[Seite 1↓]

1  Einleitung

1.1 Epidemiologie allergischer Erkrankungen

Die Prävalenz von Asthma, atopischer Dermatitis und allergischer Rhinitis ist in den westlichen Industrienationen innerhalb der letzten Jahrzehnte stark angestiegen. Inzwischen sind atopische Erkrankungen dort die häufigsten chronischen Erkrankungen im Kindesalter geworden. So leiden beispielsweise rund 10% der Jugendlichen unter Asthma. Allein in den USA sind 10-15 Millionen Menschen Asthmatiker. Die direkten und indirekten Gesundheitskosten allein des Asthma bronchiale werden in Deutschland auf 3 Milliarden Euro pro Jahr geschätzt [1].

Die Pathogenese atopischer Erkrankungen wird von vielen Einflussfaktoren bestimmt. Als umweltbedingte Risikofaktoren, die die Entstehung allergischer Erkrankungen und deren Zunahme erklären könnten, kommen Allergenexposition, Ernährung und mangelnde Exposition mit Infektionserregern in Betracht [2, 3, 4]. Andererseits weisen zahlreiche Studien –insbesondere der Vergleich von mono- und dizygoten Zwillingspaaren– auf eine starke genetische Komponente bei atopischen Erkrankungen hin [5].

1.2 Genetik

1.2.1 Komplexe genetische Merkmale

Asthma und Atopie sind komplexe genetische Merkmale. Charakteristisch für komplexe genetische Merkmale ist, dass diese nicht den klassischen Mendel’schen (rezessiven bzw. dominanten) Erbgängen folgen. Die genetische Analyse komplexer Erbgänge wird durch folgende Grundprobleme erschwert:


[Seite 2↓]

Inkomplette Penetranz und Phänokopie: Einige Individuen, die ein Gen erben, das für eine Krankheit prädisponiert, entwickeln diese nicht (inkomplette Penetranz), wogegen andere, die dieses prädisponierende Allel nicht erben, aufgrund von Umweltfaktoren trotzdem erkranken (Phänokopie). Daher kann der Genotyp an einem bestimmten Lokus die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer Krankheit beeinflussen, aber nicht vollständig bestimmen. Die Penetranz, also die Wahrscheinlichkeit der Erkrankung bei einem prädisponierenden Genotyp, kann auch von nichtgenetischen Faktoren wie Alter und Umwelteinflüssen abhängen.

Genetische Heterogenität: Mutationen in unterschiedlichen Genen können identische Phänotypen zur Folge haben, wenn die Gene beispielsweise für einen gängigen biochemischen Stoffwechselweg oder eine häufige zelluläre Struktur kodieren. So können ein und derselben Krankheit verschiedene Gendefekte zu Grunde liegen.

Polygene Vererbung: Mutationen in mehreren verschiedenen Genen müssen gleichzeitig vorliegen/vererbt werden, um die Krankheit auszulösen.

1.2.2 Methodik genetischer Untersuchungen

1.2.2.1 Zwillingsstudien

Zwillingsstudien bieten die Möglichkeit, die genetische Komponente einer Krankheit relativ isoliert von den Umwelteinflüssen zu bewerten. Eineiige Zwillinge sind genetisch identisch und besitzen daher exakt die gleichen Erbanlagen. Zweieiige Zwillinge stimmen in 50 % ihrer Gene überein. Sowohl eineiige als auch zweieiige Zwillinge sind in der Regel den gleichen Umwelteinflüssen und dem gleichen Lebensstil innerhalb ihrer Familie ausgesetzt. Der Vergleich von mono- und dizygoten Zwillingen hinsichtlich komplexer Krankheitsbilder erlaubt daher die genetische Komponente eines [Seite 3↓]Krankheitsbildes abzuschätzen. Ergebnisse von Zwillingsstudien lassen den Schluss zu, dass eine starke genetische Komponente atopischen Erkrankungen zu Grunde liegt [5]. So schätzt eine Studie mit 11.688 dänischen Zwillingspaaren den Anteil genetischer Faktoren hinsichtlich der Suszeptibilität für Asthma bronchiale auf 73% [6].

1.2.2.2 Kopplungsstudien

Kopplungsstudien dienen der Lokalisation krankheitsverursachender Gene. Hierfür werden sogenannte Mikrosatellitenmarker, STRP (short tandem repeat polymorphisms) eingesetzt (siehe Abb. 1). Diese STRPs enthalten eine unterschiedliche Anzahl von Di-, Tri- oder Tetranukleotid-Wiederholungen. Sie sind in dichter Folge über das gesamte Genom verteilt und ihre Funktion ist bis heute unbekannt.

Abb. 1: Links sind schematisch unterschiedlich lange polymorphe Bereiche (STRP) in den Allelen der Eltern dargestellt. Die unterschiedliche Länge der PCR-Produkte kommt ausschließlich durch die polymorphen Dinukleotid-Wiederholungen zustande. Nach elektrophoretischer Auftrennung der PCR-Produkte (rechts) ergeben sich individuelle Bandenmuster. Sind (zahlreiche) betroffene Geschwister (hier z.B. Kind 1 und 2) an diesem Locus genetisch identisch („allele sharing“) spricht dies für eine Kopplung des Markers mit dem entsprechenden Krankheitsgen.


[Seite 4↓]

1.2.2.3  „Allele-sharing” Methoden

„Allel-sharing“-Methoden testen, wie häufig Allele eines genetischen Markers oder eines bestimmten chromosomalen Abschnittes mit verschiedenen genetischen Varianten (Haplotypen) bei betroffenen (kranken) Verwandten gemeinsam auftreten. Sind Verwandte häufiger als es die Zufallsverteilung erwarten ließe für einen polymorphen Marker bzw. einen Haplotyp genetisch identisch, ist dies ein Hinweis darauf, dass dieser Marker mit dem krankheitsverursachenden Gen gekoppelt vererbt wird, d.h. in der Nähe des Markers lokalisiert sein muss. Die Wahrscheinlichkeit einer gekoppelten Vererbung verhält sich umgekehrt proportional zu dem Abstand im Genom. Stimmen zwei Verwandte in einem bestimmten Gen einer chromosomalen Region überein, spricht man von identical-by-descent (IBD), das heißt, genau dieses Gen wurde von einem gemeinsamen Vorfahren vererbt. Ist das krankheitsverursachende Gen nicht bekannt, kann mit genetischen Markern eine chromosomale Region untersucht werden. Dabei kann nur darüber eine Aussage getroffen werden, ob Verwandte in für diesen Marker übereinstimmen, was identical-by-state (IBS) genannt wird. Je dichter die genetischen Marker liegen, desto genauer ist es möglich, von IBS auf IBD zu schließen.

