3  MATERIAL UND METHODEN

In dieser Studie wurde mit NMRI WT Mäusen, 5-HT_1A Rezeptor ÜE (Linie 34) und KO Mäusen gearbeitet, die unter Standard-Laborbedingungen bei einer Raumtemperatur (RT) von etwa 21°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40-50% in Käfigen untergebracht wurden. Die Betreuung der Mäuse erfolgte im Tierstall des Institutes für Pharmakologie und Toxikologie der Charité zu Berlin, wobei die Zucht und alle weiteren Arbeiten mit den Mäusen unter entsprechend geltenden Tierschutzbestimmungen durchgeführt wurden. Als Nahrung erhielten die Mäuse Standard-Futter und Wasser ad libitum.

Die WT und ÜE transgenen Mäuse hatten den gleichen NMRI genetischen Hintergrund und wurden durch homologe Rekombination hergestellt. Die KO Mäuse mit 129 / Sv genetischem Hintergrund wurden von dem Zentrum für Neurobiologie und Verhalten an der Columbia University in New York zur Verfügung gestellt und dann mit den NMRI Mäusen über mehrere Generationen durch homologe Rekombination verpaart. Somit hatten die unter diesen Bedingungen erzeugten KO Mäuse einen ähnlich genetischen Hintergrund wie die WT und ÜE transgenen Mäuse. In der vorliegenden Studie wurden KO, WT und ÜE Mäuse von verschiedenen embryonalen Entwicklungsperioden (E12,5; E14,5; E16,5; E18,5) verwendet. Der Tag der Befruchtung wurde als E 0 bezeichnet. Postnatal erfolgte die Untersuchung zum Zeitpunkt P1,5 und P15,5.

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Genomische DNA aus dem Mausschwanz wurde mittels Invisorb®Spin Tissue Mini Kit (Invitek, Deutschland) isoliert. Ein 0,5 cm Schwanzabschnitt wurde präpariert und 400 µl Lysierungspuffer G ( 3.5.1.1) und 40 µl Proteinase K zugegeben und gemischt. Die Mischung wurde dann im Eppendorf Thermomixer (Hamburg, Deutschland ) bei 52°C inkubiert, bis sich der Schwanz vollständig aufgelöst hatte. Die Lösung wurde bei RT für 2 min bei 12.000 U / min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfgefäß pipettiert und mit 200 µl Bindungspuffer T (3.5.1.1) gemischt und am Vortex für 10 sec geschüttelt. Die Suspension wurde in ein 2 ml Eppendorfgefäß mit einer Spinsäule überführt und für 1 min inkubiert und dann bei 12.000 U / min für 2 min zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgegossen und [Seite 33↓]die Spinsäule wurde mit Waschpuffer gewaschen und wieder bei 12.000 U / min für 2 min zentrifugiert.

Nach der letzten Zentrifugation wurde die Spinsäule in ein neues Eppendorfgefäß gestellt. 200 µl erwärmter (bei 37 °C) Elutionspuffer D (3.5.1.1) wurde zugegeben und bei 10.000
U / min für 2 min zentrifugiert. Die gelöste DNA wurde für die Qantifizierung und PCR eingesetzt.

Die isolierte DNA vom Schwanz der KO, WT und ÜE Mäuse wurde getrennt mit spezifischen Primer Kombinationen (Tib Molbiol, Berlin ) wie in folgender Tabelle dargestellt amplifiziert:

Zur Vervielfältigung der entsprechenden DNA Sequenzen wurden folgende Ansätze verwendet:

Bei jedem Experiment wurden negative Kontrolle (H₂O) und positive Kontrolle (schon bekannte DNA positive Probe) gleichzeitig durchgeführt.

2 µl DNA Extraktionsprobe aus dem Mausschwanz wurde mit 48µl unter 3.5.1.4 beschriebenen PCR-Ansatz gemischt. Ein PCR-Zyklus wurde wie folgt durchgeführt:

Mit Hilfe der Gelelektrophorese wurde DNA Fragment zur Analyse und Isolierung aufgetrennt. Die Größe der DNA-Moleküle in Basenpaaren (bp) wurde im Vergleich mit einem 1 kb DAN Ladder (MBI Fermentas) abgeschätzt. 10 µl / Geltasche DNA-Standard und PCR vervielfältigte DNA Produkte wurden auf 1% Agarose-Gel im TAE Puffer (1x) aufgetragen und bei einer konstanten Spannung von 80 V etwa 20 min aufgetrennt.

