1 Einleitung

• 1.1 Die Kornea

  • 1.1.1 Das korneale Endothel

• 1.2 Keratoplastik

  • 1.2.1 Problem: Hornhautkonservierung vor Keratoplastik

  • 1.2.2 Problem: Abstoßungsreaktionen nach Keratoplastik

  • 1.2.3 Prävention der Immunreaktionen nach Keratoplastik

  • 1.2.4 Neue Ansätze zur Prävention von Abstoßungsreaktionen kornealer Transplantate

  • 1.2.5 Gentherapie zur Modulation des kornealen Endothels

    • 1.2.5.1 Nicht-viraler Gentransfer mittels Lipiden

    • 1.2.5.2 Gentransfer mittels viraler Vektoren

    • 1.2.5.3 Adenovirale Vektoren

    • 1.2.5.4 Vor- und Nachteile adenoviraler Vektoren

  • 1.2.6 Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) als Kandidat für die Verbesserung der prä-operativen Ausgangssituation kornealer Transplantate

  • 1.2.7 Modulation der immun-vermittelten Transplantatabstoßung

    • 1.2.7.1 Das Th1-/Th2-„Paradigma“

    • 1.2.7.2 Interleukin-4 (IL-4)

    • 1.2.7.3 Interleukin-10 (IL-10)

    • 1.2.7.4 Gentransfer von IL-4 und IL-10 zur Modulation der Transplantatabstoßung

2 Material und Methoden

• 2.1 Methoden

  • 2.1.1 Klonierungsarbeiten mit dem aFGF-Plasmid

    • 2.1.1.1 Herstellung des aFGF-Plasmids

    • 2.1.1.2 Vermehrung des aFGF-Plasmids

      • 2.1.1.2.1 Herstellung kompetenter Zellen

      • 2.1.1.2.2 Transformation

      • 2.1.1.2.3 Restriktionsanalyse

      • 2.1.1.2.4 Maxi-Präparation

      • 2.1.1.2.5 Elektrophoretische Auftrennung von DNA in Agarosegelen

      • 2.1.1.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

  • 2.1.2 Kultivierung der humanen kornealen Endothelzelllinie

    • 2.1.2.1 HCEC-Zellkultur

    • 2.1.2.2 Kryokonservierung und Auftauen der Zellen

  • 2.1.3 Lipid-vermittelter Gentransfer in HCEC

    • 2.1.3.1 Transfektionen von HCEC

      • 2.1.3.1.1 Marker-Gentransfer

      • 2.1.3.1.2 β-Galaktosidase-Färbung

      • 2.1.3.1.3 Durchflusszytometrische Analyse zur Ermittlung von Effizienz und Toxizität nach Gentransfer

    • 2.1.3.2 Gentransfer von aFGF

      • 2.1.3.2.1 Raster-Elektronen-Mikroskopie

  • 2.1.4 Expressionsuntersuchungen auf Protein-Ebene

    • 2.1.4.1 Zelllyse

    • 2.1.4.2 Gesamtproteinbestimmung

    • 2.1.4.3 Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blot

  • 2.1.5 Gentransfer in der Keratoplastik

    • 2.1.5.1 Adenovirus-vermittelter Gentransfer

      • 2.1.5.1.1 Adenoviraler Marker-Gentransfer in HCEC

      • 2.1.5.1.2 Adenoviraler Gentransfer in ex vivo kultivierte Ratten-Korneae

    • 2.1.5.2 Liposomaler Gentransfer in ex vivo kultivierte Ratten-Korneae

    • 2.1.5.3 Untersuchungen zur Zytokinexpression mittels ELISA

    • 2.1.5.4 Transplantation von Rattenhornhäuten

    • 2.1.5.5 Gemischte Lymphozytenkultur zur Überprüfung der Immunreaktionen im Transplantatempfänger

      • 2.1.5.5.1 Lymphozytengewinnung und Ficoll-Gradient

      • 2.1.5.5.2 Färbung mit CFDA-SE (5,6-carboxyfluorescein diacetate, succhinimidyl ester)