Bei der Untersuchung komplexer genetischer Krankheitsbilder wird meist die „Betroffene-Geschwisterpaar“-Analyse, eingesetzt, die einfachste Form der IBD-Statistik. Geschwister sind zu 50% genetisch identisch, da sie je die Hälfte der Gene von Vater und Mutter erben. Bei der „Betroffene-Geschwisterpaar“-Analyse untersucht man nun Geschwister und analysiert, in welcher chromosomalen Region Paare zu signifikant mehr als 50% genetisch identisch sind. Beide Eltern werden ebenfalls genotypisiert, um einerseits die Vaterschaft zu sichern und um andererseits zu testen, von welchem Elternteil die chromosomalen Abschnitte vererbt wurden. Bei diesem Studientyp kann die Abweichung von der zufälligen Vererbung mit einem einfachen χ2-Test ermittelt werden.


[Seite 5↓]

Abb. 2: „Betroffene Geschwisterpaar“-Studie: Mit Hilfe von Mikrosatellitenmarkern wird getestet, inwieweit erkrankte Geschwister an bestimmten Genorten genetisch identisch sind (identical-by-descent). Sind dies signifikant mehr als 50% der untersuchten Paare, deutet dies auf eine Kopplung des eingesetzten Markers mit dem Krankheitsbild hin.

1.2.2.4  Der Transmissions-Disäquilibrium-Test (TDT)

Jedes väterliche oder mütterliche Allel wird mit einer Wahrscheinlichkeit von 50% an Nachkommen vererbt. Der TDT untersucht, ob signifikante Abweichungen von dieser Verteilung auftreten. Dazu werden betroffene Individuen und beide Eltern (Trios) auf das Vorkommen polymorpher genetischer Marker oder auch single nucleotide polymorphisms (SNPs) analysiert. Vererben heterozygote Eltern einen bestimmten Marker/SNP signifikant häufiger als 50% auf kranke Kinder, so weist dies auf eine Kopplung und Assoziation des vermehrt transmittierten Allels mit dem Krankheitsgen bzw. der Erkrankung hin. Positive Ergebnisse bei Anwendung des TDT sind jedoch nur dann zu erwarten, wenn sich der eingesetzte Marker in unmittelbarer Nähe des Krankheitsgens bzw. im Krankheitsgen selbst befindet. Beträgt der Abstand mehr als ein centiMorgan (cM), was etwa 106 Basenpaaren entspricht, kann eine Kopplung/Assoziation durch den TDT kaum noch nachgewiesen werden.


[Seite 6↓]

Abb. 3: Transmissions-Disäquilibrium-Test: Betroffene Kinder und deren Eltern (unabhängig ob betroffen oder nicht) werden untersucht. Wird ein Allel von heterozygoten Eltern signifikant häufiger als 50% an betroffene Kinder vererbt, deutet dies auf einen Zusammenhang zwischen diesem Marker und der Krankheit hin.

1.2.2.5 Assoziationsstudien

Sind Polymorphismen in einem Kandidatengen bekannt, so können Fall-Kontroll-Studien eingesetzt werden. Dabei werden die Allelfrequenzen in betroffenen versus nicht betroffenen Individuen verglichen. Bei komplexen Krankheitsbildern bedarf es einer sorgfältig ausgewählten Kontrollpopulation, die sich idealerweise nur in dem zu untersuchenden Merkmal von der betroffenen Population unterscheidet.

Abb. 4: Assoziationsstudie: Betroffene Individuen werden mit nicht betroffenen Individuen verglichen. Dieses Studiendesign bietet sich an, wenn Polymorphismen in Kandidatengenen identifiziert wurden und diese auf eine mögliche Assoziation mit der Krankheit getestet werden sollen.


[Seite 7↓]

1.2.3  Genomweite Suchen

Ist es unklar, wo sich krankheitsverursachende Gene im Genom befinden, können STRPs in regelmäßigen Abständen über das gesamte Genom verteilt eingesetzt werden. Meist werden betroffene Geschwisterpaare untersucht (siehe auch 1.2.2.3). Chromosomale Regionen, die auf eine Kopplung mit dem untersuchten Krankheitsbild hinweisen, werden anschließend beim sogenannten „fine mapping“ mit enger beieinanderliegenden Markern genauer untersucht. So wird eine Kandidatenregion, die mit der Krankheit in Verbindung stehen könnte, immer enger eingegrenzt (Positionelle Klonierung).

1.2.4 Kopplungsstudien in Kandidatengenregionen

Diese Studien widmen sich gezielt Regionen, in denen Gene lokalisiert sind, die durch ihre biologische Funktion für die Krankheitsentstehung oder -ausprägung von Bedeutung sein könnten. Im Gegensatz zu genomweiten Suchen ist also eine a priori Hypothese erforderlich. Mehrere STRPs werden nach ihrer Lokalisation in diesen Regionen ausgewählt und auf Kopplung (meist in „betroffenen Geschwisterpaaren“ oder mittels TDT) untersucht.

Die Genotypisierung von SNPs in Kandidatengenen (siehe 1.2.5) kann ebenfalls für Kopplungsanalysen herangezogen werden, wobei diese biallelischen Marker weit weniger informativ als hochpolymorphe STRPs sind.

Die ständig steigende Zahl chromosomaler Regionen, die in genomweiten Suchen und Analysen von Kandidatengenregionen in Zusammenhang mit atopischen Erkrankungen gebracht werden, verdeutlicht die Komplexität der genetischen Grundlage. Folgende chromosomale Regionen zeigten in mehreren Studien einen Hinweis auf Kopplung mit Atopie-assoziierten Phänotypen: 5q23-33, 6q21-23, 11q13, 12q14-24 und 13q11-32 [7].


