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4  ERGEBNISSE

4.1 Genotypisierung der KO, WT und ÜE Mäuse

In dieser Studie wurden die KO, WT und ÜE Mäuse durch homologe Rekombination erzeugt. Deshalb war es nicht nötig, jede Maus zu genotypisieren. Zur Kontrolle wurden die oben genannten Mäuse-Linien nur periodisch mittels PCR typisiert.

Bei den PCR Produkten, die mit Primer 1A 5 and 1A 3 amplifiziert wurden, entstand eine Bande von 759 bp für WT Allel, es gab keine Bande für KO Allel (Abb. 7A). Das andere mit Primer POS F und POS R amplifizierte PCR Produkt, wies eine Bande von 400 bp für ÜE Zielallel auf. Bei WT Mäusen trat keine Bande auf (Abb. 7B).

Abb. 7 Genotypisierung der KO, WT und ÜE Mäuse mittels PCR. Die Präparation der genomischen DNA erfolgte aus der Biopsie des Mausschwanzes. Zwei jeweilige Reaktionen wurden für jede genomische DNA Probe durchgeführt. Die benutzten Primer waren für die Reaktion von WT + KO und WT + ÜE unterschiedlich. A: PCR der WT und KO Mäuse. B: PCR der WT und ÜE Mäuse.
„+“ : Positive Kontrolle; „-“: negative Kontrolle.Die Nummern zwischen beiden Bilder beziehen sich auf die Größe der Standard-DNA-Moleküle in bp.

4.2 Vergleich der Hirnentwicklung während der embryonalen und frühpostnatalen Periode anhand der Gewichtszunahme bei KO, WT und ÜE Mäusen

Die Gehirne der KO, WT und ÜE Mäuse von E12,5 bis P1,5 haben wir vor der Aufarbeitung für die HPLC - Messung gewogen. Es waren keine wesentlichen Unterschiede zwischen den drei Mäuse-Linien zu erkennen (Abb. 8).


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Abb. 8 Gesamthirngewichte (mg) von E12,5 - P1,5 Mäusen. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (n = 8-9). Statistische Auswertung wurde mittels one-way ANOVA mit dem Tukey’s post hoc-Test durchgeführt.

4.3 Autoradiographischer Nachweis von 5-HT1A Rezeptor

Um die Veränderung der Expression des 5-HT1A Rezeptors nachzuweisen, wurde die Rezeptorautoradiographie mit dem 5-HT1A Rezeptor Radioligand [3H]-8OH-DPAT, einem Agonist des 5-HT1A Rezeptors, bei den verschiedenen Mäuse-Linien durchgeführt. Zum Zeitpunkt P1,5 waren die Bindungssignale in den Hirnschnitten der ÜE Mäuse bereits wesentlich stärker ausgeprägt als in denen der WT Mäuse (Abb. 9A). Hingegen wie aus der Abb. 9B hervorgeht, waren die Bindungssignale von [3H]-8OH-DPAT in den Hirnschnitten von P15,5 WT und ÜE Mäusen vergleichbar und zu diesem Zeitpunkt war bei WT Mäusen die typische Verteilung der Bindungsstellen von [3H]-8OH-DPAT im Gehirn mit intensiven Bindungssignalen im Septum, Hippocampus und in den Raphe Nuclei erkennbar und entsprach dem Verteilungsmuster bei adulten Mäusen (Heisler et al., 1998). Im Gegensatz dazu gab es keine spezifischen autoradiographischen Signale von [3H]-8OH-DPAT in den Hirnschnitten der P15,5 KO Mäuse (Abb. 9C). Die Ergebnisse der Autoradiographie wurden freundlicherweise von Frau Dr. Kusserow zur Verfügung gestellt.


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Abb. 9 Rezeptorautoradiographie mit [3H]-8OH-DPAT, einem Agonist des 5-HT1A Rezeptors.
A: Autoradiographie der Hirnschnitte von P1,5 WT und ÜE Mäusen. Die Bindungssignale bei ÜE Mäusen waren stärker als die bei WT Mäusen. B: Autoradiographie der Hirnschnitte von P15,5 WT und ÜE Mäusen. Es waren keine wesentlichen Unterschiede zwischen WT und ÜE Mäusen erkennbar.
C: Autoradiographie der Hirnschnitte von P15,5 WT und KO Mäusen. Keine Bindungssignale waren bei KO Mäusen nachweisbar.