      • 2.1.5.5.3 FACS-Analyse zur Messung der Lymphozyten-Proliferation

    • 2.1.5.6 Histologie

  • 2.1.6 Statistische Auswertung

• 2.2 Materialien

  • 2.2.1 Lösungen und Puffer

    • 2.2.1.1 Puffer für Plasmidpräparation

    • 2.2.1.2 Puffer für Agarose-Gelelektrophorese

    • 2.2.1.3 Puffer für SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

    • 2.2.1.4 Puffer für Western-Blot

    • 2.2.1.5 Puffer für IL-4 ELISA

    • 2.2.1.6 Lösungen für β-Galaktosidase-Färbung

    • 2.2.1.7 Lösungen für MLR

    • 2.2.1.8 Lösungen für FACS-Analyse

  • 2.2.2 Fluoreszenzfarbstoffe

  • 2.2.3 Antikörper

  • 2.2.4 Transfektionsmaterialien

  • 2.2.5 DNA-Vektoren

  • 2.2.6 Adenovirale Konstrukte

  • 2.2.7 Proteine

  • 2.2.8 Elektronenmikroskopie

  • 2.2.9 Transplantationsmaterialien

  • 2.2.10 Biologische Materialien

    • 2.2.10.1 Zelllinien und Medien

    • 2.2.10.2 Versuchstiere

  • 2.2.11 Versuchssysteme (Kits) und Enzyme

  • 2.2.12 Verbrauchsmaterialien

  • 2.2.13 Geräte, Messgeräte

3 Ergebnisse

• 3.1 Nicht-viraler Gentransfer in humane korneale Endothelzellen

  • 3.1.1 Optimierung der Gentransfer-Bedingungen für HCEC

    • 3.1.1.1 Beta-Galaktosidase (β-gal)-Test

    • 3.1.1.2 Durchflusszytometrie zur exakten Bestimmung von Effizienz und Toxizität der verwendeten Lipide

  • 3.1.2 Proliferationsanalyse der HCEC nach Gentransfer von aFGF

  • 3.1.3 Expression von aFGF nach Gentransfer in HCEC

• 3.2 Einsatz von Gentransfermethoden in der Keratoplastik

  • 3.2.1 Adenoviraler Gentransfer

    • 3.2.1.1 Adenoviraler Marker-Gentransfer in HCEC und ex vivo kultivierte Rattenhornhäute

    • 3.2.1.2  In vitro-Untersuchungen zur Genexpression nach adenoviralem Gentransfer

    • 3.2.1.3 Kombinierter adenoviraler Gentransfer (AdvIL-10/AdrIL-4)

    • 3.2.1.4 Adenoviraler Gentransfer zur Modulation der Abstoßungsreaktion transplantierter Ratten-Hornhäute

    • 3.2.1.5 Adenoviraler Gentransfer von vIL-10 in der Keratoplastik

      • 3.2.1.5.1 Einfluss der vIL-10-Produktion durch transduzierte Hornhäute auf die Transplantatüberlebenszeit

    • 3.2.1.6 Kombinierter adenoviraler Gentransfer von vIL-10 und rIL-4 in der Keratoplastik

    • 3.2.1.7 Einfluss des adenoviral exprimierten Zytokins vIL-10 durch ex vivo transduzierte Hornhäute auf die Immunreaktion nach Keratoplastik

    • 3.2.1.8 Immunhistologische Untersuchungen

  • 3.2.2 Liposomaler Gentransfer von vIL-10 in der Keratoplastik

    • 3.2.2.1  In vitro-Untersuchungen zur Genexpression nach liposomalem Gentransfer

    • 3.2.2.2 Einfluss der vIL-10-Produktion durch liposomal transfizierte Hornhäute auf die Transplantatüberlebenszeit

4 Diskussion

• 4.1 Das Hornhautendothel als Zielstruktur für die Gentherapie

  • 4.1.1 Nicht-viraler Gentransfer in das Hornhautendothel

    • 4.1.1.1 Einsatz verschiedener Lipide für den Gentransfer in HCEC

    • 4.1.1.2 Einsatz von Protaminsulfat zur Steigerung der Gentransfereffizienz

    • 4.1.1.3 Gentransfer von aFGF und Wirkung auf die Proliferation von Hornhautendothelzellen

