Augenklinik und Institut für Medizinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

Gentransfer in korneale Endothelzellen: nicht-virale und virale Ansätze zur Modulation der Endothelzellfunktion und allogenen Immunreaktion

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der
Humboldt-Universität zu Berlin

vorgelegt von:
Dipl. Biologin Haike Dannowski

geboren am 29.03.1973 in Rüdersdorf bei Berlin

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Uwe Pleyer
2. Prof. Dr. Richard Lucius
3. PD Dr. Thomas Ritter

Datum der Einreichung: 16.02.2004

Datum der Promotion: 07.07.2004

Zusammenfassung

Bei der Hornhauttransplantation (Keratoplastik) handelt es sich um die häufigste Transplantation humanen Gewebes. Das Hornhautendothel, eine empfindliche Zellschicht auf der Innenseite der Kornea, verfügt nicht über die Fähigkeit, Zellverluste durch Proliferation auszugleichen. Zwei grundsätzliche Probleme ergeben sich aus dieser Eigenschaft des kornealen Endothels für die Keratoplastik: ein Endothelzellverlust tritt zum einen während der Hornhautkonservierung vor Keratoplastik auf und führt zu einem Ausschluss vieler Transplantate, zum anderen ist er oftmals im Zuge von immunvermittelten Abstoßungsreaktionen oder in Folge chronischer Vorgänge nach Keratoplastik zu beobachten. Aus diesem Grund ist eine möglichst hohe Endothelzelldichte auf kornealen Transplantaten eine Voraussetzung für den Erfolg einer Keratoplastik.

Das erste Ziel dieser Arbeit war deshalb die Übertragung des Gens für den aziden FGF (aFGF) in korneale Endothelzellen mit Hilfe des nicht-viralen Gentransfers. Dazu wurden verschiedene Lipid-Formulationen für den Gentransfer in humane korneale Endothelzellen in vitro optimiert. Der Einsatz von DAC-30 und Lipofectin für den aFGF-Gentransfer führte zu einer deutlichen Proliferationssteigerung (um ca. 50 %) der Zellen, womit der Einsatz dieses Wachstumsfaktors eine gute Möglichkeit darzustellen scheint, die prä-operative Ausgangssituation kornealer Transplantate zu verbessern.

Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit Untersuchungen zur Immunmodulation nach Keratoplastik. Eine Hauptrolle bei der Abstoßung kornealer Transplantate spielen CD4+ T-Lymphozyten. In anderen Transplantationsmodellen konnte durch die lokale Überexpression immunmodulatorischer Zytokine die Entstehung und Aktivierung dieser Zellen gehemmt und eine verlängerte Transplantatüberlebenszeit erzielt werden. Mit Hilfe gentherapeutischer Vektoren (Adenoviren, Liposomen) wurden die immunmodulatorischen Zytokine vIL-10 und rIL-4 ex vivo in korneale Transplantate eingebracht. Nach erfolgreichen in vitro-Untersuchungen zur Genexpression wurden die transduzierten/transfizierten Hornhäute in einem starken Abstoßungsmodell der Ratte transplantiert, was jedoch zu keiner signifikanten Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit führte.

Diese Arbeit liefert Hinweise darauf, dass der lokale Gentransfer von vIL-10 in der Keratoplastik nicht für eine Immunmodulation geeignet ist, und dass sowohl die Zytokindosis, als auch der Zeitpunkt und der Ort der Vektorapplikation eine entscheidende Rolle für den Transplantationserfolg spielen.

Eigene Schlagworte: Keratolastik, korneales Endothel, aFGF, vIL-10, Adenovirus, kationische Lipide, Gentransfer

Abstract

Keratoplasty is the most common transplantation of human tissue. The corneal endothelium constitutes a damagable cell layer on the inner surface of the cornea, unable to proliferate. From this, two general problems arise for the outcome of keratoplasty: loss of corneal endothelial cells occurs on the one hand during corneal long time storage before keratoplasty and enforces the lack of donor tissue, on the other hand it is often correlated with immune mediated rejections as well as with chronic processes after keratoplasty. Therefore an endothelial cell number as high as possible on corneal grafts displays a requirement for successful keratoplasties.

The first aim of this study was non-viral gene transfer of the aFGF (acidic FGF) gene in corneal endothelial cells. Different lipid formulations were optimized for gene transfer in human corneal endothelial cells in vitro. Application of DAC-30 and Lipofectin for aFGF gene transfer clearly showed a stimulating effect on cell proliferation (approximately 50 %). Thus, the use of aFGF seems to be a good possibility for improving the pre-operative situation of corneal allografts.

The second part of this study deals with the immune modulation after keratoplasty. CD4+ T-lymphocytes play a key role in rejection processes after keratoplasty. Local over expression of immunomodulatory cytokines in different transplantation models could inhibit the development and activation of these cells and was able to prolong the allograft survival time. Using different gene therapeutic vectors (adenoviruses, liposomes) the immunomodulatory cytokines vIL-10 and rIL-4 were transferred ex vivo in corneal allografts. After successfully determined gene expression in vitro, the transduced/transfected corneal allografts were transplanted in a strong rejection model of the rat. However, this was not sufficient in prolonging the graft survival time significantly.

This study provides indications, that local gene transfer of vIL-10 in keratoplasty is not suitable for an immune modulation, and that both cytokine dose as well as time point and site of vector application play an important role for successful transplantation.

Keywords: Keratoplasty, corneal endothelium, aFGF, vIL-10, adenovirus, cationic lipids, gene transfer

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29.11.2004