[Seite 8↓]

1.2.5  Kandidatengenstudien

An Kopplungsstudien schließen sich meist Kandidatengenanalysen an, d.h. die Suche nach Varianten der DNA-Sequenz in Genen bzw. deren regulatorischen Elemente. Allelfrequenzen werden dann in Populationen mit definierten Phänotypen analysiert und mit nicht betroffenen Individuen verglichen. Mittels genetischer Varianten lassen sich z.B. bei betroffenen Geschwisterpaaren auch Kopplungsstudien durchführen.

1.2.6 Funktionelle Studien

Da SNPs häufig sind (ca. 1 SNP auf 1000 bp), ist es von Bedeutung, funktionelle Unterschiede einer identifizierten genetischen Variante (zumindest in vitro) nachzuweisen.

1.3 Immunologie der allergischen Reaktion

1.3.1 Die Rolle der T-Zellen

Die Entzündungsreaktion bei allergischem Asthma geht einher mit der Einwanderung von hauptsächlich CD4-positiven aktivierten T-Lymphozyten in den Entzündungsort. Sie übernehmen eine zentrale regulatorische Rolle im allergischen Geschehen. Die Aufgabe der T-Zellen besteht in der Unterscheidung zwischen harmlosen und gefährlichen Antigenen. Jede einzelne T-Zelle trägt ihren spezifischen T-Zellrezeptor. Bei allergischen Erkrankungen reagieren die T-Zellen auf harmlose Umweltantigene wie Tierhaare oder Pollen nicht mit Toleranz, sondern einer fehlgeleiteten T-Zellantwort, woraus sich die typische Entzündungsreaktion ergibt.

1.3.1.1 T-Helferzellen vom Typ1 und Typ2 und deren Zytokine

Verschiedene Subpopulationen von T-Zellen, die sich über die von ihnen sezernierten Zytokine definieren, übernehmen unterschiedliche Aufgaben bei der Infektabwehr im Körper. T-Helferzellen vom Typ 2 (TH2) sezernieren [Seite 9↓]hauptsächlich IL-4, IL-13, IL-5, IL-6, IL-9 und IL-10, wogegen TH1-Zellen IL-2, INF-γ und TNF-β ausschütten. Die TH1-Zellen vermitteln u.a. eine zelluläre Immunantwort bei der Infektabwehr von Bakterien und Viren. TH2-Zellen sind für die Immunantwort im Rahmen parasitärer Erkrankungen unabdingbar.

Eine ruhende T-Zelle wird durch eine Antigenpräsentierende Zelle (APC), z.B. einen Makrophagen, stimuliert (siehe auch Abb. 9). Erkennt eine APC ein Antigen bzw. Allergen über seine oberflächenständigen Immunglobuline, wird dieses aufgenommen, prozessiert und ein allergenspezifisches Peptid an der Oberfläche der APC über ein major histokompatibility complex (MHC)-Molekül der Klasse 2 präsentiert. Zusätzlich schüttet die APC lösliche Botenstoffe aus, die die Polarisierung der naiven T-Zelle in Richtung TH1- oder TH2-Effektorzelle steuern. Die verschiedenen T-Zell-Populationen inhibieren sich gegenseitig. So bewirkt eine aktive TH1-Immunantwort eine Unterdrückung der TH2-Immunität und umgekehrt. Eine TH2-Polarisation am Ort der allergischen Entzündung ist in vielen Studien nachgewiesen worden.

1.3.2  Funktionen der Zytokine IL-4 und IL-13

Bei der TH2-Immunantwort spielen die Interleukine IL-4 und IL-13 auf Grund folgender Funktionen eine tragende Rolle:

Aspekte und Wirkungen des Zytokins IL-13 [10]:

1.3.3 Der Einfluss von IL-4 und IL-13 auf die IgE-Produktion

Neben der Interaktion der Membranmoleküle CD40L bei der aktivierten T-Zelle und CD40 bei der aktivierten B-Zelle, welche den Immunglobulin-Klassenwechsel einleiten [11], ist die Präsenz von IL-4 und IL-13 wesentlich: Beide Zytokine fördern die IgE-Produktion, während IL-12 und Interferon-γ hemmend wirken. Die Dominanz der TH2-Zellen, deren Leitzytokin das IL-4 ist, ist somit ein wichtiges Charakteristikum der Ausbildung einer Reaktion vom Soforttyp.

IL-13 wird ebenfalls von TH2-Zellen gebildet und hat ähnliche Wirkungen wie IL-4, allerdings tragen T-Zellen keinen IL-13 Rezeptor, so dass dieses Zytokin hauptsächlich auf B-Zellen wirkt, wo IL-13 z.B. die IgE-Produktion anregt [9]. Beide Zytokine regulieren die Chemokinproduktion (Eotaxin) 13, die Aktivierung von Mastzellen und Eosinophilen sowie die Inhibition von proinflammatorischer Genexpression (IL-1, Tumornekrosefaktor, IL-6) 10.


[Seite 11↓]

Diese Überlappung der Funktionalität von IL-4 und IL-13 kann durch die gemeinsame Nutzung einer Rezeptorkette ihres jeweiligen Rezeptorkomplexes erklärt werden [8].

1.3.4 Aufbau und Wirkungen des IL-4- bzw. des IL-13-Rezeptors

Der IL-4 Rezeptor (IL-4R), der hauptsächlich auf Zellen der Hämatopoiese exprimiert wird, besteht aus einer γ-Kette und einer α-Kette (IL-4Rα). Der IL-13 Rezeptor stellt ein Heterodimer aus der gleichen IL-4Rα-Kette und einer IL-13Rα1 Kette dar. IL-4 kann an beide Rezeptortypen binden, wogegen IL-13 nur am IL-13 Rezeptor wirken kann. Binden die Zytokine an diese Rezeptoren werden intrazellulär Januskinasen (JAK1 oder JAK3) aktiviert, die wiederum das signal-transduction-and-transactivation-(STAT)-Molekül 6 phosphorylieren. Die phosphorylierten STAT6 dimerisieren und binden im Kern der Lymphozyten an spezifische Konsensussequenzen innerhalb der Promoterregionen von Genen, die durch IL-4 und IL-13 reguliert werden. Die gemeinsame Nutzung der IL-4Rα-Kette und des IL-13Rα1 Rezeptorkomplexes erklärt viele der ähnlichen Wirkungen dieser Zytokine.


