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5  DISKUSSION

5.1 Unterschiedliche Expression des 5-HT1A Rezeptors bei den drei Mäuse-Linien

In der vorliegenden Arbeit haben wir Rezeptorautoradiographie mit dem selektiven Radioligand [H3]8-OH-DPAT durchgeführt, um Unterschiede in der Expression des 5-HT1A Rezeptors bei den drei Mäuse-Linien nachzuweisen. Bei P15,5 KO Mäusen war keine Liganden-Bindung, sowohl in der Raphe, als auch im Cortex, Hippocampus und Septum zu erkennen. Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht nur die präsynaptischen, sondern auch die postsynaptischen
5-HT1A Rezeptoren bei den KO Mäusen inaktiv waren. Dies stimmt mit den an adulten KO Mäusen erhobenen Autoradiographie-Ergebnissen überein (Ramboz et al., 1998; Heisler et al., 1998; Parks et al., 1998). Bei den Gehirnen der ÜE Mäuse waren die Dichte der Rezeptorbindung für den 5-HT1A Rezeptor nur zum Zeitpunkt P1,5 im Septum, Hippocampus und Cortex höher als die bei WT Mäusen. Kusserow et al (2003) haben nachgewiesen, dass die Expression des endogenen 5-HT1A Rezeptors zum Zeitpunkt P7,5 nicht mehr eindeutig höher als bei WT Mäusen ist. Diese Untersuchungen zeigen, dass eine Überexpression des 5-HT1A Rezeptors nur vorübergehend in der früheren postnatalen Periode besteht und in der späteren Entwicklung möglicherweise kompensiert wird. Auch bei der adulten ÜE Maus konnten Kusserow et al. (2003) keine Unterschiede in der Rezeptorautoradiographie zwischen ÜE und WT Mäusen finden. Bei KO Mäusen konnte durch eine gewebsspezifische und konditionelle Wiederherstellung der Expression des 5-HT1A Rezeptors während der frühpostnatalen Phase das erhöhte Angstverhalten wieder normalisiert werden (Gross et al., 2002). Diese Studie zeigt, dass die Expression des 5-HT1A Rezeptors während der frühpostnatalen Perioden sehr wichtig für die Etablierung des normalen Angstverhaltens in der adulten Maus ist.

5.2 Entwicklung des serotonergen Systems im Gehirn bei den drei Mäuse-Linien

5.2.1 Generelle Entwicklung des Gehirns

Als grobes Mass für die embryonale Entwicklung des Gehirns wurden das Gewicht und die Morphologie der Gehirne herangezogen. Das Gewicht der Gehirne war zwischen KO, WT und ÜE Mäusen während der Entwicklungsperioden von E12,5 bis P1,5 vergleichbar. Bezüglich der KO Mäuse entspricht dieser Befund den bei adulten Tieren beschriebenen Ergebnissen (Heisler et al., 1998). In dieser Studie wurde gezeigt, dass das Hirngewicht der adulten Mäuse zwischen WT, heterozygoten und homozygoten KO Mäusen vergleichbar war. Dies ist ein grober Hinweis [Seite 76↓]dafür, dass die generelle Entwicklung des Gehirns durch die transgenen Veränderungen nicht wesentlich beeinflusst wird. Auch die in den histologischen Untersuchungen erhobenen Befunde zeigen bei den drei Mäuse-Linien keine wesentlichen Unterschiede im Aufbau des Gehirns während der verschiedenen Entwicklungsphasen. Die histologische Architektur des Gehirns entsprach bei allen drei Mäuse-Linien den von Jacobowitz und Abbott (1997) gezeigten Strukturen des sich entwickelnden Mäusehirns.

5.2.2 Embryonale und frühpostnatale Entwicklung des serotonergen Systems

Es ist bekannt, dass bei der Maus serotonerge Neurone erstmalig zum Zeitpunkt E 11,5 erkennbar sind (Briscoe et al., 1999). Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnte festgestellt werden, dass die Zellkörper der serotonergen Neurone zum Zeitpunkt E12,5 in den Raphe Nuclei sowohl bei KO als auch bei ÜE Mäusen in gleichem Ausmaß wie bei WT Mäusen entwickelt sind. Es waren auch keine wesentlichen Unterschiede in Bezug auf die weitere Entwicklung der serotonergen Neurone in den verschiedenen Raphekernen während der Entwicklungsperioden von E14,5 bis P1,5 zwischen den drei Mäuse-Linien zu erkennen. Zum Zeitpunkt P15,5 konnten die mittels des 5-HT-Antikörpers gewonnen histochemischen Befunde durch die Immunhistochemie unter Anwendung eines TPH-Antikörpers bestätigt werden. Zu diesem Zeitpunkt wurde auch eine Zählung der 5-HT positiven Zellen durchgeführt und kein signifikanter Unterschied in der Zellzahl zwischen den drei Linien gefunden. Dies spricht dafür, dass weder das Fehlen des 5-HT1A Rezeptors noch dessen Überexpression die Zahl der sich in der Raphe differenzierenden serotonergen Zellen beeinflusst.