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4.4  Immunhistochemische Analyse bei KO, WT und ÜE Mäusen

Die Entwicklung und Verteilung des serotonergen Systems im Gehirn der KO, WT und ÜE Mäuse während der embryonalen (E12,5; E14,5; E16,5; E18,5) und postnatalen Perioden (P1,5 und P15) wurden mit einer immunhistochemischen Technik untersucht. Zu den jeweiligen Zeitpunkten wurden eine Reihe von serotonergen wie auch anderen neuronalen Markern mit DAB-Immunfärbung an seriellen Hirngefrierschnitten (20-25µm) im gesamten Gehirn untersucht. Dadurch war es möglich, an aufeinanderfolgenden Hirnschnitten das Entwicklungsprofil der verschiedenen Proteine parallel zu erfassen. Wegen der bekannten Interaktionen zwischen dem serotonergen System und der Entwicklung catecholaminerger Systeme wurden neben der Untersuchung serotonerger Marker wie 5-HT, TPH auch ein catecholaminerger Marker wie TH eingesetzt. Da der 5-HT1A Rezeptor möglicherweise an der Regulation des neurotrophen Faktors S100β beteiligt ist, wurde auch S-100β untersucht. Als weiterer morphologischer Parameter zur Beobachtung der Entwicklung und Reifung des ZNS wurde das Ausmaß der Myelinisierung mittels MBP und der Synaptogenese mittels der verschiedenen synaptischen Proteine untersucht.

4.4.1 Vergleich der Entwicklung der serotonergen Raphe Neurone in den drei Mäuse­Linien

Die Zellkörper serotonerger Neurone befinden sich hauptsächlich in den verschiedenen Regionen der Raphe (B1-B9). Bei der vergleichenden Untersuchung zwischen KO, WT und ÜE Mäusen wurde der Schwerpunkt auf die verschiedenen Raphe Regionen gelegt. In der Abb. 10 sind die Entwicklungen serotonerger Neurone der verschiedenen Raphe Regionen in den unterschiedlichen Entwicklungsstadien dargestellt. Bei E12,5 Mäusen zeigten die serotonergen Neurone bei allen drei Mäuse-Linien eine vergleichbar starke Immunreaktivität. In der weiteren Entwicklung von E14,5 bis P1,5 waren keine wesentlichen Unterschiede bezüglich der Immunreaktivitäten serotonerger Neurone in den verschiedenen Raphe Nuclei wie Nucleus raphe dorsalis (DRN), Nucleus raphe medianus (MRN), Nucleus raphe paramedianus (PMR) und Nucleus raphe magnus (NMR) zwischen KO, WT und ÜE Mäusen zu erkennen.


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Abb. 10 Immunreaktivität der serotonergen Neurone in verschiedenen Raphe Nuclei bei KO, WT und ÜE Mäusen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien (E12,5 - P1,5). Die Immunfärbungen der koronaren Hirnschnitte wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (1:5000) ausgeführt. In den verschiedenen serotonergen Raphe Nuclei sind stark gefärbte Neurone zu erkennen.
A: E12,5; B: E14,5; C: E16,5; D: E18,5; E: P1,5. Die Maßstäbe entsprechen 50 µm in A; 100 µm in B; 200 µm in C, D und E.


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4.4.2  Quantifizierung der serotonergen Neurone in der dorsalen Raphe bei P15,5 Mäusen

Die serotonergen Neurone in der dorsalen Raphe bei P15,5 Mäusen wurden mit polyklonalem Antikörper gegen 5-HT intensiv gefärbt. Die Zahl der serotonergen Neurone wurde in drei verschiedenen vergleichbaren Hirnschnitten von zwei Mäusen aus jeweiligen Mäuse-Linien (KO, WT und ÜE) gezählt. Die Immunreaktivität der serotonergen Neurone waren bei allen drei Mäuse-Linien zum Zeitpunk P15,5 vergleichbar (Abb. 11A). Keine wesentlichen Unterschiede bezüglich der Zahl der serotonergen Neuronen waren zwischen den drei Mäuse-Linien zu erkennen (p > 0,05, Abb. 11B).

Abb. 11 Immunhistochemische Analyse der serotonergen Neurone bei P15,5 Mäusen in verschiedenen Mäuse-Linien. A: Die Immunfärbung der Hirnschnitte wurde mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (1:10000) durchgeführt. Die Maßstäbe entsprechen 200 µm in A;
B: Quantifizierung der serotonergen Neurone. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben
(n = 6). Statistische Auswertung wurde mittels one-way ANOVA mit dem Tukey’s post hoc-Test durchgeführt (p > 0,05).


