Das Plasmid p267, das die kodierende DNA-Sequenz für aFGF enthält, wurde von der Arbeitsgruppe Prof. Courtois, INSERM U118, Paris zur Verfügung gestellt. Alle weiteren Klonierungsarbeiten mit diesem Plasmid wurden in der Arbeitsgruppe von Frau Dr. R. Reszka, MDC, Berlin-Buch, durchgeführt. Die aFGF-cDNA wurde nach einer Restriktion mit den Enzymen Xho I und Bgl II in den Vektor pSLV-neo kloniert. Das Plasmid wurde vermehrt und mittels Restriktion und Sequenzierung überprüft. Die Restriktion erfolgte mit den Enzymen Xho I, Bgl II, Bam HI und Hind III. Die Agarosegelelektrophorese bestätigte die erwarteten Fragmente. Die Sequenzanalyse erfolgte nach Sanger et al., (1977). Bei der Sequenzierung der aFGF-cDNA stellte sich heraus, dass ein komplettes Triplett (AGG; entspricht R) fehlt. Damit war die aktive Form des Proteins in Frage gestellt. Um den Fehler zu beheben, wurde eine Reparatur-PCR durchgeführt. Der „repair“-Primer (5‘-GCT TCT CGA GCC ACC ATG AAT TAC AAG AAG CCC AAA CTC CTC TAC TGT AGC-3‘) fügte hierbei das fehlende Triplett in die cDNA-Sequenz ein. Das resultierende Plasmid wurde vermehrt und sequenziert. Die Sequenzierung ergab diesmal die richtige Nukleotidabfolge, sodass für die nachfolgenden Experimente die Aktivität des aFGF gewährleistet war.

Die humane korneale Endothelzelllinie HCEC GVO 12/96L wurde von Herrn Dr. Bednarz und Frau Prof. Engelmann aus der Universitätsaugenklinik Hamburg Eppendorf etwa in der 100. Passage zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden unter Standardbedingungen im Brutschrank bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Als Medium diente DMEM mit 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamin und lediglich 2% FKS. Das serumreduzierte Medium sollte ein optimales Wachstum der Zellen verhindern und damit der Situation von Primärkulturen möglichst nahe kommen. Alle Versuche wurden mit Zellen von der 100. bis ca. 130. Passage durchgeführt.

Zur Langzeitlagerung wurden ca. 5x10⁶ Zellen in 1ml Einfriermedium aufgenommen und nach einem Gefrierschritt bei –80°C in flüssigem Stickstoff bei –196°C gelagert. Das Einfriermedium enthält 10% Dimethylsulfoxid (DMSO), welches die Kristallisation von intrazellulärem Wasser und die damit verbundene Zerstörung der Zellmembranen durch die wasserbedingte Volumenzunahme verhindern kann. Da DMSO bei RT toxisch auf die Zellen wirkt, wurden alle Einfrierschritte auf Eis bzw. bei 4°C durchgeführt.

Zum Auftauen wurden die Zellen zügig im Wasserbad bei 37°C erwärmt, tropfenweise in kaltes Kulturmedium überführt und abzentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in Kulturmedium resuspendiert und in geeigneter Zelldichte in Kulturgefäße ausgesät.

Die Übertragung von Fremd-DNA in die Zellen erfolgte mit Hilfe verschiedener kommerziell erhältlicher Transfektionsreagenzien auf Lipid-Basis. Bei Lipofectin, Lipofectamine, DMRIE-C, Cellfectin (Invitrogen) und DAC-30 handelt es sich um Liposomen, bei Superfect, Effectene (Qiagen) und FuGene6 (Roche) um nicht-liposomale Transfektionsreagenzien. Alle Transfektionen erfolgten nach Angaben der Hersteller. Um die Effizienz der Genübertragung von DAC-30 zu erhöhen, wurde Protaminsulfat (PS, 1mg/ml) 1:50 zugesetzt.

Reagenz

Name / Helfer-Lipid

Lipofectin

N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchloride (DOTMA) / DOPE

DMRIE-C

1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxy ethyl ammonium bromide (DMRIE) / Cholesterol

DAC-30

3[N-(N,N‘-dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterol / DOPE

FuGENE6

Multi-Komponenten-Lösung auf Lipidbasis

Effectene

nicht-liposomale Lipidlösung in Verbindung mit einem speziellen DNA- kondensierenden Enhancer

Tabelle 2: Eine Auswahl der verwendeten Transfektionsreagenzien und ihrer Helferlipide

Anschließend erfolgte der Gentransfer des Fibroblasten-Wachstumsfaktors-1 (FGF-1, aFGF) unter den für jedes Transfektionsreagenz ermittelten optimalen Bedingungen. Nach der Transfektion wurden die Zellen über eine Woche in Kultur gehalten und an den Tagen 4 und 7 mit Hilfe der Trypanblau-Färbung in der Zählkammer quantifiziert.

