Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

DISSERTATION

Der Einfluss von 5-HT_1A Rezeptoren auf die embryonale und postnatale Entwicklung des serotonergen Systems im Gehirn der Maus

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Von

Frau Dongrui Deng
aus Wuhan, China

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. H. Hörtnagl
2. PD. Dr. med. M. Bader
3. PD. Dr. med. G. Grosse

Datum der Einreichung: 02.05.2003

Datum der Promotion: 23.09.2003

Inhaltsverzeichnis

• 1  EINLEITUNG
  • 1.1 Entwicklung und Rolle des serotonergen Systems im Gehirn
    • 1.1.1 Aufbau und Transmissionsmechanismus des serotonergen Systems im Gehirn
    • 1.1.2 Verteilung des serotonergen Systems im Gehirn
    • 1.1.3 Wachstum und Entwicklung des serotonergen Systems im Gehirn
    • 1.1.4 Rolle von 5-HT während der Entwicklung des serotonergen Systems und dessen Projektionsgebiete
    • 1.1.5 Funktionen des serotonergen Systems im Gehirn
    • 1.1.6 Einfluss von S-100β auf das serotonerge System
  • 1.2  5-HT Rezeptoren
    • 1.2.1 Eigenschaften des 5-HT1A Rezeptors
    • 1.2.2  Verteilung des 5-HT1A Rezeptors im Gehirn
    • 1.2.3 Funktionen des 5-HT1A Rezeptors im Gehirn
  • 1.3 5-HT1A Rezeptor Knockout (KO) Maus
  • 1.4  Pharmakologische Aktivierung des 5-HT1A Rezeptors
  • 1.5 Überexpression des 5-HT1A Rezeptors in der Maus
  • 1.6 Catecholaminerge Systeme im Gehirn
    • 1.6.1 Aufbau und Funktion der catecholaminergen Systeme
    • 1.6.2 Verteilung der catecholaminergen Systeme
    • 1.6.3 Entwicklung der catecholaminergen Systeme
  • 1.7 Interaktionen zwischen den monoaminergen Systemen
  • 1.8  Einfluss serotonerger Neurone auf die embryonale Entwicklung anderer Neuro­transmittersysteme
• 2  FRAGESTELLUNG
• 3  MATERIAL UND METHODEN
  • 3.1 Versuchstiere und Versuchstierhaltung
  • 3.2 Chemikalien und Reagenzien
  • 3.3  Verwendete Antikörper
    • 3.3.1 Primärantikörper
    • 3.3.2 Sekundärantikörper
  • 3.4  Geräte und Materialien
  • 3.5 Methoden
    • 3.5.1 Genotypisierung mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR)
      • 3.5.1.1 Lösungen und Puffer
      • 3.5.1.2 DNA Extraction aus dem Mausschwanz
      • 3.5.1.3 Primer
      • 3.5.1.4 Vorbereitung für PCR-Ansätze
      • 3.5.1.5  Durchführung der PCR
      • 3.5.1.6 Agarose-Gelelektrophorese
    • 3.5.2 Autoradiographie
      • 3.5.2.1 Lösungen und Puffer
      • 3.5.2.2  Durchführung der Autoradigraphie
    • 3.5.3 Immunhistochemie
      • 3.5.3.1 Verwendete Lösungen und Puffer
      • 3.5.3.2 Präparation der Gehirne
        • Gehirne von embryonalen und P1,5 Mäusen
        • Gehirne von P15,5 Mäusen
      • 3.5.3.3 DAB – Immunfärbung
    • 3.5.4  Western Blot
      • 3.5.4.1 Verwendete Lösungen und Puffer
      • 3.5.4.2  Aufarbeitung der Gehirne
      • 3.5.4.3 Bestimmung der Proteinkonzentration
      • 3.5.4.4  Western Blot und Immundetektion
        • SDS – Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS – PAGE)
          • Herstellung des Gels
          • Auftragung der Proben und Standards
          • Gelelektrophorese
        • Western Blot
        • Immundetektion
    • 3.5.5  Quantitative Analyse von Monoamin-Neurotransmittern und deren Metaboliten mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ED)
      • 3.5.5.1 Durchührung der HPLC-ED
        • Die Bedingungen der Bestimmung von 5-HT und 5-HIAA
        • Die Bedingungen der Bestimmung von DA und NA