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4.4.3  Vergleich der Entwicklung der serotonergen Fasern in den Projektionsregionen bei den verschiedenen Mäuse-Linien

Die Axone der serotonergen Neurone in den rostralen Raphe Nuclei projizieren aufsteigend ins Vorderhirn und Mittelhirn. In diesen Projektionsgebieten verfolgten wir daher die Entwicklung und Verteilung serotonerger Fasern in den verschiedenen Entwicklungsstadien mit immunhistochemischer Methode bei KO, WT und ÜE Mäusen.

4.4.3.1 Verteilung und Dichte der serotonergen Fasern zum Zeitpunkt E12,5

Bei E12,5 Mäusen waren serotonerge Projektionen bei allen drei Mäuse-Linien schon nachweisbar. Aber die Dichte der immunreaktiven serotonergen Fasern waren bei KO und ÜE Mäusen viel geringer als die bei WT Mäusen. In der Abb. 12 sind die serotonergen Fasern der drei verschiedenen Mäuse-Linien zum Zeitpunkt E12,5 gezeigt. Bei WT Mäusen waren im mesencephalen Tegmentum (MeT) wesentlich mehr serotonerge Fasern erkennbar als bei KO und ÜE Mäusen, besonders wenig serotonerge Fasern waren bei ÜE Mäusen in dieser Region entwickelt. Wie aus der Abb. 12C hervorgeht, war die serotonerge Innervierung in den Raphe Regionen vergleichbar zwischen den drei Mäuse-Linien.

4.4.3.2 Entwicklung und Verteilung der serotonergen Fasern im cerebralen Cortex

In den Entwicklungsstadien E12,5 und E14,5 waren die serotonergen Fasern im cerebralen Cortex der drei Mäuse-Linien mit der immunhistochemischen Technik noch nicht detektierbar. Bei E16,5 Embryonen waren serotonerge Fasern im cerebralen Cortex schon deutlich erkennbar. Von E16,5 bis E18,5 erschien die serotonerge Innervierung des cerebralen Cortex bei WT Mäusen etwas ausgeprägter als die bei KO und ÜE Mäusen, während von P1,5 bis P15,5 die serotonerge Innervierung zwischen den drei Mäuse-Linien vergleichbar war (Abb. 13).


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Abb. 12 Immunreaktivität der serotonergen Fasern zum Zeitpunkt E12,5 in verschiedenen Mäuse-Linien. Die Immunfärbungen der Hirnschnitte wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen
5-HT (1:5000) durchgeführt. A: Die serotonergen Fasern im MeT; B: Die koronaren Hirnschnitte in der Raphe; C: Die serotonergen Neurone im Nucleus raphe dorsalis (DRN). Die Maßstäbe entsprechen 100 µm in A; 300 µm in B ; 50 µm in C.


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Abb. 13 Immunreaktivität der serotonergen Fasern im cerebralen Cortex der verschiedenen Mäuse-Linien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Die Immunfärbung der Hirnschnitte wurde mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (Verdünnung: A - C 1:5000; D 1:10000) durchgeführt. A: E16,5; B: E18,5; C: P1,5; D: P15,5. Die Maßstäbe entsprechen 100 µm in A, B, C und D.

4.4.3.3 Entwicklung und Verteilung der serotonergen Fasern im Hippocampus

Während der Entwicklung von E12,5 bis E16,5 waren noch keine serotonergen Fasern im Hippocampus erkennbar. Erst bei E18,5 erschienen wenige serotonerge Fasern mit schwacher Intensität. Zum Zeitpunkt P15,5 zeigte der Hippocampus eine dichtere serotonerge Innervierung. [Seite 56↓]Zwischen den drei Mäuse-Linien bestanden keine wesentlichen Unterschiede in der Entwicklung der serotonergen Innervierung im Hippocampus (Abb. 14).

Abb. 14 Immunreaktivität der serotonergen Fasern im Hippocampus der verschiedenen Mäuse-Linien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Die Immunfärbungen der Hirnschnitte wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (Verdünnung: A - B 1:5000; C 1:10000) durchgeführt. A: E18,5; B: P1,5; C: P15,5. Die Maßstäbe entsprechen 100 µm in A, B und C.

4.4.3.4 Entwicklung und Verteilung der serotonergen Fasern im Septum

Serotonerge Fasern im Septum waren bei E12,5 Embryonen der drei Mäuse-Linien mit Immunfärbung nicht detektierbar. Von E14,5 an konnten serotonerge Fasern im Septum erkannt werden. Zum Zeitpunkt E14,5 waren nur wenige immunreaktive Fasern nachweisbar, während bei E16,5 Embryonen die Dichte der immunreaktiven Fasern deutlich zunahm. Es fielen aber keine wesentlichen Unterschiede zwischen den verschiedenen Mäuse-Linien auf.