[Seite 12↓]

Abb. 5: Schematische Darstellung der IL-4 und IL-13 Signalkaskade über den IL-4 Rezeptor und den IL-13 Rezeptor. IL-4 bindet über die IL-4Rα-Kette an beiden Rezeptoren, wogegen IL-13 nur an der IL-13Rα1-Kette wirksam werden kann. Der IL-4 Rezeptor wird auf B- und T-Zellen exprimiert, der IL-13-Rezeptor nur auf B-Zellen. Beide Rezeptortypen aktivieren STAT6, das wiederum T-Helfer-Zellen befähigt, ihre TH2-Eigenschaften zu bewahren und B-Zellen zur Ig-E-Produktion anregt (nach [14]).

1.3.5 Die Gene IL4, IL13 und IL4RA

1.3.5.1 Kopplungsstudien

Genomweite Suchen als auch Analysen in Kandidatengenregionen ergaben wiederholt Hinweise auf eine Kopplung von Asthma beziehungsweise Asthma-assoziierter Merkmale (hohe Gesamt- und spezifische IgE-Konzentration, BHR, Eosinophilen-Konzentration im Blut) mit Chromosom 5q31-33 [15, 16, 17, 18, 19]. Hier sind Gene lokalisiert, die für Zytokine der TH2-Zellen kodieren (siehe Abb. 6). Marsh et al. beschrieben 1994 erstmals eine Kopplung von genetischen Markern auf Chromosom 5q31 mit Gesamt-IgE Werten. Bei den [Seite 13↓]untersuchten Pennsylvania Armish waren die signifikantesten Ergebnisse für einen Marker innerhalb des IL4-Gens zu beobachten. Interessanterweise waren die Kopplungsergebnisse hinsichtlich des Gesamt-IgE bei Nicht-Atopikern dieser homogenen Population am signifikantesten. Dies deutet darauf hin, dass ein Gen bzw. eine genetische Variante in dieser chromosomalen Region die unspezifische („non-cognate“) IgE Regulation moduliert [19]. IL4 und IL13 sind auf Grund der unter Absatz 1.3.2 aufgeführten Funktionen interessante Kandidatengene hinsichtlich der Serum-IgE Regulation.

Abb. 6: Schematische Dar-stellung des Interleukin-Clusters auf Chromosom 5. Der lange Arm wird mit q bezeichnet der kurze mit p. Die Zahlen entsprechen Banden, welche in der Metaphasenfärbung sichtbar sind (nicht maßstabsgetreu wiedergegeben).

Eine Kopplung wurde auch zwischen Atopie und Markern gefunden, die das IL4RA-Gen auf Chromosom 16p12 flankieren [20].

1.3.5.2  Kandidatengenstudien

IL4:Fünf genetische Varianten sind im Promotor des IL4-Gens bekannt, von denen vier allerdings sehr selten auftreten [20]. Eine Assoziation eines Cytosin zu Tyrosin Austausches an Position –590 mit hohen IgE-Werten wurde von Rosenwasser beschrieben [21], konnte jedoch bisher nicht bestätigt werden.


[Seite 14↓]

IL13:Graves et al. identifizierten 7 SNPs im IL13-Gen. (siehe Abb. 7). Die Variante in Exon 4 (Arg130Gln) wurde zeitgleich von 2 weiteren Arbeitsgruppen beschrieben [22, 23]. Diese Variante wurde in kaukasischen Populationen mit Gesamt-IgE-Werten [22, 24] sowie Asthma [23] assoziiert. Graves et al. beobachteten, ähnlich wie Marsh et al. zuvor, dass die Assoziation des Exon 4-SNP bei Nicht-Atopikern am signifikantesten war.

Heinzmann et al. zeigten mittels computergestützter molekularer Modellanalysen, dass der Austausch an Position 130 die Konfiguration des Rezeptors an der Ligandenbindungsstelle verändert. Dies impliziert eine Funktionalität des SNP.

Van der Pouw et al. wiesen in einer niederländischen Population eine signifikante Assoziation des IL13-C-1055T-Promotor-SNP mit Asthma nach.

Abb. 7: Schematische Darstellung der Polymorphismen innerhalb des IL13-Gens. Der Promotor-SNP an der Position –1112 entspricht C-1055T, der SNP an der Position 2044 resultiert in dem Aminosäureaustausch Arg130Gln (nach Graves et al. 2000).

IL4RA:Insgesamt sind sieben Polymorphismen im IL4RA-Gen bekannt, die mit einem Aminosäureaustausch einhergehen. Hershey et al. (1997) beschrieben eine Assoziation des Arg551Gln-Polymorphismus mit Hyper-IgE-Syndrom, atopischer Dermatitis und Atopie [25]. IL4RA-Haplotypanalysen in Hutterites identifizierten diesen Genort als Suszeptibilitätslokus für Asthma [16]. Diese Beobachtungen konnten jedoch bisher nicht bestätigt werden. Mitsuyasu [Seite 15↓]et al. beschrieben eine signifikante Assoziation zwischen der Ile50 Variante des Rezeptors und Asthma sowie hohen IgE-Werten.

Schwerpunkt dieser Dissertation war die Genotypisierung der o.g. Varianten im IL4- IL13- und IL4RA-Gen in einer großen deutschen Geburtskohorte, um den Effekt dieser Varianten auf das Gesamt-IgE zu verschiedenen Zeitpunkten zu untersuchen.

Tab. 1: Untersuchte Polymorphismen im IL4-, IL13- und IL4RA-Gen. Die unterschiedliche Nomenklatur der SNPs ist u.a. durch verschiedene Genbank-Referenzen zu erklären. Zur pathophysiologischen Bedeutung dieser Gene siehe auch Abb. 9: Die Darstellung zeigt schematisch den Pathomechanismus atopischer Krankheiten. Abkürzungen: CC16 Clara Cell Protein 16, CD Cluster of Differentiation, FceR1-b FC-e Rezeptor 1b (IgE-Rezeptor), GSTP1 Glutathion-S-Transferase 1, HLA Human Leukocyte Antigen, IFN-g Interferon-g, IRF-1 Interferon Regulatory Factor 1, 5-LO 5-Lipoxygenase, LT Lymphotoxin, LTC4 Leukotrien C4 Synthase, PAF Platelet Activating Factor, STAT Signal Transducer and Activator of Transcription, TCR T-Zell Rezeptor, TNF Tumor Nekrose Faktor (nach [7]).