      • 3.5.5.2 Präparation und Aufarbeitung der Gehirne
        • Bestimmung von 5-HT und 5-HIAA
        • Bestimmung von DA und NA
    • 3.5.6 Statistische Auswertung
• 4  ERGEBNISSE
  • 4.1 Genotypisierung der KO, WT und ÜE Mäuse
  • 4.2 Vergleich der Hirnentwicklung während der embryonalen und frühpostnatalen Periode anhand der Gewichtszunahme bei KO, WT und ÜE Mäusen
  • 4.3 Autoradiographischer Nachweis von 5-HT1A Rezeptor
  • 4.4  Immunhistochemische Analyse bei KO, WT und ÜE Mäusen
    • 4.4.1 Vergleich der Entwicklung der serotonergen Raphe Neurone in den drei Mäuse­Linien
    • 4.4.2  Quantifizierung der serotonergen Neurone in der dorsalen Raphe bei P15,5 Mäusen
    • 4.4.3  Vergleich der Entwicklung der serotonergen Fasern in den Projektionsregionen bei den verschiedenen Mäuse-Linien
      • 4.4.3.1 Verteilung und Dichte der serotonergen Fasern zum Zeitpunkt E12,5
      • 4.4.3.2 Entwicklung und Verteilung der serotonergen Fasern im cerebralen Cortex
      • 4.4.3.3 Entwicklung und Verteilung der serotonergen Fasern im Hippocampus
      • 4.4.3.4 Entwicklung und Verteilung der serotonergen Fasern im Septum
      • 4.4.3.5  Entwicklung und Verteilung der serotonergen Fasern im Striatum
    • 4.4.4 Immunreaktivität der TPH im dorsalen Raphe Nucleus
    • 4.4.5 Vergleich der catecholaminergen Neurone in den drei Mäuse-Linien
      • 4.4.5.1 Entwicklung der dopaminergen Neurone im Bulbus olfactorius
      • 4.4.5.2  Entwicklung der dopaminergen Neurone in der Substantia nigra compactaund dem ventralen Tegmentum der drei Mäuse-Linien
      • 4.4.5.3 Entwicklung der noradrenergen Neurone in den drei Mäuse-Linien
    • 4.4.6  Vergleich des S100β Proteins im Gehirn der verschiedenen Mäuse-Linien zum Zeitpunkt P15,5
    • 4.4.7 Vergleich von MBP im Gehirn der drei Mäuse-Linien zum Zeitpunkt P15,5
  • 4.5  Proteinexpression bei verschiedenen Entwicklungsstadien im Gehirn der drei Mäuse­Linien
    • 4.5.1 Western Blot-Analyse des TH Proteins
    • 4.5.2 Western Blot-Analyse verschiedener synaptischer, vesikel-relevanter Proteine
    • 4.5.3  Western Blot-Analyse von MBP
  • 4.6 Quantitative Bestimmung der Monoamin-Transmitter und deren Metabolite im Gehirn der KO, WT und ÜE Mäuse mittels HPLC-ED
    • 4.6.1 Unterschiedliche Gewebskonzentrationen von 5-HT und 5-HIAA imGehirnwährend der verschiedenen Entwicklungsstadien
    • 4.6.2  Unterschiedliche Gewebskonzentrationen von DA und NA im Gehirn während der Entwicklungsstadien
    • 4.6.3 Bestimmung der Gewebskonzentrationen von 5-HT und 5-HIAA in verschiedenen Hirnregionen bei den drei Mäuse-Linien zum Zeitpunkt P15,5
    • 4.6.4  Bestimmung der Konzentrationen von DA, DOPAC und NA in verschiedenen Hirnregionen bei den drei Mäuse-Linien zum Zeitpunkt P15,5
• 5  DISKUSSION
  • 5.1 Unterschiedliche Expression des 5-HT1A Rezeptors bei den drei Mäuse-Linien
  • 5.2 Entwicklung des serotonergen Systems im Gehirn bei den drei Mäuse-Linien
    • 5.2.1 Generelle Entwicklung des Gehirns
    • 5.2.2 Embryonale und frühpostnatale Entwicklung des serotonergen Systems
  • 5.3 Entwicklung der catecholaminergen Systeme bei den drei Mäuse-Linien
  • 5.4 Korrelation zwischen dem serotonergen System und S100β
  • 5.5 Einfluss des 5-HT1A Rezeptors auf die Synaptogenese und Myelinisierung
• 6  ZUSAMMENFASSUNG
• LITERATURVERZEICHNIS
• ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
• DANKSAGUNG
• SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG