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Abb. 15 Immunreaktivität der serotonergen Fasern im Septum der verschiedenen Mäuse-Linien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Die Immunfärbungen der Hirnschnitte wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (Verdünnung: A - D 1:5000; E 1:10000) durchgeführt. A: E14,5; B: E16,5; C: E18,5; D: P1,5; E: P15,5. Die Maßstäbe entsprechen 200 µm in A, B, C, D und E.


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4.4.3.5  Entwicklung und Verteilung der serotonergen Fasern im Striatum

Von E12,5 bis P1,5 war im Striatum noch keine serotonerge Innervierung immunhistochemisch erkennbar. Zum Zeitpunkt P15,5 waren die serotonergen Fasern mittels immunhistochemischer Methode sehr gut detektierbar. Es waren keine wesentlichen Unterschiede zwischen den drei Mäuse-Linien zu erkennen (Abb. 16).

Abb.16 Immunreaktivität der serotonergen Fasern im Striatum bei P15,5 Mäusen. Die Immunfärbung der Hirnschnitte wurde mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen 5-HT (Verdünnung: 1:10000) durchgeführt. Die Maßstäbe entsprechen 300 µm in A und 100 µm in B.

4.4.4 Immunreaktivität der TPH im dorsalen Raphe Nucleus

TPH ist das die Syntheserate bestimmende Enzym bei der Synthese von 5-HT aus Tryptophan. Untersucht wurde auch die Immunreaktivität der TPH bei P15,5 KO, WT und ÜE Mäusen mit einem monoklonalen Antikörper gegen TPH (Verdünnung 1:2000). Wesentliche Unterschiede bezüglich der TPH - positiven Neurone waren bei den drei Mäuse-Linien nicht zu erkennen (Abb. 17). Zum Zeitpunkt P1,5 konnte mit dem von uns verwendeten Antikörper auch bei Einsatz eines höheren Antikörpertiters (1:500) keine Immunreaktion ausgelöst werden.


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Abb. 17 Immunreaktivität der TPH in den Raphe Nuclei bei den verschiedenen Mäuse-Linien. Die TPH positive Neurone wurden mit einem monoklonalen (Maus) Antikörper gegen TPH untersucht. Die Maßstäbe entsprechen 200 µm.

4.4.5 Vergleich der catecholaminergen Neurone in den drei Mäuse-Linien

Die Zellkörper der dopaminergen Neurone sind hauptsächlich in der Substantia nigra compacta (SNC) und im ventralen tegmentalen Areal (VTA), die sich nahe nebeneinander im Mesencephalon befinden, lokalisiert. Dopaminerge Zellen sind auch im Bulbus olfactorius vorhanden. Die Axone projizieren in das Striatum, in limbische und frontale corticale Regionen. Die Zellkörper der noradrenergen Neurone sind im Locus coeruleus (LC) lokalisiert. Wir konzentrierten uns daher auf diese Hirnregionen.

4.4.5.1 Entwicklung der dopaminergen Neurone im Bulbus olfactorius

Im Bulbus olfactorius bestand eine ausgeprägte TH Immunreaktivität. Die Immunreaktivität der Neurone waren in den drei Mäuse-Linien während der jeweiligen Entwicklungsstadien vergleichbar (Abb. 18).


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4.4.5.2  Entwicklung der dopaminergen Neurone in der Substantia nigra compacta
und dem ventralen Tegmentum der drei Mäuse-Linien

Sowohl in der Substantia nigra compacta als auch im ventralen Tegmentum konnten intensiv angefärbte TH-immunreaktive Neurone und Fasern detektiert werden. Während der Entwicklungsstadien waren keine wesentlichen Unterschiede im Nachweis der dopaminergen Neurone und Fasern in der Substantia nigra und im ventralen Tegmentum zwischen den drei Mäuse-Linien zu erkennen. Nur zum Zeitpunkt E12,5 war die Immunreaktivität in der Substantia nigra bei WT Embryonen etwas stärker ausgeprägt (Abb. 19).