Während IL4- und IL13-Varianten aufgrund der aufgeführten Funktionen und bisherigen Ergebnisse am ehesten bei der Regulation von Gesamt-IgE eine Rolle spielen, sind andere Gene aufgrund ihrer Funktion und ihres [Seite 16↓]Expressionsmusters eher für allergische Atemwegserkrankungen von Bedeutung. Varianten in zwei Genen, welche eine Suszeptibilität für Asthma oder eine BHR bewirken könnten, wurden zusätzlich im Rahmen dieser Arbeit untersucht.

1.3.6 Der Komplementfaktor C5a und sein Rezeptor C5aR

1.3.6.1 Biologische Funktion des Komplementfaktors C5a

Das Komplementsystem umfasst eine Reihe von Plasmaproteinen, die eine Rolle bei Abwehr und Entzündung spielen. Durch Konvertasen wird der Komplementfaktor C5 über den klassischen oder alternativen Weg durch Abtrennen der Alpha-Kette in die Faktoren C5a und C5b zerlegt. Die Reaktionen des Komplementsystems werden in der Regel von Molekülen auf der Oberfläche eines eingedrungenen Mikroorganismus ausgelöst.

Abb. 8: Schematische Darstellung des klassischen und alternativen Weges der Komplementaktivierung und die Wirkungen der Komplementkomponenten.

Die Faktoren C1 bis C9 sind Glieder des sogenannten klassischen Weges der Komplementaktivierung, die Faktoren B und D bilden die reaktiven Komponenten des alternativen Weges. Der klassische Weg wird ausgelöst durch die Bindung des Faktors C1 an mehrere IgG oder ein pentameres IgM auf der Oberfläche eines Mikroorganismus, der alternative Weg durch Bindung [Seite 17↓]des Faktors B z.B. an ein bakterielles Lipopolysaccharid (Endotoxin). Das Spaltprodukt C5a ist ein 11kD Glykopeptid, das im Verlauf einiger entzündlicher Prozesse wie bakterieller Sepsis, Trauma, Bildung von Immunkomplexen und akutem „Respiratory-Distress-Syndrom“ entsteht. C5a vermittelt folgende Prozesse [26]:

1.3.6.2 Der Rezeptor des Komplementfaktors C5aR

Die entzündliche Reaktion des C5 wird durch einen spezifischen Rezeptor (C5aR) vermittelt, der zur Familie der G-Protein gekoppelten 7-Helix- Rezeptoren gehört [27]. C5aR wird von Makrophagen, Neutrophilen, Eosinophilen, Basophilen und Mastzellen [27, 28, 29], sowie glatten Muskelzellen von Gefäßen und Bronchien exprimiert [30, 31, 32]. Dieses Expressionsmuster unterstreicht die funktionelle Bedeutung von C5aR bei der Immunantwort und im Rahmen von Atemwegsentzündungen.

1.3.6.3 Hinweise auf immunmodulatorische Funktion des Komplementfaktors C5a

C5a induziert die Produktion und Ausschüttung von zahlreichen proinflammatorischen Zytokinen wie TNF-α, IL-1 und IL-6. Jüngste Studien zeigten, dass Komplementkomponenten eine modulierende Schlüsselverbindung zwischen angeborenen (Komplementsystem) und spezifischen Immunantworten (T-Zell-Antwort) darstellen könnten. Ein Beispiel für diesen Zusammenhang ist die zentrale Rolle, die C3 bei der Unterscheidung zwischen harmlosen und gefährlichen Antigenen spielt [33]. Krug et al. [Seite 18↓]berichteten über erhöhte Produktion von C5a in der bronchoalveolären Lavage (BAL) von Asthmatikern 24 Stunden nach einer Allergenprovokation [34]. Ein weiterer Hinweis auf die Rolle von Anaphylatoxinen bei allergischen Erkrankungen ist die Beobachtung, dass C5a die IgE vermittelte Histaminausschüttung aus Basophilen bei Patienten mit chronischer Urtikaria verstärkt [35].

1.3.6.4 Bronchiale Hyperreagibilität im Mausmodell und der Komplementfaktor C5

Die Arbeitsgruppe um Karp konnte in einem Mausmodell Komplementfaktor 5 als Risikofaktor für die Ausbildung von allergischem Asthma identifizieren [34]. Weiterhin verglich diese Arbeitsgruppe rekombinante Maus-Stämme mit jeweils hoher bzw. niedriger bronchialer Hyperreagibilität gegenüber Metacholin (C3H/HeJ und A/J) und konnte unterschiedliche Expressionsmuster von C5 in den Lungen nach der Provokation zeigen [36]. Bei Bindung an den C5a-Rezeptor auf Makrophagen wurde eine verminderte IL-12 Produktion festgestellt. Da eine IL-12-Gabe die Ausbildung des experimentellen Asthmas in Mäusen verhindern konnte bzw. dessen Schweregrad verringern konnte, war ein möglicher Mechanismus gefunden, wie der Komplementfaktor C5 die Anfälligkeit für Asthma beeinflusst. Ein SNP im C5 Gen führt zu funktionell verändertem C5, was wiederum eine Dysregulation der IL-12 Produktion (des Leitzytokins der TH1-Immunantwort) bewirkt. Verminderte IL-12 Produktion aber prädisponiert zu einer TH2-Immunantwort, die der allergischen Reaktion zu Grunde liegt.

Die mögliche Rolle von C5 innerhalb des Pathomechanismus von Asthma beim Menschen wird auch durch die Tatsache wahrscheinlich, dass Patienten mit allergischem Asthma eine verringerte IL-12 Produktion sowohl in der Lunge als auch systemisch aufweisen [37, 38].


[Seite 19↓]

1.3.6.5  Zusammenhang zwischen einer C5aR-Variante und Asthma

Das Gen, das für C5aR codiert, liegt in der Region 19q13.3-q13.4 [39, 40], einem Genort, der durch Kopplungsstudien mehrfach in Zusammenhang mit Asthma gebracht wurde [41, 42, 43, 44]. Dieses Gen wurde daraufhin von uns mittels Sequenzierung auf SNPs untersucht (Barnes, 2004). C5aR besteht aus zwei Exons, die durch ein 1000 bp Intron getrennt liegen. Die Promotorregion liegt rund 300 bp vor dem Exon 1 [39]. In dieser Arbeit wurde ein SNP in der Promotorregion von C5aR untersucht (C-245T). Diese Variante wurde als Teil dieser Dissertation in zwei Populationen (MAS- und Barbados-Population) typisiert, um eine mögliche Assoziation mit Asthma bronchiale oder BHR aufzudecken.