Tabellen

• Tab.1 Verdünnungen der Primärantikörper bei den verschiedenen Entwicklungsstadien
• Tab.2 Verdünnungen der Primärantikörper in der verschiedenen Entwicklungsstadien

Bilder

• Abb. 1 Synthese von 5-HT
• Abb. 2 Serotonerge Neurone im Hirnstamm der adulten Ratte (nach Role und Kelly, 1991). B1 und B4: Nucleus raphe pallidus; B2: Nucleus raphe obscurrus, B3: Nucleus raphe magnus; B5: Nucleus raphe pontis; B6 und B7: Nucleus raphe dorsalis; B8: Nucleus centralis superior; B9: Nucleus tegmenti reticularis pontis.
• Abb. 3 Embryonale Verteilung serotonerger, dopaminerger und noradrenerger Neurone (nach Goridis und Rohrer, 2002). Die sagittale Ansicht des Neuralrohrs der Maus am Embryonaltag 11,5 wird gezeigt. Die serotonergen Neurone sind in der Raphe, die dopaminergen Neurone im Tegmentum des Mesencephalons und die noradrenergen Neurone im Locus coeruleus lokalisiert. Der Pfeil zeigt die Grenze vom Mesencephalon und Metencephalon.
• Abb. 4 Synthese von Catecholaminen
• Abb. 5 Dopaminerge Neurone im ZNS der adulten Ratte (nach Cooper et al., 1991). A: Die mesostriatalen und mesolimbocorticalen Systeme sind in A8 (Nucleus retrorubralis), A9 (Substantia nigra), und A10 (ventrales Tegmentum) lokalisiert. B: Weitere dopaminerge Neurone befinden sich in dem Diencephalon (A11-A15), dem Bulbus olfactorius (A16) und der Retina (A17).
• Abb. 6 Noradrenerge Neurone und Projektionen vom LC im Gehirn der adulten Ratte ( nach Moore und Bloom, 1979). BS: Hirnstamm; C: Cingulum; CC: Corpus callosum; CTT: Tractus tegmentalis centralis; CTX: Cortex cerebri; DPS: dorsales periventriculares System; DTB: Tractus tegmentalis dorsalis; EC: Capsula externa; F: Fornix; FR: Fasciculus retroflexus; Hyp: Hypothalamus; Hip: Hippocampus; LC: Locus coeruleus; MT: Fasciculus mammilothalamicus; ML: Lemniscus medialis; OB: Bulbus olfactorius; PC: Commissura posterior; RF: Formatio reticularis; Spt: Septum; SM: Stria medullaris; ST: Stria terminalis; T: Tectum; Th: Thalamus.
• Abb. 7 Genotypisierung der KO, WT und ÜE Mäuse mittels PCR. Die Präparation der genomischen DNA erfolgte aus der Biopsie des Mausschwanzes. Zwei jeweilige Reaktionen wurden für jede genomische DNA Probe durchgeführt. Die benutzten Primer waren für die Reaktion von WT + KO und WT + ÜE unterschiedlich. A: PCR der WT und KO Mäuse. B: PCR der WT und ÜE Mäuse.„+“ : Positive Kontrolle; „-“: negative Kontrolle.Die Nummern zwischen beiden Bilder beziehen sich auf die Größe der Standard-DNA-Moleküle in bp.
• Abb. 8 Gesamthirngewichte (mg) von E12,5 - P1,5 Mäusen. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (n = 8-9). Statistische Auswertung wurde mittels one-way ANOVA mit dem Tukey’s post hoc-Test durchgeführt.