4.4.5.3 Entwicklung der noradrenergen Neurone in den drei Mäuse-Linien

Die Lokalisation der noradrenergen Neurone im LC wurde auch mittels einer anti-TH­Immunfärbung gezeigt. Wie in den dopaminergen Neuronen des Mesencephalons war die Immunreaktivität der noradrenergen Neurone im LC auch sehr intensiv. In dem frühen Entwicklungsstadium (E12,5) waren bereits einige immunreaktive Zellen erkennbar. Die Zahl der Zellen nahm kontinuierlich zu. Aus der Abb. 20 geht hervor, dass zu Zeitpunkten E14,5, E16,5, E18,5 und P1,5 die Immunfärbung der noradrenergen Neurone im LC zwischen den drei verschiedenen Mäuse-Linien vergleichbar war. Im Vergleich zu den WT und KO Mäusen war die Immunreaktivität bei P15,5 ÜE Mäusen am stärksten erkennbar (Abb. 20).


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Abb. 18 Immunreaktivität der dopaminergen Neurone im Bulbus olfactorius bei den verschiedenen Mäuse-Linien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Die koronaren Hirnschnitte wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen TH (Verdünnung: A - D 1:500; E 1:2000) untersucht.
A: E14,5; B: E16,5; C: E18,5; D: P1,5; E: P15,5. Die Maßstäbe entsprechen 50 µm in A und B; 100 µm in C, D und E.


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Abb. 19 Immunreaktivität der dopaminergen Neurone und Fasern bei den verschiedenen Mäuse-Linien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Die koronaren Hirnschnitte wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen TH (Verdünnung: A - E 1:500; F 1:2000) untersucht. Die TH positiven Neurone und Fasern wurden in der Substantia nigra compacta (SNC) und dem ventralen Tegmentum (VTA) gefärbt. A: E12,5; B: E14,5; C: E16,5; D: E18,5; E: P1,5; F: P15,5. Die Maßstäbe entsprechen 100 µm in A und B; 200 µm in C, D, E und F.


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Abb. 20 Immunreaktivität der noradrenergen Neurone bei KO, WT und ÜE Mäusen in verschiedenen Entwicklungsstadien. Die noradrenergen Neurone im LC wurden mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen TH (Verdünnung:A - D 1:500; E 1:2000) untersucht. A: E14,5; B: E16,5; C: E18,5;
D: P1,5; E: P15,5. Die Maßstäbe entsprechen 200 µm in A, B, C, D und E.


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4.4.6  Vergleich des S100β Proteins im Gehirn der verschiedenen Mäuse-Linien zum Zeitpunkt P15,5

S100β Protein, ein neurotropher Faktor, ist in Glialzellen lokalisiert und wurde in der vorliegenden Arbeit mit einem monoklonalen (Maus) Antikörper (Verdünnung 1:2000) in koronaren Hirnschnitten bei P15,5 Mäusen untersucht. Die S100β Protein positiven Glialzellen zeigten im Hippocampus und Striatum eine starke Immunreaktion. Bei ÜE Mäusen waren mehr positive Glialzellen in beiden Regionen erkennbar als bei WT und KO Mäusen (Abb. 21). Zum Zeitpunkt P1,5 konnte mit dem von uns verwendeten Antikörper auch bei Einsatz eines höheren Antikörpertiters (1:500) keine Immunreaktion ausgelöst werden.

4.4.7 Vergleich von MBP im Gehirn der drei Mäuse-Linien zum Zeitpunkt P15,5

Das MBP wurde mittels Immunhistochemie bei P15,5 Mäusen nachgewiesen. Die Immunreaktivität der MBP hältigen Fasern war im Frontalcortex, Hippocampus und Septum besonders hoch. Wesentliche Unterschiede waren zwischen den drei verschiedenen Mäuse­ Linien nicht zu erkennen (Abb. 22). Mit dem von uns verwendeten Antikörper auch bei Einsatz eines höheren Antikörpertiters (1:500) konnte keine Immunreaktion von MBP zum Zeitpunkt P1,5 detektiert werden.


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Abb. 21 Immunreaktivität des S100β Proteins in den Glialzellen bei P15,5 KO, WT und ÜE Mäusen.
A-B: S100β Protein positive Glialzellen im Striatum (Caudatus/Putamen, CPu). C-D: S100β Protein positive Glialzellen im Hippocampus (Hip). Bei ÜE Mäusen waren mehr Glialzellen gefärbt. Der Pfeil zeigt S100β Protein positive Glialzelle. Das Rechteck demonstriert die Region der Vergrößerung. Die Maßstäbe entsprechen 300 µm A und C; 50 µm in B und D.


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Abb. 22 Immunreaktivität von MBP bei den verschiedenen P15,5 Mäuse-Linien. Die koronaren Hirnschnitte wurden mit einem monoklonalen (Maus) Antikörper (Verdünnung 1:2000) gegen MBP untersucht. Die starke Immunfärbung der MBP Fasern wird im Hippocampus, Frontalcortex und Septum der verschiedenen Mäuse-Linien gezeigt. A, B: Hippocampus (Hip), C: Septum (Spt); D, E: Frontalcortex (Fro). Das Rechteck zeigt den Ausschnitt der Vergrößerung im Hippocampus und Frontalcortex . Die Maßstäbe entsprechen 500 µm in A und D; 100 µm in B und E; 300 µm in C.