P1,5 und P15,5 KO, WT und ÜE Mäuse wurden dekapitiert, die Gehirne sofort entnommen, in pulverisiertem Trockeneis eingefroren und bis zur Bearbeitung bei –80°C gelagert. Die Gehirne wurden seriell koronar (20 µm) mit dem Kryostat (Reichert-Jung, Nussloch, Deutschland) bei
-15°C geschnitten und die Schnitte direkt auf SuperFrost^®Plus Objektträger (Menzel-Glaser, Deutschland) aufgezogen und bei –80°C aufbewahrt.

Die Schnitte wurden in Inkubationspuffer mit 0,1% Pargylin bei RT für 10 min vorinkubiert und dann in spezifischer Bindungslösung (3.5.2.1) bei RT für 60 min inkubiert. Die Schnitte wurden zweimal 5 min mit Inkubationspuffer mit 0,1% Pargylin bei 4°C gewaschen, dann mit vorgekühltem destilliertem Wasser (4°C) einmal 1 min gespült und an der Luft 24 h getrocknet. Anschließend wurden die Schnitte auf Amersham Hyperfilm CM bei RT für 3 Wochen exponiert.

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Die KO, WT und ÜE trächtigen Mäuse wurden jeweils am E12,5, E14,5, E16,5 oder E18,5 dekapitiert. Die Embryonen wurden aus dem Uterus entfernt und in eine eisgekühlte physiologische Kochsalzlösung gelegt. Die Gehirne der Embryonen wurden sofort entnommen und in der Fixierungslösung ( 3.5.3.1) bei 4°C für 4-6 h fixiert.

Die jeweiligen P1,5 KO, WT und ÜE Mäuse wurden dekapitiert. Die Gehirne wurden sofort aus den auf Eis gelagerten Schädeln entnommen und in Fixierungslösung ( 3.5.3.1) bei 4°C für 4-6 h fixiert.

Anschließend wurden die Gehirne von E12,5 bis P1,5 auf 2% Agarose-Gel Blöckchen und Korkplättchen aufgebracht und in Stickstoff gekühltem Hexan (– 60°C) gefroren und bei –80°C aufbewahrt. Die Gehirne wurden seriell koronar (20µm) mit dem Kryostat bei -25°C geschnitten und die Schnitte direkt auf SuperFrost^®Plus Objektträger aufgezogen und etwa 30 min an der Luft getrocknet und anschließend bei –20°C aufbewahrt.

Die jeweiligen P15,5 KO, WT und ÜE Mäuse wurden mit einer intraperitonealen (ip) Injektion von Ketaminhydrochlorid (Ketavet^®, 0,1 mg / g Körpergewicht) und 2 % Xylazinhydrochlorid (Rompun^®, 0,013 mg / g Körpergewicht) narkotisiert und mit 2500 IU Heparin ip behandelt. Der Brustkorb wurde eröffnet und das Herz freipräpariert. Der Blutkreislauf wurde am linken Ventrikel geöffnet und über einen Polyethylenschlauch mit einem Perfusionssystem verbunden. Die Perfusion wurde wie in folgender Tabelle dargestellt durchgeführt.

Nach der Perfusion wurden die Gehirne entnommen und in der Nachspüllösung mit 1% PFA bei 4°C für 24 h aufbewahrt. Im Anschluss daran wurden die Gehirne zum Schutz vor Gefrierartefakten in einer 30% Saccharose in PBS (0,1M, pH 6,81) bei 4°C für 24 h eingelegt. Anschließend wurden die Gehirne auf 2% Agarose-Gel Blöckchen und Korkplättchen aufgebracht und in Stickstoff gekühltem Hexan (– 60°C) gefroren und bei –80°C aufbewahrt.

Die Gehirne wurden seriell koronar mit dem Kryostat bei – 25°C (25 µm) geschnitten und die Schnitte wurden in Gefrierschutzlösung (3.5.3.1) bei – 20°C aufbewahrt.