[Seite 20↓]

1.3.7  Histamin-N-Methyltransferase (HNMT)

1.3.7.1 Biologische Funktion

Histamin ist ein wichtiger präformierter Mediator der allergischen Reaktion. Ausgeschüttet von Mastzellen und Basophilen nach Kreuzvernetzung ihrer oberflächenständigen IgE-Antikörper durch Allergen, wirkt Histamin in der menschlichen Lunge als potenter Bronchokonstriktor (siehe auch Abb. 9). Histamin spielt des Weiteren eine Rolle bei der Regulation der Magensäuresekretion [45] und ist selbst Neurotransmitter im Gehirn [46]. Es existieren zwei Abbauwege für Histamin in unwirksame Metabolite: Die oxidative Deaminierung durch die Diaminoxidase (EC 1.4.3.6) und die N-Methylierung, katalysiert durch das zytosolische Enzym Histamin-N-Methyl-Transferase (HNMT, EC 2.1.1.8). Die N-Methylierung ist der Hauptstoffwechselweg des Histamins in der Bronchialschleimhaut [47].

1.3.7.2 Funktioneller SNP im HNMT-Gen

Seit einiger Zeit ist eine funktionelle genetische Variante im Exon 4 des HNMT-Gens (Chromosom 1p32) bekannt: Der Austausch von Cytosin an Position 314 durch Thymidin führt im translatierten Enzym zu einem Aminosäureaustausch von Threonin zu Isoleucin (an der Position 105 des Proteins). Daraus resultiert eine Konformationsänderung, die wiederum eine signifikante Aktivitätsminderung des Enzyms bewirkt [48]. Höhere Histaminkonzentrationen in der Bronchialschleimhaut von Individuen mit diesem SNP könnten daher deren Anfälligkeit für Asthma bzw. das Ausmaß der BHR steigern. Eine Assoziation dieser Variante mit Asthma bronchiale wurde von Yan et al. in einer kaukasischen Kohorte (n=192) beschrieben [49].


[Seite 21↓]

1.4  Allergische Erkrankungen

1.4.1 Definition von Allergie und Atopie

Unter Allergie versteht man eine überschießende, krankmachende spezifische Immunantwort (Hyperergie) gegen exogene, in der Regel harmlose Substanzen (Allergene). Bei einem ersten Kontakt mit einem potentiellen Allergen kann es zur Sensibilisierung des Organismus kommen, zunächst jedoch noch nicht zu klinischen Symptomen. Erst bei erneuter Allergenexposition tritt dann die allergische Reaktion auf. Der Begriff Atopie steht für eine vererbbare Neigung Typ-I-Allergien gegen Inhalations- und Nahrungsmittelallergene zu entwickeln. Atopie schließt die atopische Dermatitis, die allergische Rhinitis und das Asthma bronchiale ein.

1.4.2 Asthma bronchiale und bronchiale Hyperreagibilität

1.4.2.1 Epidemiologie

Die Prävalenz von Asthma ist, wie die aller allergischen Erkrankungen, in den letzten Jahrzehnten dramatisch gestiegen. Atopische Erkrankungen sind zu den häufigsten chronischen Erkrankungen im Kindesalter geworden. Bis zu 10% der Jugendlichen und 5% der Erwachsenen entwickeln ein Asthma bronchiale, was ungefähr 7% der bundesdeutschen Bevölkerung entspricht. Rund 6 Millionen Menschen sind in Deutschland und etwa 10-15 Millionen in den USA von der Krankheit betroffen.

1.4.2.2 Klinik

Asthma ist durch die Symptomtrias

charakterisiert. Die Ausprägung der Symptome kann von milden saisonalen [Seite 22↓]Beschwerden mit chronischem Husten oder Giemen bis zu schweren Atemnotzuständen reichen. Gelegentlich kann ein persistierender, meist trockener, oft nächtlicher Husten das einzige Symptom sein. Bei manchen Kindern steht eine Überblähung der Lunge mit vergrößertem Thorax-Tiefendurchmesser und leisem Atemgeräusch (silent lung) im Vordergrund. Die Bronchokonstriktion ist meist reversibel, entweder spontan oder pharmakologisch. Häufig können auslösende Ursachen der Beschwerden identifiziert werden (siehe unter 1.4.2.3). Die bronchiale Hyper- und Dyskrinie führt zu zäh-glasigem Auswurf, der Charcot-Leyden-Kristalle (Proteinaggregate aus eosinophilen Granulozyten) und Curschmann-Spiralen (Bronchialausgüsse aus peripheren Atemwegen) enthalten kann.

1.4.2.3  Bronchiale Hyperreagibilität

Die variable Atemwegsobstruktion bei Asthma bronchiale beruht auf einer Hyperreagibilität der Bronchien. Sie ist definiert als vermehrte Bereitschaft des Bronchialsystems, bereits auf unterschwellige Reize mit einer signifikanten Bronchialobstruktion zu reagieren. Sie kann durch

erworben bzw. verstärkt werden und ist in der Regel bei Patienten mit Asthma nachweisbar. Der Schweregrad des Asthma bronchiale wird über das klinische Bild (Anfallshäufigkeit und Ausprägung) sowie durch die Lungenfunktionsanalyse beurteilt.


[Seite 23↓]

1.4.2.3.1  Lungenfunktionstests: Unspezifische bronchiale Provokation

Es existieren mehrere Verfahren eine BHR zu testen.

1. Pharmakologische Provokation:

Am häufigsten werden pharmakologische Testverfahren mit Parasympathomimetika wie Acetylcholin, Carbachol oder Metacholin eingesetzt. Alternativ stehen Mediatoren wie Histamin oder PAF sowie hyper- oder hypoosmolare Kochsalzlösungen als unspezifische Reizsubstanzen zur Verfügung. Die Provokationssubstanz wird konsekutiv in steigender Dosis aerosolisiert und vom Patienten inhaliert, bis entweder eine signifikante Bronchialobstruktion anhand des Abfalls der forcierten Einsekundenkapazität um 20% nachgewiesen wird, oder die substanzspezifische Maximaldosis erreicht ist.