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4.5  Proteinexpression bei verschiedenen Entwicklungsstadien im Gehirn der drei Mäuse­Linien

4.5.1 Western Blot-Analyse des TH Proteins

Bei der Western Blot-Analyse war im Homogenat des Gesamthirns nach Behandlung mit einem polyklonalen (Kaninchen) Antikörper gegen TH eine spezifische Bande bei 56 kDa ab E12,5 detektierbar. In der Abb. 23A ist die Bande des TH Proteins von E12,5 bis P15,5 bei den verschiedenen Mäuse-Linien dargestellt. Die Banden von 3 – 4 verschiedenen Homogenaten wurden mittels LabImage® Software zur Analyse und Dokumentation von Elektrophorese­ Gelen (Kapelan) semiquantifiziert, wobei keine signifikanten Unterschiede zwischen den Mäuse­Linien zu erkennen waren (Abb. 23B).

Abb. 23 Nachweis des TH Proteins bei KO, WT und ÜE Mäusen in den verschiedenen Entwicklungsstadien mittels Western Blot. A: TH Banden von 56 kDa. Pro Geltasche wurden gleiche Mengen Proteine (jeweils 30 μg) in einem 10% SDS-PAGE aufgetragen, geblottet und mit einem polyklonalem anti-TH Antikörper inkubiert. B: Die Semiquantifizierung der Banden erfolgte mittels LabImage® Software (n = 3 – 4; p > 0,05).

4.5.2 Western Blot-Analyse verschiedener synaptischer, vesikel-relevanter Proteine

Die Detektierung von verschiedenen synaptischen, vesikel-relevanten Proteinen erfolgte mittels Western Blot mit spezifischen Antikörpern. Synaptobrevin hat eine typische Bande im Blot bei 18 kDa, SNAP-25 bei 25 kDa, Synaptophysin bei 38 kDa und Synaptotagmin bei 65 kDa. Die Banden wurden mit LabImage® Software zur Analyse und Dokumentation von Elektrophorese­[Seite 68↓]Gelen (Kapelan) semiquantifiziert. In den Gehirnen von E12,5 KO, WT und ÜE Mäusen konnte Synaptophysin nicht detektiert werden. Die Immunreaktivität der Banden von Synaptobrevin, Synaptotagmin und SNAP-25 waren bei WT Mäusen intensiver als die bei KO und ÜE Mäusen. Von E14,5 bis zum P15,5 war die Intensität der Immunreaktivität von Synaptobrevin und Synaptophysin bei den drei Mäuse-Linien vergleichbar (Abb. 24). Die Semiquantifizierung der Banden von drei verschiedenen Homogenaten / Gruppe ergab keine signifikanten Unterschiede (Ergebnisse nicht gezeigt).

Abb. 24 Nachweis verschiedener synaptischer, vesikel-relevanter Proteine bei den verschiedenen Mäuse­Linien in unterschiedlichen Entwicklungsstadien mittels Western Blot. A: Proteinbanden von Synaptobrevin (Syb), SNAP-25, Synaptophysin (Syp), und Synaptotagmin (Syt) bei E12,5 und E14,5 Mäusen. B: Semiquantifizierung der Banden bei den E12,5 Mäusen mittels LabImage® Software zur Analyse und Dokumentation von Elektrophorese-Gelen (Kapelan); n = 3, *p< 0,05 vs WT.
C: Synaptobrevin Proteine von E12,5 bis P15,5. D: Synaptophysin Proteine von E14,5 bis P15,5.


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4.5.3  Western Blot-Analyse von MBP

Die Expression von MBP im Gehirn wurde mittels Western Blot bei den drei Mäuse-Linien untersucht. Zum Zeitpunkt P15,5 wurde MBP im Homogenat des Gesamthirns mit dem monoklonalen (Maus) MBP Antikörper (Verdünnung 1:2000) als spezifische Bande bei 27 kDa detektiert. Zwischen den drei Mäuse-Linien waren keine wesentlichen Unterschiede zu erkennen (Abb. 25). Zu einem früheren Zeitpunkt (P1,5) war das MBP mittels Western Blot bei Einsatz eines höheren Antikörpertiters (1:1000) noch nicht detektierbar.