Für den biochemischen Nachweis des aFGF-Proteins in den transfizierten Zellen, wurden diese lysiert. Dafür wurden die Gentransfer-Experimente in 6cm-Schalen durchgeführt, um ausreichend große Mengen an Zellextrakt für den Proteinnachweis zu gewinnen. An den Tagen 4 und 7 nach Transfektion wurden die Zellen trypsiniert, pelletiert, 1x mit PBS gewaschen und in 50µl kaltem Lysispuffer, der Proteinase-Inhibitoren enthielt, resuspendiert. Die Fragmente wurden erneut pelletiert und der die löslichen Zellproteine enthaltende Überstand gesammelt und bei –80°C eingefroren.

Die Gesamtproteinbestimmung erfolgte mit dem Micro-BCA-Protein Test der Firma Pierce. Damit können Proteinkonzentrationen von 0,5-20µg/ml erfasst werden. Dieser Test beruht auf der Eigenschaft von Proteinen, mit Cu²⁺-Ionen im alkalischen Milieu blaue Farbkomplexe zu bilden. Die photometrische Messung dieser Komplexe erfolgte bei 562nm. Untersucht wurde der Proteingehalt von aFGF-transfizierten HCEC. Um in dem Messbereich des Tests zu bleiben, mussten die lysierten Zellen 1:50 in PBS verdünnt werden. Über eine BSA-Verdünnungsreihe wurde eine Eichkurve erstellt, aus der der Proteingehalt der Proben direkt abgelesen werden konnte. Über die eingesetzte Probenmenge konnte die Gesamtproteinkonzentration in 1ml Probe ermittelt werden.

Für die Auftrennung der Proteine wurden 100µg Gesamtprotein von jedem Zelllysat pro Geltasche aufgetragen. Zuvor wurde das entsprechende Lysatvolumen 1:1 mit Probenpuffer versetzt und 3 min bei 95°C aufgekocht. Nach Beendigung des Gellaufs folgte der Transfer der aufgetrennten Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran. Zur Überprüfung wurde diese nach dem Transfer in Ponçeau-Lösung überführt, wobei die Proteinbanden rot angefärbt wurden. Nach dem Blocken (4°C ü.N. oder RT 1h) in 5% Milchpulver in TBST konnte die Antikörper-Färbung durchgeführt werden. Die Antikörper wurden in 3% BSA/TBST verdünnt, anti-aFGF 0,1 mg/ml, das Peroxidase-Konjugat 1:10 000. Die Inkubationszeit betrug jeweils 1 h. Nach einer abschließenden Spülung in TBST erfolgte die Entwicklung des Blots mit Hilfe des ECL-Assays von Amersham. Die entwickelte Membran wurde in eine Filmkassette eingelegt und anschließend in der Dunkelkammer entwickelt.

Die adenoviralen Vektoren, die in dieser Arbeit Anwendung fanden, wurden in der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. Thomas Ritter, Institut für Medizinische Immunologie, Charité-Universitätsmedizin Berlin, hergestellt.

Über homologe Rekombination der Zielgen-DNA aus dem rekombinanten pACCMV-Vektor in die E1-Region des adenoviralen Plasmids pJM17 entstanden während einer Ko-Transfektion mittels Kalzium-Phosphat in eine Verpackungszelllinie (911, 293) rekombinante Adenoviren, die jedoch außerhalb der Verpackungszelllinie replikationsdefizient sind. Rekombinante Adenoviren weisen aus Gründen der biologischen Sicherheit und zur Steigerung der Verpackungskapazität eine Deletion im, für die Virusreplikation wichtigen, E1-Leserahmen auf und sind damit nur in speziellen Verpackungszelllinien, die die adenoviralen E1A- und E1B-Proteine konstitutiv exprimieren, in der Lage, sich zu replizieren. Nach Überprüfung, Vermehrung und Aufreinigung im Cäsium-Chlorid-Gradienten konnten die adenoviralen Konstrukte in weiterführenden Studien eingesetzt werden. Folgende Konstrukte kamen in den Experimenten zur Anwendung: AdvIL-10, AdrIL-4, AdEGFP, Adβ-gal und Ad dl 312 (Ad0). Nach persönlicher Mitteilung von Dr. Ritter konnten die Bioaktivitäten der Virus-kodierten vIL-10 (Dissertation von Frau Dipl.-Biol. Christine Brandt) und IL-4 Zytokingene nachgewiesen werden.