2. Physikalische Provokation

Eine weitere Möglichkeit der unspezifischen bronchialen Provokation besteht in der Applikation von Kältereizen oder einer Hyperventilation. Körperliche Belastung auf dem Fahrradergometer oder Laufband werden zum Nachweis einer belastungsinduzierten asthmatischen Reaktion oder BHR genutzt.

Quantifizierung der Bronchialobstruktion

1. Ganzkörperplethysmographie

Bei dieser Untersuchung sitzt der Patient in einer luftdicht verschlossenen Kammer von rund 1m3 Rauminhalt, so dass seine Atemexkursionen zu Druckschwankungen in der Kammer führen. Gleichzeitig wird der Atemluftstrom durch einen Pneumotachographen gemessen. Dabei atmet der Patient durch ein Rohr mit definiertem Widerstand. Der Druckabfall an diesem Widerstand ist dem Atemluftstrom direkt proportional. Aus Fluss- und Druckänderungen wird ein Druck-Strömungsdiagramm erstellt. Diese Untersuchung erlaubt die Messung des Atemwegswiderstandes bei Ruheatmung.

[Seite 24↓]2. Spirometrie

Bei der Spirometrie wird mit einem Pneumotachograph das nach maximaler Inspiration in der ersten Sekunde bei maximaler Anstrengung ausatembare Volumen bestimmt. Dieser Wert, die sogenannte forcierte Einsekundenkapazität FEV1, ist um so geringer, je stärker die Bronchialobstruktion ist. Ein typisches positives Testergebnis beispielsweise einer Histaminprovokation äußert sich als Anstieg des ganzkörperplethysmographisch gemessenen Atemwegswiderstandes und als Abfall des spirometrisch gemessenen FEV1. Bestimmt wird meist die Provokationskonzentration, bei der der FEV1-Wert um 20% abfällt, PC20FEV1.

1.4.2.4 Pathophysiologie

Die Symptome des allergischen Asthmas gehen auf eine chronische Entzündung der Bronchien mit Zellinfiltrationen, vor allem eosinophiler Granulozyten, Lymphozyten und Mastzellen zurück. Lymphozyten sind an der Induktion dieser Entzündung mit der Sekretion proinflammatorisch wirkender Signalstoffe, sogenannter Zytokine, beteiligt [50]. Mastzellen fördern durch die Sekretion gespeicherter und neu synthetisierter Mediatoren [51] sowie Zytokinen die entzündlichen Veränderungen. Aber auch Makrophagen, Neutrophile, Fibroblasten und Epithelzellen scheinen eine Rolle bei der Pathogenese des Asthma bronchiale zu spielen.

Der Atemfluss wird durch Bronchokonstriktion mit Hypertrophie der glatten Muskulatur [52, 53], submuköse ödematöse Schwellung der Schleimhaut [54], Hypersekretion der endobronchialen Drüsen und einer Viskositätszunahme des Schleims [55] beeinträchtigt. Die akute Bronchokonstriktion beim allergischen Asthma wird durch Ausschüttung von Histamin verursacht nach Kreuzvernetzung von oberflächenständigen IgE-Rezeptoren auf Mastzellen nach Allergenkontakt und folgender Degranulation [56], wie in Abb. 9 schematisch gezeigt.


[Seite 25↓]

Abb. 9: Die Darstellung zeigt schematisch den Pathomechanismus atopischer Krankheiten. Abkürzungen: CC16 Clara Cell Protein 16, CD Cluster of Differentiation, FcεR1-β FC-ε Rezeptor 1β (IgE-Rezeptor), GSTP1 Glutathion-S-Transferase 1, HLA Human Leukocyte Antigen, IFN-γ Interferon-γ, IRF-1 Interferon Regulatory Factor 1, 5-LO 5-Lipoxygenase, LT Lymphotoxin, LTC4 Leukotrien C4 Synthase, PAF Platelet Activating Factor, STAT Signal Transducer and Activator of Transcription, TCR T-Zell Rezeptor, TNF Tumor Nekrose Faktor (nach [7]).

1.4.3 Atopische Dermatitis

1.4.3.1 Definition

Die atopische Dermatitis (AD), auch atopisches Ekzem, endogenes Ekzem oder Neurodermitis genannt, ist eine chronische bzw. chronisch-rezidivierende, juckende, entzündliche Hauterkrankung. Es sind zwei Typen bekannt: Die extrinsische Form, die 80% der Erkrankten betrifft und mit einer IgE-vermittelten Sensibilisierung einhergeht, und die intrinsische Form, die 20% der Patienten betrifft.


[Seite 26↓]

1.4.3.2  Epidemiologie

Die Prävalenz der atopischen Dermatitis hat in den letzten Jahrzehnten deutlich zugenommen. 8-20% der Kinder unterschiedlicher Bevölkerungsgruppen sind inzwischen von der Krankheit betroffen [57, 58, 59]. So lag die Prävalenz bei einer epidemiologischen Untersuchung an 1000 deutschen Vorschulkindern in verschiedenen Teilen Deutschlands bei 12,9% [60].

Obwohl die atopische Dermatitis in jedem Lebensalter auftreten kann, äußert sich die Krankheit vorwiegend schon im Säuglings- und Kindesalter. 60% der Patienten erkranken im ersten Lebensjahr, 85% bis zum fünften Lebensjahr. Zwillingsstudien konnten eine genetische Disposition für die atopische Dermatitis zeigen. Die Konkordanz von monozygoten Zwillingen ist mit 75% deutlich gegenüber der von dizygoten Zwillingen (25-30%) erhöht [61]. Über 40% der Kinder mit AD entwickeln später Asthma oder eine BHR.

1.4.3.3 Klinik

Kennzeichnend für die atopische Dermatits sind unscharf begrenzte, meist infiltrierte Erytheme mit Schuppung, Papulovesikeln, nässenden, teils verkrusteten Arealen sowie häufig punkt- und strichförmige Exkoriationen. Bei chronischem Verlauf findet sich eine deutliche Lichenifikation, insbesondere im Bereich der Armbeugen und Kniekehlen. Meist besteht ein quälender Juckreiz. Die Haut der betroffenen Kinder ist meist sehr trocken.


[Seite 27↓]

Tab. 2: Klinische Merkmale der atopischen Dermatitis (nach [57]).

