Aus dem Otto-Heubner-Centrum für Kinder- und Jugendmedizin
Klinik für Pädiatrie mit Schwerpunkt Pneumonologie und Immunologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

DISSERTATION

Gen-Gen- und Gen-Umwelt-Interaktionsanalysen bei Kindern der Multizentrischen Allergie Studie

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät
der Charité – Universitätsmedizin Berlin

von

Philipp Deindl

aus Mannheim

Dekane: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen
Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. U. Wahn, Charité Universitätsmedizin Berlin
2. Prof. Dr. Th. Fuchs, Universitätshautklinik, Göttingen
3. Prof. Dr. H. Bickeböller, Zentrum für Informatik, Statistik und Epidemiologie, Göttingen

Datum der Promotion: 18. Januar 2005

Widmung:

Meinen Eltern

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Epidemiologie allergischer Erkrankungen
  • 1.2 Genetik
    • 1.2.1 Komplexe genetische Merkmale
    • 1.2.2 Methodik genetischer Untersuchungen
      • 1.2.2.1 Zwillingsstudien
      • 1.2.2.2 Kopplungsstudien
      • 1.2.2.3  „Allele-sharing” Methoden
      • 1.2.2.4  Der Transmissions-Disäquilibrium-Test (TDT)
      • 1.2.2.5 Assoziationsstudien
    • 1.2.3  Genomweite Suchen
    • 1.2.4 Kopplungsstudien in Kandidatengenregionen
    • 1.2.5  Kandidatengenstudien
    • 1.2.6 Funktionelle Studien
  • 1.3 Immunologie der allergischen Reaktion
    • 1.3.1 Die Rolle der T-Zellen
      • 1.3.1.1 T-Helferzellen vom Typ1 und Typ2 und deren Zytokine
    • 1.3.2  Funktionen der Zytokine IL-4 und IL-13
    • 1.3.3 Der Einfluss von IL-4 und IL-13 auf die IgE-Produktion
    • 1.3.4 Aufbau und Wirkungen des IL-4- bzw. des IL-13-Rezeptors
    • 1.3.5 Die Gene IL4, IL13 und IL4RA
      • 1.3.5.1 Kopplungsstudien
      • 1.3.5.2  Kandidatengenstudien
    • 1.3.6 Der Komplementfaktor C5a und sein Rezeptor C5aR
      • 1.3.6.1 Biologische Funktion des Komplementfaktors C5a
      • 1.3.6.2 Der Rezeptor des Komplementfaktors C5aR
      • 1.3.6.3 Hinweise auf immunmodulatorische Funktion des Komplementfaktors C5a
      • 1.3.6.4 Bronchiale Hyperreagibilität im Mausmodell und der Komplementfaktor C5
      • 1.3.6.5  Zusammenhang zwischen einer C5aR-Variante und Asthma
    • 1.3.7  Histamin-N-Methyltransferase (HNMT)
      • 1.3.7.1 Biologische Funktion
      • 1.3.7.2 Funktioneller SNP im HNMT-Gen
  • 1.4  Allergische Erkrankungen
    • 1.4.1 Definition von Allergie und Atopie
    • 1.4.2 Asthma bronchiale und bronchiale Hyperreagibilität
      • 1.4.2.1 Epidemiologie
      • 1.4.2.2 Klinik
      • 1.4.2.3  Bronchiale Hyperreagibilität
        • 1.4.2.3.1  Lungenfunktionstests: Unspezifische bronchiale Provokation
      • 1.4.2.4 Pathophysiologie
    • 1.4.3 Atopische Dermatitis
      • 1.4.3.1 Definition
      • 1.4.3.2  Epidemiologie
      • 1.4.3.3 Klinik
      • 1.4.3.4 Pathophysiologie
    • 1.4.4  Allergische Rhinokonjunktivitis (Heuschnupfen)
      • 1.4.4.1 Definition
      • 1.4.4.2 Epidemiologie
      • 1.4.4.3 Klinik
      • 1.4.4.4 Pathophysiologie
• 2  Fragestellung und Zielsetzung
• 3  Material und Methoden
  • 3.1 Populationen
    • 3.1.1 Multizentrische Allergie Studie (MAS-90)
    • 3.1.2 Barbados-Population
    • 3.1.3 Freiburger Asthma-Population
  • 3.2 Materialien
    • 3.2.1 Geräte
    • 3.2.2 Verbrauchsmaterialien
    • 3.2.3 Reagenzien und Chemikalien
    • 3.2.4 Puffer und Lösungen
    • 3.2.5 Enzyme und zugehörige Puffer
    • 3.2.6 Primer und Sonden
  • 3.3  Methoden
    • 3.3.1 Gewinnung der Blutproben und Extraktion der genomischen DNA