Zur Bildung der Transfektions-Komplexe wurde parallel zur Kornea-Entnahme das Liposom Lipofectamine 2000 (Invitrogen) in verschiedenen Konzentrationen, 10µg Transferrin (Sigma) und 1µg des Plasmids pcDSRα-BCRF1 (PD Dr. Thomas Ritter, Berlin), das unter der Kontrolle eines SV40-Promotors für vIL-10 kodiert, zusammenpipettiert und mit serumfreiem Opti-MEM^®-Medium auf ein Gesamtvolumen von 250µl aufgefüllt. Diese Mischung wurde 30min zur Komplexbildung bei RT inkubiert. Die frisch entnommenen Hornhäute wurden mit PBS gespült und anschließend in jeweils 250µl Opti-Mem und Transfektionslösung aufgenommen.
Auch hier wurde darauf geachtet, dass die Hornhaut vollständig mit der Transfektionslösung bedeckt war. Nach drei Stunden Inkubation im Brutschrank bei 37°C wurde die Lösung vorsichtig abgezogen und die Hornhaut dreimal zur Entfernung der Komplexe gewaschen. Anschließend wurde die Kornea mit 500µl DMEM ohne FKS versetzt und weitere drei Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit konnten die Hornhäute entweder nach Zugabe von DMEM mit 2 % FKS und Amphotherizin B (1:1000) weiter ex vivo kultiviert und der Überstand zu verschiedenen Zeitpunkten zur Analyse der Zytokinproduktion entnommen werden, oder direkt der allogenen Hornhauttransplantation zugeführt werden.

Zur Quantifizierung der Zytokinproduktion durch die adenoviral transduzierten oder liposomal transfizierten Hornhäute wurden die Überstände der Korneae zu verschiedenen Zeitpunkten nach Gentransfer geerntet und mittels ELISA analysiert. Die Messung der vIL-10-Produktion erfolgte über den kommerziell erhältlichen ELISA-Kit der Firma Coulter-Immunotech (Hamburg). Der rIL-4-ELISA wurde am Institut für Medizinische Immunologie (Charité-Universitätsmedizin Berlin) in der Arbeitsgruppe von Herrn PD Dr. T. Ritter etabliert. Hierfür wurde ein aus OX-81 Hybridoma Zellen gewonnener anti-Ratten-IL-4 monoklonaler Antikörper (0,81mg/ml 1:500 in 0,1M Karbonatpuffer, 50µl/Loch) über Nacht bei 4°C an eine 96-Loch-Platte gebunden. Am nächsten Tag wurde der Beschichtungspuffer verworfen und die Platte mit 100µl Blockpuffer/Loch für 2h bei Raumtemperatur geblockt. Anschließend wurden Standard (rekombinantes Ratten IL-4) und Proben in entsprechenden Verdünnungen mit 50µl/Loch aufgetragen und 2h schüttelnd bei RT im Dunkeln inkubiert. Nach vier Waschschritten wurde der sekundäre Antikörper (anti-Ratten-IL-4-biotinyliert, 0,5mg/ml) 1:500 in Verdünnungspuffer zu je 50µl/Loch aufgetragen und für 1h inkubiert. Nach weiteren 4 Waschschritten wurde Streptavidin-Peroxidase (0,64mg/ml) 1:2000 verdünnt und mit je 50 µl/Loch in die Vertiefungen pipettiert. Nach der einstündigen Inkubationszeit und den 4 Waschschritten wurden 50µl Substrat A+B (1:1) pro Vertiefung zugegeben und 30 min inkubiert. Schließlich wurde die Reaktion mit 1M Schwefelsäure (50µl/Loch) abgestoppt und die Extinktion bei 450nm gemessen.

Alle Tierversuche wurden nach den Anforderungen der „Guiding Principles in the Care of Animals“ des National Institute of Health, Bethesda und den Richtlinien der Senatsverwaltung Berlin, durchgeführt. Es wurde nur jeweils ein Auge transplantiert, sodass die Tiere auf der anderen Seite ihre Sehkraft behielten.