• Abb. 9 Rezeptorautoradiographie mit [3H]-8OH-DPAT, einem Agonist des 5-HT1A Rezeptors. A: Autoradiographie der Hirnschnitte von P1,5 WT und ÜE Mäusen. Die Bindungssignale bei ÜE Mäusen waren stärker als die bei WT Mäusen. B: Autoradiographie der Hirnschnitte von P15,5 WT und ÜE Mäusen. Es waren keine wesentlichen Unterschiede zwischen WT und ÜE Mäusen erkennbar. C: Autoradiographie der Hirnschnitte von P15,5 WT und KO Mäusen. Keine Bindungssignale waren bei KO Mäusen nachweisbar.
• Abb. 10 Immunreaktivität der serotonergen Neurone in verschiedenen Raphe Nuclei bei KO, WT und ÜE Mäusen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien (E12,5 - P1,5). Die Immunfärbungen der koronaren Hirnschnitte wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (1:5000) ausgeführt. In den verschiedenen serotonergen Raphe Nuclei sind stark gefärbte Neurone zu erkennen. A: E12,5; B: E14,5; C: E16,5; D: E18,5; E: P1,5. Die Maßstäbe entsprechen 50 µm in A; 100 µm in B; 200 µm in C, D und E.
• Abb. 11 Immunhistochemische Analyse der serotonergen Neurone bei P15,5 Mäusen in verschiedenen Mäuse-Linien. A: Die Immunfärbung der Hirnschnitte wurde mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (1:10000) durchgeführt. Die Maßstäbe entsprechen 200 µm in A; B: Quantifizierung der serotonergen Neurone. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (n = 6). Statistische Auswertung wurde mittels one-way ANOVA mit dem Tukey’s post hoc-Test durchgeführt (p > 0,05).
• Abb. 12 Immunreaktivität der serotonergen Fasern zum Zeitpunkt E12,5 in verschiedenen Mäuse-Linien. Die Immunfärbungen der Hirnschnitte wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (1:5000) durchgeführt. A: Die serotonergen Fasern im MeT; B: Die koronaren Hirnschnitte in der Raphe; C: Die serotonergen Neurone im Nucleus raphe dorsalis (DRN). Die Maßstäbe entsprechen 100 µm in A; 300 µm in B ; 50 µm in C.
• Abb. 13 Immunreaktivität der serotonergen Fasern im cerebralen Cortex der verschiedenen Mäuse-Linien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Die Immunfärbung der Hirnschnitte wurde mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (Verdünnung: A - C 1:5000; D 1:10000) durchgeführt. A: E16,5; B: E18,5; C: P1,5; D: P15,5. Die Maßstäbe entsprechen 100 µm in A, B, C und D.
• Abb. 14 Immunreaktivität der serotonergen Fasern im Hippocampus der verschiedenen Mäuse-Linien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Die Immunfärbungen der Hirnschnitte wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (Verdünnung: A - B 1:5000; C 1:10000) durchgeführt. A: E18,5; B: P1,5; C: P15,5. Die Maßstäbe entsprechen 100 µm in A, B und C.
• Abb. 15 Immunreaktivität der serotonergen Fasern im Septum der verschiedenen Mäuse-Linien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Die Immunfärbungen der Hirnschnitte wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (Verdünnung: A - D 1:5000; E 1:10000) durchgeführt. A: E14,5; B: E16,5; C: E18,5; D: P1,5; E: P15,5. Die Maßstäbe entsprechen 200 µm in A, B, C, D und E.
• Abb.16 Immunreaktivität der serotonergen Fasern im Striatum bei P15,5 Mäusen. Die Immunfärbung der Hirnschnitte wurde mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (Verdünnung: 1:10000) durchgeführt. Die Maßstäbe entsprechen 300 µm in A und 100 µm in B.