Abb.25 Nachweis von MBP bei den verschiedenen Mäuse-Linien im Western Blot zum Zeitpunkt P15,5. Die MBP Bande von 27 kDa ist gezeigt. 20 μg Protein wurden pro Tasche aufgetragen und die Membran mit monoklonalem anti-MBP (1:2000) inkubiert. Die Zahlen an der rechten Seite geben den SDS-PAGE Standard in kDa an.

4.6 Quantitative Bestimmung der Monoamin-Transmitter und deren Metabolite im Gehirn der KO, WT und ÜE Mäuse mittels HPLC-ED

4.6.1 Unterschiedliche Gewebskonzentrationen von 5-HT und 5-HIAA im
Gehirnwährend der verschiedenen Entwicklungsstadien

Von E12,5 bis P1,5 erfolgte die Bestimmung von 5-HT und 5-HIAA im Homogenat des Gesamthirns, während bei den P15,5 Gehirnen verschiedene Subregionen untersucht wurden. In der Abb. 26 wird gezeigt, dass die Konzentrationen / mg Gewebe von 5-HT und 5-HIAA der verschiedenen Mäuse-Linien von E12,5 bis P1,5 allmählich zunahmen. Bei E12,5 Embryonen waren die Konzentrationen von 5-HT zwischen den drei Mäuse-Linien vergleichbar, während die Konzentrationen von 5-HIAA bei ÜE Mäusen höher als bei KO Mäusen waren. Zum Zeitpunkt E14,5 waren die Konzentrationen von 5-HT und 5-HIAA zwischen den drei Mäuse­[Seite 70↓]Linien vergleichbar. Bei E16,5 Embryonen waren die Konzentrationen von 5-HT bei ÜE Mäusen höher als bei WT und KO Mäusen und zwischen den WT und KO Mäusen vergleichbar; bei den Konzentrationen von 5-HIAA waren keine wesentlichen Unterschiede zwischen den drei Mäuse-Linien erkennbar. Zum Zeitpunkt E18,5 waren die Konzentrationen von 5-HT bei ÜE Mäusen höher als bei WT Mäusen, während die Konzentrationen von 5-HIAA bei KO Mäusen höher als bei WT Mäusen waren. Zwischen ÜE und KO Mäuse bestanden keine signifikanten Unterschiede. Bei P1,5 ÜE Mäusen waren die Gewebsspiegel von 5-HT und 5-HIAA höher als bei WT und KO Mäusen. Auch bei KO Mäusen waren die Konzentrationen von 5-HT und
5-HIAA höher als bei WT Mäusen (Abb. 26A und B). Der Turnover von 5-HT, berechnet aus der molaren Ratio von 5-HIAA/5-HT waren von E12,5 bis E18,5 zwischen den drei Mäuse­Linien vergleichbar. Zum Zeitpunkt P1,5 war der Turnover von 5-HT sowohl bei KO Mäusen als auch bei ÜE Mäusen höher als bei WT Mäusen (Abb. 26C).

Abb.26 Vergleich der Gewebsspiegel von 5-HT und 5-HIAA im Gehirn während der Entwicklungs­stadien von E12,5 bis P1,5 bei den verschiedenen Mäuse-Linien. A: 5-HT (pg/mg Hirngewebe).
B: 5-HIAA (pg/mg Hirmgewebe). C: Molare Ratio von 5-HIAA/5-HT. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (n=6). Statistische Auswertung wurde mittels one-way ANOVA mit dem Tukey’s post hoc-Test durchgeführt. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.


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4.6.2  Unterschiedliche Gewebskonzentrationen von DA und NA im Gehirn während der Entwicklungsstadien

In der Entwicklungsstadien E12,5 bis P1,5 nahmen die Konzentrationen von DA und NA im Gehirn bei den drei Mäuse-Linien zu. Von E12,5 bis E18,5 waren keine wesentlichen Unterschiede zwischen den drei Mäuse-Linien zu erkennen. Zum Zeitpunkt P1,5 waren die Konzentrationen von DA und NA bei ÜE Mäusen höher als bei WT und KO Mäusen
(Abb. 27).

Abb. 27 Vergleich der Konzentrationen von DA und NA im Gehirn während der Entwicklungsstadien bei den verschiedenen Mäuse-Linien. A: DA (pg/mg Hirngewebe) B: NA (pg/mg Hirngewebe). Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (n=6). Statistische Auswertung wurde mittels one-way ANOVA mit dem Tukey’s post hoc-Test durchgeführt. ** p < 0,01, *** p < 0,001.