    • 4.1.1.4 Beeinflussung des nicht-viralen Gentransfers durch Ladungsunterschiede und Helfer-Lipid

    • 4.1.1.5 Die extrazelluläre Matrix und ihr Einfluss auf die Wirkung von aFGF

• 4.2   Gentransfer in der Keratoplastik

  • 4.2.1 Viraler Gentransfer in das Hornhautendothel

    • 4.2.1.1 Einsatz der immunmodulatorischen Zytokine vIL-10 und rIL-4 in Transplantationsmodellen

  • 4.2.2 Kritische Betrachtung der eigenen Ergebnisse

• 4.3 Fazit und Ausblick

Literaturverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

Anhang

 Danksagung

 Selbstständigkeitserklärung

Tabelle 1: Virale und nicht-virale Gentransfervektoren

Tabelle 2: Eine Auswahl der verwendeten Transfektionsreagenzien und ihrer Helferlipide

Tabelle 3: Zusammensetzungvon Trenn- und Sammelgel in den verwendeten Konzentrationen.

Tabelle 4: Überblick über die verwendeten Transfektionsreagenzien (TR).Die Konzentrationen und Lipid:DNA-Ratios für die einzelnen TR wurden nach Angaben der Hersteller eingesetzt und für HCEC optimiert.

Tabelle 5: Zusammenfassung der ermittelten optimalen Lipidkonzentrationen und Lipid:DNA-Ratios, einschließlich der damit erreichten Effizienzen und Toxizitäten der getesteten Transfektionsreagenzien.

Tabelle 6: Analyse des Zytokingehalts in Überständen von mit rIL-4 und vIL-10 transduzierten Korneae.

Abbildung 1: Schematischer Aufbau der humanen Kornea.

Abbildung 2 : Querschnitt durch eine Kornea und spekularmikroskopische Ansicht des kornealen Endothels (aus Wolff’s Anatomy, 8th Edition, 1997). BZ=Bowmann-Schicht, K=Keratozyten, DM=Descemet Membran, En=Endothel .

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Induktion einer Immunantwort (nach Pleyer und Ritter, 2003). T-Zellen erkennen ein Antigen und werden durch Interaktionen zwischen TCR-MHC (Signal 1) und ko-stimulatorischen Molekülen (CD28-B7, CD40L-CD40) (Signal 2) aktiviert. Aktivierte T-Zellen sekretieren Zytokine, die wiederum Makrophagen, B-Zellen, zytotoxische T-Zellen und natürliche Killerzellen aktivieren können. APZ=Antigen-präsentierende Zelle, TH=T-Helferzelle, TCR=T-Zell-Rezeptor, IL-2=Interleukin-2; IL-2R=IL-2-Rezeptor.

Abbildung 4: Schematische Darstellung des Lipid-vermittelten Gentransfers und ein Querschnitt durch ein Liposom.

Abbildung 5: Adenoviruspartikel (nach Modrow & Falke, 1997)

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Herstellung replikationsdefizienter, rekombinanter adenoviraler Vektoren und der Transduktion einer Zielzelle mittels dieser Vektoren (nach Kay et al., 2001).

Abbildung 7: Schematische Darstellung der Methode der ex vivo-Transduktion einer Rattenhornhaut aus: PD Dr. T. Ritter (Habilitationschrift).

Abbildung 8: Transfektion von HCEC mit β-gal und ausgewählten Lipiden. Gezeigt sind Darstellungen von einem repräsentativen Experiment, mit den verwendeten Lipid-Konzentrationen und Lipid:DNA-Ratios.

Abbildung 9: Durchflusszytometrische Ermittlung von GFP-positiven (Effizienz) und avitalen Zellen (Toxizität). Dargestellt ist der prozentuale Anteil von GFP-positiven und PI-gefärbten Zellen bei verschiedenen Konzentrationen und Lipid:DNA-Ratios der einzelnen TR. Nicht-transfizierte Zellen dienten als Kontrollen. (A) zeigt die für die weiteren Versuche genutzten TR, in (B) sind die drei TR dargestellt, die aufgrund ihrer hohen Toxizität für die weiteren Versuche nicht mehr verwendet wurden (n=6).