Die Schnitte von Embryonen und P1,5 Mäusen wurden in eine feuchte Inkubationskammer gelegt. Die Schnitte von P15,5 Mäusen, die in der Gefrierschutzlösung aufbewahrt waren, wurden zuerst viermal für 5 min in 0,1M PBS gespült. Zur Zerstörung der endogenen Peroxidaseaktivität wurden alle Schnitte von E12,5 bis P15,5 30 min bei RT mit 0,05% Phenylhydrazin in 0,1M PBS mit 10% NGS oder NHS und 0,3% Triton-X 100 behandelt. Anschließend wurden die Schnitte in eine entsprechend verdünnte Lösung des Primärantikörpers (Tab. 1) überführt und bei 4°C 36 h inkubiert.

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Tab.1 Verdünnungen der Primärantikörper bei den verschiedenen Entwicklungsstadien

Nach viermaligem Waschen für insgesamt 1 h in 0,1 M PBS und Vorinkubation für 1 h bei RT in der PBS-A Lösung (2% BSA in 0,1 M PBS) wurden die Schnitte mit der entsprechenden Lösung des Sekundärantikörpers (1:2000) 24 h bei 4°C beschichtet.

Es folgten widerum Spülung und Vorinkubation, bevor die Schnitte mit dem unter 3.5.3.1 beschriebenen Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC-Komplex) für 4 h bei RT inkubiert wurden.

Nach vier fünfminütigen Auswaschen des ABC-Komplexes in 0,1M PBS wurden die Schnitte 15 min bei RT mit der Vorinkubationslösung (0,05% DAB und 10 mM Imidazol) vorinkubiert, anschließend wurde die gebundene Peroxidase durch Zugabe von 0,3% Ammoniumnickelsulfat und 0,015% H₂O₂ angefärbt. Nach 3-5 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,1M PBS gestoppt und nach zwei fünfminütigen Auswaschen in 0,1M PBS wurden die Schnitte von P15,5 Mäusen auf die Gelatine-beschichtete Objektträger aufgezogen und etwa 30 min an der Luft getrocknet, anschließend wurden alle Schnitten (E12,5-P15,5) in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70%, 90%, 96%, 2x 100%) für insgesamt 10 min entwässert, dann in Xylol gebracht und danach in Entellan eingedeckt und unter dem DML Lichtmikroskop (Fa. Leica) analysiert und photographiert. Bei jedem Experiment wurden negative Kontrollen (ohne Primärantikörper) gleichzeitig durchgeführt.

Die trächtigen KO, WT und ÜE Mäuse wurden dekapitiert und die Embryonen in verschiedenen Entwicklungsperioden wurden aus dem Uterus entfernt und in eisgekühlte physiologische Kochsalzlösung gelegt. Die Gehirne der Embryonen wurden sofort auf Eis herauspräpariert und umgehend im 0,5 ml (3 gepoolte Gehirne bei E12,5 und E14,5), 1 ml (bei E16,5) oder 1,5 ml (bei E18,5) eisgekühlten Homogenisierungspuffer (3.5.4.1) homogenisiert.

Die P1,5 KO, WT und ÜE Mäuse wurden dekapitiert und die Gehirne sofort auf Eis entnommen und in 1,5 ml eisgekühltem Homogenisierungspuffer (3.5.4.1) homogenisiert.

Die P15,5 KO, WT und ÜE Mäuse wurden mit Äther tief anästhesiert und dekapitiert. Nachdem die Gehirne auf Eis herauspräpariert wurden, wurden sie sofort in 2 ml eisgekühltem Homogenisierungspuffer (3.5.4.1) homogenisiert.

Alle Homogenate wurden mit einer Kühlzentrifuge 5402 bei 5500 U / min für 15 min bei 4°C zentrifugiert. Ein Teil des Überstands wurde zur Bestimmung der Proteinkonzentration eingesetzt und der andere Teil wurde mit 3 x Probenpuffer im Verhältnis 2 : 1 gemischt, bei
95°C für 5 min erhitzt und aliquotiert bei -20° C aufbewahrt.