Die Korneatransplantationen der adenoviral transduzierten Hornhäute wurden von Frau MUDr. Klará Sedláková, die der liposomal transfizierten Hornhäute von Dr. Nianqiao Gong durchgeführt.
Für die Versuche wurden 8-10 Wochen alte, weibliche Ratten mit einem Gewicht von 200-250g verwendet. Es wurden Zuchtlinien verwendet, die sich in ihren MHC Klasse I und II Histokompatibilitätsantigenen unterscheiden (Gill et al., 1987).

Das Spendertier (Wistar Furth, WF) wurde durch eine Inhalationsnarkose eines Gemischs von CO₂ und Lachgas in einer in der tierexperimentellen Anlage vorhandenen Einrichtung getötet. Nachfolgend wurde mit einem 3,5mm Trepan die Hornhaut entnommen und ex vivo transduziert oder transfiziert. Das Empfängerauge wurde vor dem Eingriff mit 1% Atropin Sulfat weitgetropft, um Irisschäden während der Transplantation zu vermeiden. Die Empfängertiere erhielten eine intramuskuläre Injektion einer Kombination aus Ketavet (16,5 mg/Tier (200g)) und Rompun (0,7 ng/Tier (200g)) zur Anästhesie. Mit einem 3,0mm Trepan wurde aus dem Empfängertier die rechte Hornhaut ausgestanzt und die transduzierte Spenderhornhaut mittels durchgehender Naht eingesetzt. Um die Augenvorderkammer zu stabilisieren und Linsen- und Iris-Schädigungen zu vermeiden, wurde eine viskoelastische Substanz (Healon) eingebracht, die vor dem Verschluss der Wunde wieder entfernt wurde. Eine kleine Luftblase, die anschließend in die Vorderkammer eingebracht wurde, diente dazu, die frisch eingesetzte Kornea von der Iris zu trennen (Pleyer et al., 1995). Das Nahtmaterial verblieb bis zum Versuchsende im Auge. Die transplantierten Tiere wurden unter dem Operationsmikroskop dreimal innerhalb der ersten postoperativen Woche und anschließend täglich kontrolliert. Der Grad der Korneatrübung diente als Indikator für die Transplantat-Abstoßung. Bei einer Bewertungs-Skala von 0-4 galt eine Trübung von 3 oder höher als abgestoßen. Am Tag der Abstoßung bzw. 10 Tage post OP wurden bei einigen Gruppen das Transplantat, die drainierenden Lymphknoten und die Milzen entnommen. Die Transplantate wurden für die Histologie in OCT eingebettet. Mit Lymphknoten und Milzen wurde am Tag der Entnahme eine gemischte Lymphozytenkultur angesetzt.

Als Kontrollen dienten nicht-transduzierte allogene (WF) und syngene (Lewis, Lew) Hornhauttransplantate, sowie mit einem Adenoviruskonstrukt ohne therapeutisches Gen (Ad0) bzw. mit Adβ-gal transduzierte syngene und allogene Hornhäute. In der Liposomenkontrollgruppe wurden Hornhäute verwendet, die nur mit dem Liposom und Transferrin, ohne Plasmid behandelt worden waren.

Sämtliche histologischen Untersuchungen wurden von Frau Nadine Schmidt durchgeführt und sind Bestandteil ihrer Dissertation zum Dr. med.. Die Hornhäute der Ratten wurden an den Tagen 10, 17 und 24 nach Transplantation entnommen, OCT-fixiert und kryokonserviert. Nach Anfertigung von Gewebeschnitten erfolgte mit Hilfe der Avidin-Biotin-Komplex-Methode die monoklonale Antikörperfärbung für CD4, CD8, CD25, CD45, NK-Zellen und Monozyten. In dieser Arbeit sind nur die Färbungen für CD4 und CD8 dargestellt.

Puffer 1

25mM Tris, pH 8,0
10mM EDTA

Puffer 2

0,2M NaOH
1% SDS

Puffer 3

3M Natriumacetat, pH 5,5

TAE (50x)