Bezüglich der Entwicklung der serotonergen Projektionen in die jeweiligen Zielregionen haben wir folgende Beobachtungen gemacht. Zum Zeitpunkt E12,5 waren bereits serotonerge Projektionen in das mesencephale Tegmentum und in den Hypothalamus erkennbar, wobei die serotonergen Fasern in diesen Projektionsgebieten bei WT Mäusen dichter erschienen als bei KO und ÜE Mäusen (Abb.12). Zum Zeitpunkt E14,5 begann die serotonerge Innervierung im Septum, zum Zeitpunkt E16,5 waren erstmalig serotonerge Projektionen im Cortex sichtbar und erst zum Zeitpunkt E18,5 erreichte die serotonerge Innervierung den Hippocampus. Im Septum und Hippocampus entwickelte sich die serotonerge Innervierung sowohl bei KO Mäusen als auch bei ÜE Mäusen in gleichem Umfang wie bei WT Mäusen, während im Cortex die serotonerge Innervierung von E16,5 bis E18,5 bei WT Mäusen dichter als bei KO und ÜE Mäusen erschien. Diese Projektionsunterschiede im Cortex zwischen den drei Mäuse-Linien [Seite 77↓]waren von P1,5 an nicht mehr erkennbar. Diese Befunde weisen darauf hin, dass sowohl das Fehlen des 5-HT1A Rezeptors als auch dessen Überexpression zwar keinen Einfluss auf die Differenzierung der serotonergen Neurone hat, aber möglicherweise die anfängliche Entwicklung der Projektionen in das mesencephale Tegmentum, den Hypothalamus und den Cortex cerebri verzögert.

Die Entwicklung des serotonergen Systems wurde auch anhand der Konzentration seines Neurotransmitters und dessen Hauptmetaboliten verfolgt. Während der Entwicklungsperioden von E12,5 bis P1,5 nahmen bei allen drei Mäuse-Linien die Spiegel von 5-HT und 5-HIAA pro mg Gewebe im Gesamthirn kontinuierlich zu. Es traten jedoch bei den transgenen Tieren eine Reihe von signifikanten Unterschieden in der Höhe der Gewebsspiegel auf. Bei KO Mäusen beobachteten wir folgende Unterschiede der Gewebsspiegel von 5-HT und 5-HIAA im Vergleich zu WT Mäusen: von E12,5 bis E16,5 waren die Gewebsspiegel von 5-HT und 5-HIAA zwischen WT und KO Mäusen vergleichbar. Zum Zeitpunkt E18,5 waren nur die Gewebsspiegel von
5-HIAA bei KO Mäusen höher als bei WT Mäusen. Zum Zeitpunkt P1,5 waren sowohl 5-HT als auch 5-HIAA Spiegel bei KO Mäusen höher als bei WT Mäusen. Auch der Turnover von 5-HT war zu diesem Zeitpunkt erhöht. Zum Zeitpunkt P15,5 wurden die Gewebsspiegel von 5-HT und 5-HIAA in verschiedenen Zielregionen des serotonergen Systems gemessen. Im Hypothalamus und Striatum waren die beiden Gewebsspiegel bei KO Mäusen höher als bei WT Mäusen. Der Turnover von 5-HT war nur im Bulbus olfactorius erhöht. Diese Ergebnisse stimmen teilweise mit den Befunden bei adulten Tieren überein (Ase et al. 2000). Bei den adulten KO Mäusen wurden im Vergleich zu WT Tieren erhöhte 5-HT-Spiegel z.B. im Cortex cinguli und Rückenmark gefunden, erhöhte 5-HIAA-Spiegel in dem Bulbus olfactorius, dem Thalamus, der Raphe, der Substantia nigra und dem Locus coeruleus und ein erhöhter 5-HT Turnover in dem Bulbus olfactorius, der Substantia nigra und dem Locus coeruleus. Die Ursache der erhöhten Gewebsspiegel von 5-HT und 5-HIAA in verschiedenen Hirnregionen der KO Mäuse ist wahrscheinlich das Fehlen des 5-HT1A Autorezeptors, und die daraus resultierende Enthemmung der serotonergen Neurone und Zunahme der tonischen Aktivität der serotonergen Neurone und des Turnovers von 5-HT in der Raphe und den serotonerg innervierten Regionen (Ase et al., 2000). Dementsprechend berichteten Richer et al. (2002), dass die Aktivität der serotonergen Neurone in der dorsalen Raphe bei KO Mäusen im Vergleich zu den WT Mäusen um etwa 90% erhöht war. In weiteren Studien wurden hingegen über normale Gewebsspiegel von 5-HT und
5-HIAA bei KO Mäusen berichtet (Ramboz et al., 1998; Heisler et al., 1998). Auch in in vivo Mikrodialyse-Studien wurden unterschiedliche Ergebnisse bei KO Mäusen gefunden. He et al. [Seite 78↓](2001) zeigten, dass die basale extrazelluläre Konzentration von 5-HT bei KO Mäusen im Striatum unverändert war, während in einer anderen Studie eine Erhöhung der
5-HT-Spiegel im Dialysat im Frontalcortex und Hippocampus im Vergleich zu den WT Mäusen gemessen wurde (Parsons et al. 2001). Die Ergebnisse unserer Studie zeigen, dass eine erhöhte serotonerge Aktivität bereits in der späten embryonalen und insbesondere frühpostnatalen Entwicklungsphase bei KO Mäusen besteht.