Major Kriterien

Minor Kriterien

Juckreiz

atopische Familienanamnese

Gesicht- und Streckseitenekzem bei Säuglingen und Kindern

Hautinfektionen

Beugeekzeme bei Erwachsenen

nicht spezifische Dermatitis der Hände und Füße

chronische oder chronisch-rezidivierende Dermatitis

erhöhte Serum IgE-Werte

 

Xerosis

 

positive Hautallergietests

 

früher Beginn der Erkrankung

1.4.3.4 Pathophysiologie

Die Pathophysiologie der extrinsischen Form der atopischen Dermatits wird von verschiedenen Faktoren bestimmt:

Immunantwort: Die meisten Patienten zeigen eine Eosinophilie im peripheren Blut und erhöhte Serum-IgE-Werte. Es findet eine Verschiebung der T-Zellantwort zu Zellen, die IL-4, IL-5 und IL-13 produzieren, statt was den Isotypen-Switch zu IgE fördert, die Expression von Adhäsionsmolekülen wie VCAM-1 begünstigt und damit die eosinophile Infiltration fördert sowie die TH1-Antwort unterdrückt [57].

Immunpathologie der Haut: Bei akuten ekzematösen Hautläsionen findet sich ein epidermales interzelluläres Ödem mit antigenpäsentierenden Zellen (Langerhans-Zellen, dendritische epidermale Entzündungszellen, Makrophagen), die IgE-Rezeptoren tragen [62] sowie eine starke Infiltration durch aktivierte CD4-T-Zellen. Die Läsionen enthalten ebenso Eosinophile, die wahrscheinlich durch Produktion von reaktiven Radikalen, proinflammatorischen Zytokinen und toxischen Proteinen zur Entzündung und Gewebsverletzung beitragen.


[Seite 28↓]

Zytokine: Die nicht betroffene Haut von Patienten mit AD enthält mehr TH2-Zellen, die mRNA für IL-4 und IL-13 produzieren [63]. In der akuten Läsion finden sich nur wenige Zellen, die Interferon-γ oder IL-12 bilden. In chronischen Läsionen dagegen wird verstärkt IL-12, IL-4, GM-CSF, und Interferon-γ gebildet, so dass ein Ablauf der Immunantwort in zwei Phasen diskutiert wird [64]. Aktivierte T-Zellen induzieren ebenso die Apoptose von Keratozyten, was zur spongiösen Umbildung bei der akuten AD führt.

Antigenpäsentierende Zellen: Die IgE-tragenden Langerhanszellen binden und internalisieren Allergene und präsentieren sie T-Zellen. Außerdem wandern sie in die Lymphknoten und stimulieren naive T-Zellen, sich zu TH-2 Zellen zu entwickeln. Die klinische Bedeutung der Langerhanszellen mit hochaffinem IgE-Rezeptor wird durch die Beobachtung gestützt, dass sich nur in ihrer Anwesenheit bei AD ekzematöse Läsionen durch Applikation von Aeroallergenen provozieren lassen [65].

Infiltration durch Entzündungszellen: IL-16, ein Lockstoff für CD4-Zellen, CC-Chemokine (RANTES), Monocyte Chemotactic Protein 4 (MCP4) und Eotaxin sind bei AD verstärkt ausgeschüttet und führen wahrscheinlich zu der Chemotaxis von Eosinophilen und TH2-Lymphozyten in der Haut. Ebenso induzieren mechanische Traumen die Ausschüttung von TNF-α und vieler anderer proinflammatorischer Zytokine durch Keratozyten [66].


[Seite 29↓]

1.4.4  Allergische Rhinokonjunktivitis (Heuschnupfen)

1.4.4.1 Definition

Die allergische Rhinitis ist eine heterogene Störung, die in der Folge einer allergischen Entzündung der oberen Atemwege nach einer Allergenexposition entsteht und trotz hoher Prävalenz oft nicht diagnostiziert wird.

1.4.4.2 Epidemiologie

Die Prävalenzen in unterschiedlichen Ländern variieren von 3% bis zu 30% [67], 58. Man schätzt, dass etwa 20-40 Millionen US-Amerikaner an der Krankheit leiden [68]. Die Häufigkeit der allergischen Rhinitis hat in den letzten Jahrzehnten stark zugenommen. Eine Studie in einer pädiatrischen Population ermittelte bei 6-Jährigen eine Prävalenz von 42% [69]. Eine finnische Studie konnte eine Verdreifachung der Prävalenz von 1977 bis 1991 zeigen [70].

1.4.4.3 Klinik

Die allergische Rhinitis ist charakterisiert durch ein oder mehrere der folgenden Symptome:

Diese Symptome sind oft mit einer allergischen Reaktion der Augen kombiniert, die mit konjunktivaler Injektion, Ödem, Tränenfluss und Juckreiz reagieren. Man unterscheidet eine saisonale Form während des Pollenflugs, den Heuschnupfen, und eine Dauerform, die mindestens während neun Monaten des Jahres auftritt. Die allergische Rhinitis ist mit vielen Komorbiditäten [Seite 30↓]assoziiert wie Sinusitis, Otitis media und Asthma [67].

1.4.4.4 Pathophysiologie

Morphologisch handelt es sich um eine allergische Entzündung der Nasenschleimhaut, die durch eine IgE-vermittelte Sofortreaktion auf körperfremde Proteine ausgelöst wird. Als Auslöser der saisonalen allergischen Rhinitis stehen vor allem Pollenallergene von Erle, Hasel, Birke, Gräsern, Roggen, Beifuss und Wegerich im Vordergrund.

Auch bei der allergischen Rhinokonjunktivitis bestimmt die Tendenz zu TH2-Immunantworten mit Expression von IL-4, IL-13 und IL-5 die Pathophysiologie der Erkrankung. Die Mastzelldegranulation setzt Substanzen wie Histamin, Tryptase, Chymase, Kininogenase, Heparin und andere Enzyme frei. Des weiteren werden proinflammatorische Substanzen wie Prostaglandin D2 und Leukotriene frei, die die Gefäßpermeabilität erhöhen und die wässrige nasale Hypersekretion verursachen. Diese Mediatoren stimulieren zusätzlich sensible Nervenfasern, was zu Juckreiz führt, die Nasenatmung durch Schwellung behindert und den Niesreflex auslöst (siehe auch Abb. 9).


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
08.03.2005