    • 3.3.2 Photometrische Bestimmung der DNA-Konzentration
    • 3.3.3 Verdünnung der Proben
    • 3.3.4 Polymerase-Kettenreaktion
    • 3.3.5 Restriktionsenzymatische Spaltung
    • 3.3.6  Gelelektrophorese (C5aR)
    • 3.3.7 LightCycler
      • 3.3.7.1 Aufbau
      • 3.3.7.2 Sonden
    • 3.3.8  Statistische Methoden
      • 3.3.8.1  Der modifizierte TDT für quantitative Merkmale:
• 4  Ergebnisse
  • 4.1  IL4-, IL13- und IL4RA-SNPs
    • 4.1.1 Allel- und Genotypfrequenzen
    • 4.1.2 Phänotyp-Genotyp Assoziationen und Haplotypanalysen
    • 4.1.3 Interaktionstests
      • 4.1.3.1 Gen-Gen-Interaktionen
      • 4.1.3.2 Gen-Umwelt-Interaktionen
  • 4.2 Der HNMT-(C314T)-SNP
  • 4.3 Der C5aR-(C-245T)-SNP
• 5  Diskussion
  • 5.1 Das Zytokin IL-13
    • 5.1.1  Die Rolle der IL13-(Arg130Gln)- und IL13-(C-1055T)-SNPs
  • 5.2 Der IL4-(C-590T)-SNP
  • 5.3 Die Rolle der genetischen Varianten im IL4RA-Gen
    • 5.3.1 Die IL4RA-(Ser478Pro)- und IL4RA-(Gln551Arg)-SNPs
    • 5.3.2 Der IL4RA-(Ile50Val)-SNP
    • 5.3.3 Die Assoziation von Atopie mit IL4- und IL4RA-SNPs
  • 5.4  Die Rolle des C5aR-(C-245T)-SNP
  • 5.5 Der HNMT-(C314T)-SNP
  • 5.6  Problematik genetischer Studien
    • 5.6.1 Umweltfaktoren
    • 5.6.2 Phänotyp
    • 5.6.3 Ethnizität
    • 5.6.4 Kandidatengenstudien
    • 5.6.5  Gen-Gen-Interaktionen und Haplotypanalysen
• 6  Zusammenfassung
• Abkürzungen
• Literatur
• Danksagung
• Lebenslauf
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tab. 1: Untersuchte Polymorphismen im IL4-, IL13- und IL4RA-Gen. Die unterschiedliche Nomenklatur der SNPs ist u.a. durch verschiedene Genbank-Referenzen zu erklären. Zur pathophysiologischen Bedeutung dieser Gene siehe auch Abb. 9: Die Darstellung zeigt schematisch den Pathomechanismus atopischer Krankheiten. Abkürzungen: CC16 Clara Cell Protein 16, CD Cluster of Differentiation, FceR1-b FC-e Rezeptor 1b (IgE-Rezeptor), GSTP1 Glutathion-S-Transferase 1, HLA Human Leukocyte Antigen, IFN-g Interferon-g, IRF-1 Interferon Regulatory Factor 1, 5-LO 5-Lipoxygenase, LT Lymphotoxin, LTC4 Leukotrien C4 Synthase, PAF Platelet Activating Factor, STAT Signal Transducer and Activator of Transcription, TCR T-Zell Rezeptor, TNF Tumor Nekrose Faktor (nach [7]).
• Tab. 2: Klinische Merkmale der atopischen Dermatitis (nach [57]).
• Tab. 3: Protokolle für die Single- bzw. Duplex-PCR-Ansätze. Bei allen PCR-Ansätzen wurde mit der Annealingtemperatur = 52°C gearbeitet.
• Tab. 4: Allelfrequenzen und Genotypverteilung der SNPs, die Abweichung vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht und Kopplungsungleichgewichts-Analysen (LD) bei 823 Kindern der MAS-Population.
• Tab. 5: Einzelne und kombinierte genetische Effekte von C-1055T und Arg130Gln im IL13-Gen nach Alter unter Berücksichtigung des Geschlechts in der MAS-Population.
• Tab. 6: Transmissions Disäquilibrium Test (TDT) für quantitative Merkmale für Gesamt-Serum-IgE-Werte und 6 SNPs in 382 kompletten Trios (Vater, Mutter, Kind) der MAS-Population nach Alter, Alter², Alter³ und Geschlecht adjustiert.
• Tab. 7: HNMT-Genotypverteilung und Allelfrequenzen in der MAS- Kohorte sowie bei den Freiburger Kindern.
• Tab. 8: C5aR-Genotypenverteilung und Allelfrequenzen in der MAS- Kohorte.
• Tab. 9: Allelfrequenzen des C5aR-(C-245T)-SNP in der MAS-Kohorte und der Barbados-Population. Zum Vergleich zweier Populationen von untereinander nichtverwandten Individuen wurden die (nichtverwandten) MAS-Kinder den (nichtverwandten) Eltern der Barbados Population gegenübergestellt.