Über Verdünnungsreihen wurde eine Standardkurve von 50 bis 400 µg / ml BSA hergestellt. Die Proben wurden üblicherweise mit 0,4% Triton-X 100 in Verdünnungsreihen angesetzt und in Duplikaten in die Löcher einer 96-Loch Mikrotiter Platte (20 µl / Loch) pipettiert. Dazu wurden pro Loch 200 µl der BCA Reaktionslösung zugegeben (eine Mischung aus BCA Lösung A und B im Verhältnis von 50:1, v / v). Die Mikrotiter Platte wurde dann für 30 min bei 60°C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde die Platte für 10 min zum Abkühlen stehen lassen, bevor die Extinktion der Proben bei 550 nm in einem ELISA-Reader (Dynatech MR 5000, UK) gemessen wurde. Die Proteinkonzentrationen der Proben wurden anhand der Standardkurve bestimmt.

Das Gel wurde wie folgt hergestellt.

Mittels SDS–PAGE unter Anwendung des diskontinuierlichen Puffersystems nach dem Prinzip von Lämmli (1970) können Proteine entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden. Die Acrylamidkonzentration des Trenngels wurde je nach gewünschtem Auftrennungs­bereich variiert. Ein 10 %iges Trenngel erreicht eine gute Auftrennung von Proteinen mit einer Molmasse bis zu 10kDa.

Vor dem Aufbringen auf das Gel wurden die zu analysierenden Proteinproben für 5 min bei 95°C zur Denaturierung erhitzt und sofort auf Eis gestellt. Nach Polymerisation des Sammelgels wurden die Proben jeweils nach den gewünschten Proteinkonzentrationen (z.B. 20-30
µg / Tasche) in die Tasche des SDS-Polyacrylamidgels aufgetragen. Zur Charakterisierung des Molekulargewichts der aufzutrennenden Proteine wurde bei jedem Lauf des Gels ein Standard im SDS-PAGE mitgeführt. Vom Standard wurde 10 µl / Tasche SDS-PAGE Standard von 6,5 bis 200 kDa verwendet, die 1:20 mit dem SDS reduzierten Probenpuffer (3.5.4.1) verdünnt und für 5 min bei 95°C erhitzt wurde.

Nach Beladung des Polyacrylamidgels wurden die Proben bei RT für etwa 30 min bei 80V aufgetrennt, bis die Front des Probenpuffers die Grenze des Trenngels erreicht hat. Anschließend wurde die Spannung auf 160 V umgestellt und das Gel für etwa 1 h bei RT weiterlaufen lassen, bis die Front des Probenpuffers den unteren Gelrand erreicht hat.

In der Transferapparatur (Mini-Protean®3 Electrophoresis Cell, Bio-RAD) wurde ein Sandwich aus folgenden Komponenten zusammengestellt.

Der Transfer erfolgte in der oben aufgebauten Transferapparatur für 25 min bei RT bei einer Stromstärke von 300 mA pro Gel im Semi-Dry Verfahren unter Verwendung von Semi­ Dry Puffer.

Um die Banden der Marker-Proteine sichtbar zu machen und die Integrität der übrigen Proteine zu testen, wurden die NC-Membranen nach erfolgtem Transfer in 0,2% Ponceau-S Lösung für 2-3 minangefärbt und anschließend mit H₂O gewaschen und getrocknet. Zur Bestimmung verschiedener Proteine in einer Membran wurde die Membran mit dem Skalpell in horizontale oder vertikale Streifen geschnitten, wobei die Banden der Marker-Proteine als Anhaltspunkte für das ersichtliche Molekulargewicht der Proteine dienten.

Die Membranen wurden jeweils getrennt von jeder Gruppe mit dem Antiserum inkubiert. Nach dem Absättigen der unspezifischen Bindungsstellen mit 5% Magermilchpuffer in TBS / 0,1% Tween 20 (3.5.4.1) bei RT für 1 h wurden die Membranen mit dem in der Antikörperlösung
( 3.5.4.1) verdünnten Primärantikörper bei 4°C 24 h inkubiert.