Abbildung 10: Proliferation von HCEC nach Transfektion mit dem aFGF-Expressionsvektor und verschiedenen Transfektionsreagenzien. (A) Zellen, die mit DAC-30 transfiziert wurden, zeigen den stärksten proliferativen Effekt, gefolgt von DAC-30 + PS und Lipofectin (n=11). Nahezu keine Proliferationssteigerung ist nach Gentransfer mit Fugene, Effectene und DMRIE-C ersichtlich (n=11). Exogene Zugabe von humanem rekombinantem (n=6) und bovinem aFGF (n=13) diente mit 10ng/ml als Positivkontrolle in nicht-transfizierten Zellen. Mit β-gal-transfizierte Zellen (n=5) als Negativkontrolle. (B) zeigt als weitere Kontrolle die Behandlung der Zellen mit den jeweiligen Lipiden ohne Plasmid (n=5). N=nicht-transfizierte Zellen (n=9); Signifikanz: *p<0,05, **p<0,006 bezogen auf nicht-transfizierte Zellen.

Abbildung 12: Western Blot zur Bestimmung der Expression von aFGF.Die Expression von aFGF ist in transfizierten HCEC an Tag 4 (A) und 7 (B) mit Lipofectin (LF), DAC-30 (DAC), DAC-30 + PS (DPS) und Kontrollen dargestellt. Als Positivkontrolle dienten 50ng humanes rekombinantes aFGF (PC). Expression wurde in allen transfizierten Zellen festgestellt, mit abnehmender Quantität von Tag 4 zu Tag 7. Keine Expression zeigte sich in nicht-transfizierten Zellen (non) und Zellen, die mit 10ng/ml exogenem humanen rekombinanten aFGF (hr aFGF exogen) behandelt worden waren.

Abbildung 13: Gentransfereffizienz von HCEC, die mit verschiedenen Konzentrationen von AdEGFP und 8µg/ml Polybren transduziert wurden.

Abbildung 14: Darstellung einer Kornea nach adenoviralem Gentransfer von EGFP. Auf der linken Seite ist das transduzierte Hornhautendothel sehr gut zu erkennen. Keratozyten und Epithelzellen weisen keine EGFP-Expression auf. Die Kornea wurde mit 1x10 ⁸ pfu AdEGFP transduziert und nach 48 h in OCT eingefroren. Es wurden Gefrierschnitte angefertigt, die unter dem Fluoreszenzmikroskop fotografiert werden konnten. Die Pfeile zeigen das grün fluoreszierende Endothel.

Abbildung 15: Expression von vIL-10 nach ex vivo-Transduktion von 6 Korneae. Die Hornhäute wurden mit jeweils 1x10 ⁸ pfu AdvIL-10 transduziert und zu den verschiedenen Zeitpunkten der Zytokingehalt des Kulturüberstandes bestimmt; n=6.

Abbildung 16: Darstellung von Hornhauttransplantaten im Tier. Links: ein klares Transplantat, Bewertung 0; rechts ein abgestoßenes, trübes Transplantat, Bewertung 4.

Abbildung 17: Kaplan-Meier-Kurve zur Darstellung der Transplantatüberlebenszeiten nach Transduktion mit AdvIL-10, Kontrollvektor (Ad0) und unbehandelten Hornhäuten. Der Einsatz des therapeutischen Gens führte zu keiner Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit, jedoch wird ein verlängernder Effekt durch die Behandlung mit dem Kontrollvektor (Ad0) sichtbar; Sine=unbehandelt, post-Tx=nach Transplantation; p>0,05.

Abbildung 18: Kaplan-Meier-Kurve zur Darstellung der Transplantatüberlebenszeiten nach Ko-Transduktion mit AdvIL-10 und AdrIL-4. Der Einsatz des therapeutischen Gens führte zu keiner Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit; Sine=unbehandelt, post-Tx=nach Transplantation; p>0,05.