Bilder

• Abb. 1: Links sind schematisch unterschiedlich lange polymorphe Bereiche (STRP) in den Allelen der Eltern dargestellt. Die unterschiedliche Länge der PCR-Produkte kommt ausschließlich durch die polymorphen Dinukleotid-Wiederholungen zustande. Nach elektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte (rechts) ergeben sich individuelle Bandenmuster. Sind (zahlreiche) betroffene Geschwister (hier z.B. Kind 1 und 2) an diesem Locus genetisch identisch („allele sharing“) spricht dies für eine Kopplung des Markers mit dem entsprechenden Krankheitsgen.
• Abb. 2: „Betroffene Geschwisterpaar“-Studie: Mit Hilfe von Mikrosatellitenmarkern wird getestet, inwieweit erkrankte Geschwister an bestimmten Genorten genetisch identisch sind (identical-by-descent). Sind dies signifikant mehr als 50% der untersuchten Paare, deutet dies auf eine Kopplung des eingesetzten Markers mit dem Krankheitsbild hin.
• Abb. 3: Transmissions-Disäquilibrium-Test: Betroffene Kinder und deren Eltern (unabhängig ob betroffen oder nicht) werden untersucht. Wird ein Allel von heterozygoten Eltern signifikant häufiger als 50% an betroffene Kinder vererbt, deutet dies auf einen Zusammenhang zwischen diesem Marker und der Krankheit hin.
• Abb. 4: Assoziationsstudie: Betroffene Individuen werden mit nicht betroffenen Individuen verglichen. Dieses Studiendesign bietet sich an, wenn Polymorphismen in Kandidatengenen identifiziert wurden und diese auf eine mögliche Assoziation mit der Krankheit getestet werden sollen.
• Abb. 5: Schematische Darstellung der IL-4 und IL-13 Signalkaskade über den IL-4 Rezeptor und den IL-13 Rezeptor. IL-4 bindet über die IL-4Rα-Kette an beiden Rezeptoren, wogegen IL-13 nur an der IL-13Rα1-Kette wirksam werden kann. Der IL-4 Rezeptor wird auf B- und T-Zellen exprimiert, der IL-13-Rezeptor nur auf B-Zellen. Beide Rezeptortypen aktivieren STAT6, das wiederum T-Helfer-Zellen befähigt, ihre TH2-Eigenschaften zu bewahren und B-Zellen zur Ig-E-Produktion anregt (nach [14]).
• Abb. 6: Schematische Dar-stellung des Interleukin-Clusters auf Chromosom 5. Der lange Arm wird mit q bezeichnet der kurze mit p. Die Zahlen entsprechen Banden, welche in der Metaphasenfärbung sichtbar sind (nicht maßstabsgetreu wiedergegeben).
• Abb. 7: Schematische Darstellung der Polymorphismen innerhalb des IL13-Gens. Der Promotor-SNP an der Position –1112 entspricht C-1055T, der SNP an der Position 2044 resultiert in dem Aminosäureaustausch Arg130Gln (nach Graves et al. 2000).
