar, allerdings besteht hier das Problem der geringeren Gentransfereffizienz.

Der Einsatz anti-apoptotischer und zytoprotektiver Gene, wie HO-1 oder bcl-2 und bag-1 wurde in neueren Studien untersucht und zeigte sich sehr wirkungsvoll bei der Verlängerung von Transplantatüberlebenszeiten (Ke et al., 2002, Sawitzki et a., 2002). Auch der Wachstumsfaktor aFGF verfügt über zellprotektive Eigenschaften und so wäre in weiterführenden Untersuchungen sein in vivo-Einsatz zur Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit durch Verhinderung von Endothelzellverlusten nach Transplantation denkbar.

Die genetische Manipulation von Effektorzellen der Immunantwort bzw. der drainierenden Lymphknoten stellt ebenfalls einen interessanten Ansatz zur Verhinderung der Transplantatabstoßung dar.

▼ 74 

Wahrscheinlich bietet eine Kombination aller besprochenen Strategien die vielversprechendste Aussicht auf Erfolg. Im Spezialfall der Keratoplastik betrifft dies vor allem den Schutz des empfindlichen Endothels, dessen Vitalität eine Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche Hornhauttransplantation darstellt.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
29.11.2004