10mM Tris-Base

1mM EDTA

1,6mM Eisessig

6xLadepuffer

0,25% Bromphenolblau

40% Sucrose in H₂O

Ethidiumbromid-Stammlösung

10mg/ml in H₂O

DNA-Marker

50 µl 1kb-Marker

100µl Ladepuffer

350µl TAE-Puffer

Zell-Lysispuffer

100mM Tris

0,9% NaCl

5mM EDTA

1% Triton X-100

Proteaseinhibitoren

SDS-Page-Laufpuffer

3,0285 g/l Tris-Base

14,64 g/l Glycin

1 g/l SDS

Probenpuffer

10% Glycerin

5% β-Mercaptoethanol

3% SDS

125mM Tris-HCl pH 6,8

0,6% Bromphenolblau

Proteaseninhibitoren

Trenngel 15%

Sammelgel 5%

30 % Acrylamid/0,8 % Bisacrylamid Stammlösung

3,0 ml

0,33 ml

1,88M Tris/HCl pH8,8

1,2 ml

0,625M Tris/HCl pH 6,8

0,4 ml

0,5% SDS

1,2 ml

0,4 ml

A. dest

0,6 ml

0,87 ml

TEMED

5 µl

2 µl

APS 10%

30 µl

10 µl

Tabelle 3: Zusammensetzungvon Trenn- und Sammelgel in den verwendeten Konzentrationen.

Multicolored Protein Markers

NENLife Science Products, Boston, MA, USA

Transfer-Puffer

3,0285 g/l Tris-Base

11,265 g/l Glycin

10% Methanol

pH 8,3

TBST (10x)

320 g/4l NaCl

96,8 g/4l Tris-Base

40 ml/4l Tween-20

pH 7,6

Milchpulver

5 % in TBST

Ponceau S Lösung

Sigma, St. Lois, MO, USA

Beschichtungspuffer

0,14% Na₂CO₃

0,3% NaHCO₃

Blockpuffer

20 ml/l Tris, 0,1 M, pH 7,5

29,22 g/l NaCl (0,9 %)

1 ml/l Tween 20 (0,1 %)

+1:10 Genosys (Pharmingen)

Waschpuffer

41,25g/5 l Na₂HPO₄ x 2 H₂O

5,5 g/5 l NaH₂PO₄ x H₂O

438,5 g/5 l NaCl

0,1 % Tween-20

pH 7,4

Streptavidin-POD

Biosource, Camarillo, CA, USA

Substrat A+B

Pharmingen, San Diego, CA, USA

Verdünnungspuffer (Diluent)

Pharmingen, San Diego, CA, USA

Stopplösung

1N H₂SO₄

Stocklösungen:

Ferricyanide/Ferrocyanide Stocklösung (je 125mM in A.dest)

1:1 Mischung von 250mM K₃(Fe(CN)₆) und K₄(Fe(CN)₆) in A.dest

1M MgCl₂ in A.dest

50mg/ml X-gal in DMSO

Fixierlösung:

2% Formaldehyd (Stocklösung 37%)

0,2% Glutaraldehyd (Stocklösung 25%)

in PBS

Färbelösung:

19,3 ml PBS

40µl MgCl₂

400µl Ferri/Ferro-Lösung

200µl X-gal (in DMSO)

T-Zell-Medium:

1% Natriumpyruvat

10% FKS

2% autologes Rattenserum (Lew)

1% Penicillin/Streptomycin

1% Glutamin

0,4% β-Mercapto-Ethanol (Stock: 1:1000 in DMEM) in DMEM

L-NMMA

Alexis, Carlsbad, CA, USA

Pancoll Rat

PAN Biotech GmbH, Aidenbach, D

FACS-Puffer:

2% FKS

0,1% Natriumazid

in PBS

FACS Flow

Becton Dickinson, San Jose, USA

FACS Rinse

Becton Dickinson, San Jose, USA

FACS Clean

Becton Dickinson, San Jose, USA

DH5:

supE44, Δ lacU169 (Φ80lacZΔM15), hsdR17 , recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1

Stratagene, Heidelberg, D

LB-Medium:

10g Bactotrypton, 5g Yeast Extract, 5g NaCl, H₂O ad 1l

LB-Agar:

15g/l Agar in LB-Medium

Nach Autoklavieren und Abkühlen kann das entsprechende Antibiotikum (Stammlösung 100mg/ml) in einer Konzentration von 100µg/ml hinzugefügt werden.

Humane korneale Endothelzelllinie immortalisiert durch SV40 T-Antigen

Dr. J. Bednarz, Hamburg

DMEM:

1% Glutamin

1% Pen/Strep

1% Natriumpyruvat

2% FKS

für Hornhäute zusätzlich Amphoterizin B 1:1000

Inzucht-Ratten, weiblich, 200-250g, mit komplettem MHC-Mismatch

Lewis (LEW/RT1^l)

MB, Ry, DK

Charles River, Bad Sulzfeld, D

Wistar-Furth (WF/RT1^u)

MB, Ry, DK

Harlan Winkelmann, Borchen, D