• Abb. 8: Schematische Darstellung des klassischen und alternativen Weges der Komplementaktivierung und die Wirkungen der Komplementkomponenten.
• Abb. 9: Die Darstellung zeigt schematisch den Pathomechanismus atopischer Krankheiten. Abkürzungen: CC16 Clara Cell Protein 16, CD Cluster of Differentiation, FcεR1-β FC-ε Rezeptor 1β (IgE-Rezeptor), GSTP1 Glutathion-S-Transferase 1, HLA Human Leukocyte Antigen, IFN-γ Interferon-γ, IRF-1 Interferon Regulatory Factor 1, 5-LO 5-Lipoxygenase, LT Lymphotoxin, LTC4 Leukotrien C4 Synthase, PAF Platelet Activating Factor, STAT Signal Transducer and Activator of Transcription, TCR T-Zell Rezeptor, TNF Tumor Nekrose Faktor (nach [7]).
• Abb. 10: Studiendesign und Auswahl der Neugeborenen in der Multizentrischen Allergie Studie.
• Abb. 11: Untersuchungen von Geburt bis zum siebten Lebensjahr bei den Kindern der MAS-Kohorte.
• Abb. 13: Prinzip des FRET bei Hybridisierung der Sonden mit der Zielsequenz und Anregung (nach LightCycler-Manual, Roche).
• Abb. 14: Oben: Die Abbildung zeigt schematisch das Prinzip der Mutationsanalyse mit einer Wildtyp-spezifischen Sonde. Unten: Die HNMT-(C314T)-Genotypisierung zeigt beispielhaft wie das Hybrid aus Sonde und untersuchtem Amplikon durch die „fehlerhafte“ Anlagerung nur einer Base instabiler wird und seine Schmelztemperatur dadurch um einige Grad Celsius niedriger liegt.
• Abb. 15: Darstellung der mittleren Differenzen der Gesamt-IgE Serumkonzentrationen der Kinder der MAS-Population für die verschiedenen Genotypen des IL13-(Arg130Gln)-SNP in Abhängigkeit vom Lebensalter. Oben für das männliche, unten für das weibliche Geschlecht.
• Abb. 16: Darstellung der mittleren Differenzen der Gesamt-IgE Serumkonzentrationen der Kinder der MAS-Population für die verschiedenen Genotypen des IL13-C-1055T-SNP in Abhängigkeit vom Lebensalter. Oben für das männliche, unten für das weibliche Geschlecht.
• Abb. 17: Bei Kindern der MAS-Population ohne Tabakrauchexposition (NR) zeigte der Genotyp –1055 TT signifikant höhere Gesamt-IgE Werte verglichen mit ihren Referenzgenotypen –1055 CC/CT. Mütterliches Rauchen (R) verstärkte diesen Effekt signifikant in der Gruppe der Kinder, die homozygot für das (T-1055)-Allel waren.
• Abb. 18: Darstellung der PC₂₀FEV₁-Werte in Abhängigkeit des HNMT-Genotyps in der MAS-Kohorte, bei den MAS-Asthmatikern und den Freiburger Asthmatikern.