Bei ÜE Mäusen wurden folgende Unterschiede der Gewebsspiegel von 5-HT und 5-HIAA während den Entwicklungsperioden im Vergleich zu den WT Mäusen beobachtet: die Gewebsspiegel von 5-HT waren von E12,5 bis E14,5 zwischen ÜE und WT Mäusen vergleichbar und von E16,5 bis P1,5 bei ÜE Mäusen höher als bei WT Mäusen; die Gewebsspiegel von 5-HIAA waren von E12,5 bis E18,5 zwischen WT und ÜE Mäusen vergleichbar; zum Zeitpunkt P1,5 bestand jedoch eine massive Erhöhung des 5-HIAA-Spiegels und des 5-HT-Turnovers bei ÜE Mäusen. Zum Zeitpunkt P15,5 waren die Gewebsspiegel von
5-HT und 5-HIAA nur im Hypothalamus bei ÜE Mäusen höher als bei WT Mäusen, in allen anderen untersuchten Regionen jedoch mit den WT Mäusen vergleichbar. Die massive Erhöhung der serotonergen Aktivität in der frühpostnatalen Phase korreliert sehr gut mit der in der Rezeptorautoradiographie nachweisbaren transienten Erhöhung der Expression des 5-HT1A Rezeptors. In der weiteren Entwicklung (P15,5) nimmt die Erhöhung der Rezeptorbindung ab und eine Erhöhung der 5-HT und 5-HIAA-Spiegel ist nur im Hypothalamus nachweisbar. Bei adulten ÜE Mäusen wurde von Kusserow et al. (2003) berichtet, dass die Gewebsspiegel von
5-HT im Vergleich zu WT Mäusen nicht nur wie bei P15,5 Mäusen im Hypothalamus, sondern auch im Striatum erhöht waren, im Gegensatz dazu war der 5-HT-Turnover im Hippocampus, Hypothalamus, parietalen Cortex und Striatum niedriger als bei WT Mäusen. Die Erhöhung des 5-HT-Spiegels und die Reduzierung des 5-HT-Turnovers im Vorderhirn sind mit einer Überexpression des 5-HT1A Rezeptors in der Raphe der transgenen Linie vereinbar. Die Reduzierung des 5-HT-Turnovers bei ÜE Mäusen könnte teilweise auch mit einer erhöhten Aktivität des postsynaptischen 5-HT1A Rezeptors zusammenhängen. Eine indirekt Regulation der serotonergen Neurontransmission durch postsynaptische 5-HT1A Rezeptoren in den serotonergen innervierten Regionen wurde in einer Reihe von Studien demonstriert (Hamon et al., 1990; Ceci et al., 1994; Jolas et al., 1995; De Vry, 1995; Hamon, 1997; Barnes und Sharp, 1999; Hajos et al., 1999). Die bei einer Überexpression des 5-HT1A Rezeptors zu erwartende Herabsetzung des 5-HT-Turnovers konnten wir in der postnatalen Phase jedoch nicht bestätigen. Zum Zeitpunkt P1,5 war der Turnover sogar erhöht und bei P15,5 Tieren unverändert. Dies [Seite 79↓]könnte dafür sprechen, dass in dieser Phase der Entwicklung andere Faktoren an der Regulation der Aktivität serotonerger Neurone und 5-HT-Freisetzung beteiligt sind.