• Abb. 17 Immunreaktivität der TPH in den Raphe Nuclei bei den verschiedenen Mäuse-Linien. Die TPH positive Neurone wurden mit einem monoklonalen (Maus) Antikörper gegen TPH untersucht. Die Maßstäbe entsprechen 200 µm.
• Abb. 18 Immunreaktivität der dopaminergen Neurone im Bulbus olfactorius bei den verschiedenen Mäuse-Linien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Die koronaren Hirnschnitte wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen TH (Verdünnung: A - D 1:500; E 1:2000) untersucht. A: E14,5; B: E16,5; C: E18,5; D: P1,5; E: P15,5. Die Maßstäbe entsprechen 50 µm in A und B; 100 µm in C, D und E.
• Abb. 19 Immunreaktivität der dopaminergen Neurone und Fasern bei den verschiedenen Mäuse-Linien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Die koronaren Hirnschnitte wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen TH (Verdünnung: A - E 1:500; F 1:2000) untersucht. Die TH positiven Neurone und Fasern wurden in der Substantia nigra compacta (SNC) und dem ventralen Tegmentum (VTA) gefärbt. A: E12,5; B: E14,5; C: E16,5; D: E18,5; E: P1,5; F: P15,5. Die Maßstäbe entsprechen 100 µm in A und B; 200 µm in C, D, E und F.
• Abb. 20 Immunreaktivität der noradrenergen Neurone bei KO, WT und ÜE Mäusen in verschiedenen Entwicklungsstadien. Die noradrenergen Neurone im LC wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen TH (Verdünnung:A - D 1:500; E 1:2000) untersucht. A: E14,5; B: E16,5; C: E18,5; D: P1,5; E: P15,5. Die Maßstäbe entsprechen 200 µm in A, B, C, D und E.
• Abb. 21 Immunreaktivität des S100β Proteins in den Glialzellen bei P15,5 KO, WT und ÜE Mäusen. A-B: S100β Protein positive Glialzellen im Striatum (Caudatus/Putamen, CPu). C-D: S100β Protein positive Glialzellen im Hippocampus (Hip). Bei ÜE Mäusen waren mehr Glialzellen gefärbt. Der Pfeil zeigt S100β Protein positive Glialzelle. Das Rechteck demonstriert die Region der Vergrößerung. Die Maßstäbe entsprechen 300 µm A und C; 50 µm in B und D.
• Abb. 22 Immunreaktivität von MBP bei den verschiedenen P15,5 Mäuse-Linien. Die koronaren Hirnschnitte wurden mit einem monoklonalen (Maus) Antikörper (Verdünnung 1:2000) gegen MBP untersucht. Die starke Immunfärbung der MBP Fasern wird im Hippocampus, Frontalcortex und Septum der verschiedenen Mäuse-Linien gezeigt. A, B: Hippocampus (Hip), C: Septum (Spt); D, E: Frontalcortex (Fro). Das Rechteck zeigt den Ausschnitt der Vergrößerung im Hippocampus und Frontalcortex . Die Maßstäbe entsprechen 500 µm in A und D; 100 µm in B und E; 300 µm in C.
• Abb. 23 Nachweis des TH Proteins bei KO, WT und ÜE Mäusen in den verschiedenen Entwicklungsstadien mittels Western Blot. A: TH Banden von 56 kDa. Pro Geltasche wurden gleiche Mengen Proteine (jeweils 30 μg) in einem 10% SDS-PAGE aufgetragen, geblottet und mit einem polyklonalem anti-TH Antikörper inkubiert. B: Die Semiquantifizierung der Banden erfolgte mittels LabImage® Software (n = 3 – 4; p > 0,05).