4.6.3 Bestimmung der Gewebskonzentrationen von 5-HT und 5-HIAA in verschiedenen Hirnregionen bei den drei Mäuse-Linien zum Zeitpunkt P15,5

Bei den Gehirnen der P15,5 Mäuse wurden verschiedenen Regionen wie Bulbus olfactorius, Frontalcortex, Striatum, Hippocampus, Hypothalamus präpariert und in den jeweiligen Regionen die Konzentrationen von 5-HT und 5-HIAA gemessen. Im Hypothalamus waren die Gewebsspiegel von 5-HT und 5-HIAA im Vergleich zu den anderen Regionen am höchsten. Die 5-HT Konzentrationen waren bei ÜE Mäusen höher als bei WT und KO Mäusen und auch bei KO Mäusen höher als die bei WT Mäusen, wobei die Konzentrationen von 5-HIAA bei WT Mäusen niedriger waren als bei KO und ÜE Mäusen. Im Striatum waren die Konzentrationen von 5-HT und 5-HIAA bei KO Mäusen höher als die bei WT Mäusen. In den weiteren [Seite 72↓]untersuchten Regionen gab es keine wesentlichen Unterschiede bezüglich der Konzentrationen von 5-HT und 5-HIAA zwischen den drei Mäuse-Linien (Abb. 28A und B). Der Turnover von
5-HT war nur im Bulbus olfactorius bei KO Mäusen höher als bei WT und ÜE Mäusen und in den von uns untersuchten Subregionen zwischen den drei Mäuse-Linien vergleichbar
(Abb. 28C).

Abb.28 Vergleich der Konzentrationen von 5-HT und 5-HIAA und der Turnover von 5-HT in verschiedenen Hirnregionen zwischen P15,5 KO, WT und ÜE Mäusen. Die Bestimmung erfolgte in den Regionen Bulbus olfactorius (OB), Frontalcortex (Fro), Striatum (Caudatus/Putamen, CPu), Hippocampus (Hip) und Hypothalamus (Hyp). A: 5-HT (pg/mg Hirngewebe) B: 5-HIAA (pg/mg Hirngewebe). C: Molare Ratio von 5-HIAA / 5-HT. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben
(n = 6). Statistische Auswertung wurde mittels one-way ANOVA mit dem Tukey’s post hoc-Test durchgeführt; * p < 0,05, ** p < 0,01.


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4.6.4  Bestimmung der Konzentrationen von DA, DOPAC und NA in verschiedenen Hirnregionen bei den drei Mäuse-Linien zum Zeitpunkt P15,5

Die Konzentrationen von DA, DOPAC und NA wurden im Gehirn der P15,5 Mäuse in den Regionen Bulbus olfactorius, Frontalcortex, Striatum, Hippocampus, Hypothalamus untersucht (Abb. 29). Die Konzentrationen von DA waren im Striatum am höchsten im Vergleich zu den anderen Regionen und bei KO Mäusen höher als die bei WT und ÜE Mäusen. Im Frontalcortex konnte DA nicht detektiert werden. In anderen Regionen waren die Gewebsspiegel von DA zwischen den drei Mäuse-Linien vergleichbar. Bezüglich der Konzentrationen von DOPAC im Striatum gab es keine wesentlichen Unterschiede zwischen den KO, WT und ÜE Mäusen. Im Bulbus olfactorius, Frontalcortex, Hippocampus, und Hypothalamus waren nur geringe DOPAC­Spiegel detektierbar und in den drei Mäuse-Linien vergleichbar.

Die höchste NA Gewebsspiegel aller Regionen wurden im Hypothalamus gefunden. Die Konzentrationen von NA waren bei ÜE Mäusen höher als bei WT und KO Mäusen. Im Striatum war NA nicht detektierbar. In den anderen Regionen waren keine signifikanten Unterschiede zwischen den drei Mäuse-Linien erkennbar.


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Abb. 29 Vergleich der Konzentrationen von DA, DOPAC und NA in verschiedenen Hirnregionen zwischen P15,5 KO, WT und ÜE Mäusen. Die Bestimmung erfolgte in den Regionen Bulbus olfactorius (OB), Frontalcortex (Fro), Striatum (Caudatus/Putamen, CPu), Hippocampus (Hip) und Hypothalamus (Hyp). A: DA (pg/mg Hirngewebe) B: NA (pg/mg Hirngewebe). C: DOPAC (pg/mg Hirngewebe). Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM angegeben (n = 6). Statistische Auswertung wurde mittels one-way ANOVA mit dem Tukey’s post hoc-Test durchgeführt; * p < 0,05.


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03.02.2004