Abbildung 19: Darstellung der Proliferation von T-Zellen einer nicht-transplantierten Lewis-Ratte. Aus (drainierenden) zervikalen Lymphknoten (DLK), Lymphknoten aus der Leistengegend (LK) und Milz (Mz) wurden Lymphozyten isoliert und nach Färbung mit CFDA-SE syngen mit bestrahlten Lewis-Milzzellen und allogen mit bestrahlten WF-Milzzellen stimuliert. Nach 4 Tagen Inkubation erfolgte die Messung am Durchflusszytometer (n=4 Tiere). syn=syngen; allo=allogen; stim.=stimuliert.

Abbildung 20: Vergleich der Immunreaktionen von syngen und allogen transplantierten Tieren am Tag der Abstoßung, nach allogener Stimulation der isolierten Lymphozyten.Aus den drainierenden Lymphknoten der transplantierten rechten (DLKr, n=7-8) und der nicht-transplantierten linken Seite (DLKl, n=7-8), den Lymphknoten der Leistengegend (LK, n=2-6) und der Milz (Mz, n=7-8) wurden am Tag der Abstoßung die Lymphozyten isoliert und allogen mit bestrahlten WF-Milzzellen stimuliert. Nach 4 Tagen in Kultur wurde die Intensität von CFDA-SE in den Immunzellen gemessen und daraus ihre Proliferationsaktivität berechnet.

Abbildung 21: Proliferationsanalyse der T-Lymphozyten der drei Behandlungsgruppen 10 Tage nach Transplantation. Aus den drainierenden Lymphknoten der transplantierten rechten (DLKr, n=4-5) und der nicht-transplantierten linken Seite (DLKl, n=4-5), den Lymphknoten der Leistengegend (LK, n=4-5) und der Milz (Mz, n=3-5) wurden 10 Tage nach Transplantation die Lymphozyten isoliert und allogen mit bestrahlten WF-Milzzellen stimuliert. Nach 4 Tagen in Kultur wurde die Intensität von CFDA-SE in den Immunzellen gemessen und daraus ihre Proliferationsaktivität berechnet.

Abbildung 22: Darstellung von CD4+-Zellen in Transplantaten der verschiedenen Behandlungsgruppen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Anzahl der infiltrierenden CD4+-Zellen ist in der Therapiegruppe (AdvIL-10) am Tag 10 nach Transplantation verringert, der Unterschied zwischen den Gruppen ist jedoch am Tag 24 nach Transplantation nicht mehr sichtbar. (Die CD4-positiven Zellen erscheinen braungefärbt.)

Abbildung 23: Darstellung von CD8+-Zellen in Transplantaten der verschiedenen Behandlungsgruppen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Die Anzahl der infiltrierenden CD8+-Zellen ist in der Therapiegruppe (AdvIL-10) am Tag 10 nach Transplantation verringert, der Unterschied zwischen den Gruppen ist jedoch bereits am Tag 17 nach Transplantation nicht mehr sichtbar. (Die CD8-positiven Zellen erscheinen braungefärbt.)

Abbildung 24: vIL-10-Konzentrationen im Überstand liposomal transfizierter Hornhäute. Die Korneae wurden frisch entnommen und sofort mit unterschiedlichen Konzentrationen von Lipofectamine 2000, 10µg Transferrin und 1µg pcDSRα-BCRF1 transfiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde der Überstand komplett entnommen und durch frisches Medium ersetzt. Der vIL-10-Gehalt der Überstände wurde mittels ELISA bestimmt und als Mittelwert±Standardabweichung dargestellt, n=3.

Abbildung 25: Kaplan-Meier-Kurve zur Darstellung der Transplantatüberlebenszeiten nach liposomaler vIL-10-Transfektion, Kontroll-Transfektion mit Liposom und Transferrin ohne Plasmid (K-Liposom) und unbehandelten Hornhäuten. Der Einsatz des therapeutischen Gens führte auch hier zu keiner signifikanten Verlängerung der Transplantatüberlebenszeit; Sine=unbehandelt, K-Liposom=Liposom-Kontrolle, post-Tx=nach Transplantation; p>0,05.