Tab.2 Verdünnungen der Primärantikörper in der verschiedenen Entwicklungsstadien

Um unspezifisch gebundene Antikörper zu entfernen, wurden die Membranen viermal für 15 min mit 5% Magermilchpuffer gewaschen. Der Nachweis gebundener Antikörper erfolgte für 1 h bei RT mit Peroxidase-gekoppelten Pferd-anti-Maus bzw. Schaf-anti-Kaninchen­Sekundärantikörper (beide Verdünnungen von 1:1000 in Antikörperlösung, 3.5.4.1). Nach zweimaligem 15 min Waschen der Membranen mit 5% Magermilchpuffer wurden die Membranen nur mit TBS zweimal für 15 min gewaschen. Alle Inkubations-und Wasch-Schritte wurden auf einem Schüttler durchgeführt.

Zur Detektion der Peroxidase Aktivität wurden die Membranen für 1 min in Chemolumineszenz-Lösung inkubiert und in einer Filmkassettte zusammen mit einem Scientific Imaging Film ( Kodak, USA) für 1-30 min exponiert. Die Exponierungszeit hing von der Stärke des Bandsignals ab.

Die Erfassung des Gehalts an endogenem 5-HT und dessen Metabolit 5-HIAA, DA und dessen Metabolit DOPAC, und NA erfolgte mittels HPLC-ED und wurde an KO, WT and ÜE Mäusen in verschiedenen Entwicklungsperioden (E12,5; E14,5; E16,5: E18,5; P1,5; P15,5) durchgeführt. Bei jeder Gruppe wurden jeweilig mindestens sechs Mäuse benutzt.

Die trächtigen KO, WT und ÜE Mäuse wurden jeweils am E12,5, E14,5, E16,5 oder E18,5 dekapitiert und die Embryonen wurden aus dem Uterus entfernt und in eine eisgekühlte physiologische Kochsalzlösung gelegt. Die Gehirne der Embryonen wurden sofort entnommen und auf Trockeneis eingefroren und bis zur Bestimmung bei –80°C aufbewahrt. Die P1,5 und P15,5 KO, WT und ÜE Mäuse wurden dekapitiert und die Gehirne sofort entnommen, auf Trockeneis eingefroren und bei -80°C aufbewahrt.

Jedes P15,5 Gehirn wurde auf einer Kühlplatte (-15°C) in fünf verschiedene Subregionen (Bulbus olfactorius, Frontalcortex, Striatum, Hippocampus, und Hypothalamus) präpariert. Jede Probe wurde sofort in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gewogen und bei - 80°C aufbewahrt.

Die Gewebe wurden mit entsprechender Menge (je nach der Verdünnung) von 0,1 M Perchlorsäure (PCA) versetzt und mit einem Sonicator homogenisiert und dann bei 13 000 rpm für 20 min bei 4°C zentrifugiert. Vom Überstand wurden 20 μl direkt ins HPLC-ED System injiziert (Sperk, 1982)

Die Gewebe wurden mit entsprechender Menge (je nach der Verdünnung) von 0,1 M PCA versetzt und mit einem Sonicator homogenisiert und bei 13 000 rpm für 20 min bei 4°C zentrifugiert. 300 µl Überstand wurden mit 30 µl 10^-7 M internen Standard (DHBA) und1 ml 1% Al₂O₃ in Tris / HCl (pH 8,6) versetzt und bei 4°C für 10 min geschüttelt, anschließend in einer Eppendorfzentrifuge (90° fixer Winkel) für 90 sec zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet mit 1 ml H₂O gewaschen und danach noch einmal 90 sec zentrifugiert. Der entstehende Überstand wurde abgesaugt und das Pellet mit 300 µl 0,1 M PCA versetzt und bei
4 °C für 10 min geschüttelt und danach 90 sec zentrifugiert. Von diesem Überstand wurden 20 µl direkt ins HPLC-ED System injiziert (Sperk et al. 1981).

Die gewonnenen Daten wurden als Mittelwerte und Standardfehler (MW+SEM) angegeben. Zur statistischen Auswertung bei Vergleich mehrerer Gruppen wurde mit Hilfe des Statistikprogrammes von SigmaStat ein one-way ANOVA (one-way analysis of variance, die eine Aussage darüber trifft, ob sich mehrere Gruppen signifikant voneinander unterscheiden) durchgeführt, gefolgt von dem Tukey’s post hoc-Test. Als statistisch signifikant wurden Werte mit p < 0,05 definiert.