• Abb. 24 Nachweis verschiedener synaptischer, vesikel-relevanter Proteine bei den verschiedenen Mäuse­Linien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien mittels Western Blot. A: Proteinbanden von Synaptobrevin (Syb), SNAP-25, Synaptophysin (Syp), und Synaptotagmin (Syt) bei E12,5 und E14,5 Mäusen. B: Semiquantifizierung der Banden bei den E12,5 Mäusen mittels LabImage® Software zur Analyse und Dokumentation von Elektrophorese-Gelen (Kapelan); n = 3, *p< 0,05 vs WT. C: Synaptobrevin Proteine von E12,5 bis P15,5. D: Synaptophysin Proteine von E14,5 bis P15,5.
• Abb.25 Nachweis von MBP bei den verschiedenen Mäuse-Linien im Western Blot zum Zeitpunkt P15,5. Die MBP Bande von 27 kDa ist gezeigt. 20 μg Protein wurden pro Tasche aufgetragen und die Membran mit monoklonalem anti-MBP (1:2000) inkubiert. Die Zahlen an der rechten Seite geben den SDS-PAGE Standard in kDa an.
• Abb.26 Vergleich der Gewebsspiegel von 5-HT und 5-HIAA im Gehirn während der Entwicklungs­stadien von E12,5 bis P1,5 bei den verschiedenen Mäuse-Linien. A: 5-HT (pg/mg Hirngewebe). B: 5-HIAA (pg/mg Hirmgewebe). C: Molare Ratio von 5-HIAA/5-HT. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (n=6). Statistische Auswertung wurde mittels one-way ANOVA mit dem Tukey’s post hoc-Test durchgeführt. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
• Abb. 27 Vergleich der Konzentrationen von DA und NA im Gehirn während der Entwicklungsstadien bei den verschiedenen Mäuse-Linien. A: DA (pg/mg Hirngewebe) B: NA (pg/mg Hirngewebe). Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (n=6). Statistische Auswertung wurde mittels one-way ANOVA mit dem Tukey’s post hoc-Test durchgeführt. ** p < 0,01, *** p < 0,001.
• Abb.28 Vergleich der Konzentrationen von 5-HT und 5-HIAA und der Turnover von 5-HT in verschiedenen Hirnregionen zwischen P15,5 KO, WT und ÜE Mäusen. Die Bestimmung erfolgte in den Regionen Bulbus olfactorius (OB), Frontalcortex (Fro), Striatum (Caudatus/Putamen, CPu), Hippocampus (Hip) und Hypothalamus (Hyp). A: 5-HT (pg/mg Hirngewebe) B: 5-HIAA (pg/mg Hirngewebe). C: Molare Ratio von 5-HIAA / 5-HT. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (n = 6). Statistische Auswertung wurde mittels one-way ANOVA mit dem Tukey’s post hoc-Test durchgeführt; * p < 0,05, ** p < 0,01.
• Abb. 29 Vergleich der Konzentrationen von DA, DOPAC und NA in verschiedenen Hirnregionen zwischen P15,5 KO, WT und ÜE Mäusen. Die Bestimmung erfolgte in den Regionen Bulbus olfactorius (OB), Frontalcortex (Fro), Striatum (Caudatus/Putamen, CPu), Hippocampus (Hip) und Hypothalamus (Hyp). A: DA (pg/mg Hirngewebe) B: NA (pg/mg Hirngewebe). C: DOPAC (pg/mg Hirngewebe). Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (n = 6). Statistische Auswertung wurde mittels one-way ANOVA mit dem Tukey’s post hoc-Test durchgeführt; * p < 0,05.