Aufgrund der vorliegenden Ergebnisse konnten wir weitere Hinweise dafür finden, dass die frühpostnatale Entwicklungsperiode eine kritische Zeit in der Entwicklung des serotonergen Systems darstellt. Die transiente Erhöhung der Expression des 5-HT1A Rezeptors in der frühpostnatalen Periode assoziiert mit erhöhten 5-HT- und 5-HIAA-Spiegeln könnte einer der Faktoren sein, die das verringerte Angstverhalten in adulten Tieren auslösen (Kusserow et al., 2003). Diese Schlussfolgerung stimmt auch mit den von Gross et al. (2002) erhobenen Befunden bei KO Mäusen nach Wiederherstellung des 5-HT1A Rezeptors in der frühpostnatalen Phase überein.

Paradoxerweise waren die Gewebsspiegel von 5-HT und 5-HIAA und der Turnover von
5-HT zu diesem Zeitpunkt sowohl bei ÜE Mäusen als auch bei KO Mäusen signifikant höher als bei WT Mäusen. Ein ähnlich paradoxes Phänomen wurde auch in einer pharmakologischen Studie an der Ratte beobachtet (Lauder et al., 2000). Sowohl die 5-HT-Entleerung des embryonalen Gehirns durch die Behandlung der trächtigen Ratte mit pCPA von E12 bis E17 als auch die erhöhte Stimulation der 5-HT Rezeptoren des embryonalen Gehirns mit dem nicht-selektiven 5-HT1 / 5-HT2 Rezeptoragonisten 5-Methoxytryptamin führten zur Reduzierung der Expression der 5-HT1A Rezeptor mRNA im Gehirn der P4 Tiere. Dies bedeutet, dass sowohl eine erhöhte als auch eine erniedrigte serotonerge Aktivität während der pränatalen Entwicklung eine signifikante Reduzierung der Expression der 5-HT1A Rezeptor mRNA in der postnatalen Periode zur Folge hat.

5.3 Entwicklung der catecholaminergen Systeme bei den drei Mäuse-Linien

In der vorliegenden Arbeit wurde auch die Entwicklung der catecholaminergen Systeme, die mit dem serotonergen System in engem Zusammenhang stehen, untersucht. Zum Zeitpunkt E12,5 waren die dopaminergen Neurone und Fasern in der Substantia nigra bei WT Mäusen immunhistochemisch weiter entwickelt dargestellt als bei KO und ÜE Mäusen. Ein ähnlicher, aber nicht signifikanter Trend bestand auch hinsichtlich des DA-Spiegels und der im Western Blot gemessenen TH-Proteinkonzentration. Dies deutet darauf hin, dass sich die dopaminergen Neurone und Fasern in der Substantia nigra in den frühen embryonalen Perioden wie zum Zeitpunkt E12,5 nicht nur bei Fehlen des 5-HT1A Rezeptors sondern auch bei dessen Überexpression langsamer als bei WT Mäusen entwickeln. Von E14,5 bis P15,5 war die weitere [Seite 80↓]Entwicklung der dopaminergen Neurone und Fasern nicht nur in der Substantia nigra und im ventralen Tegmentum, sondern auch im Bulbus olfactorius zwischen den drei Mäuse-Linien vergleichbar. Auch bei adulten KO Mäusen wurde mittels TH-Immunhistochemie gezeigt, dass die Verteilung der dopaminergen Neurone in der Substantia nigra und im ventralen Tegmentum der Verteilung bei den adulten WT Mäusen entspricht (Heisler et al., 1998).

In der vorliegenden Untersuchung waren die DA-Spiegel in den embryonalen und frühpostnatalen Perioden (E12,5-P1,5) zwischen WT und KO Mäusen vergleichbar. Dies deutet vielleicht darauf hin, dass die DA Synthese und / oder Freisetzung während dieser Entwicklungsperioden bei Fehlen des 5-HT1A Rezeptors unverändert ist. Zum Zeitpunkt P15,5 hingegen waren die DA-Spiegel im Striatum bei KO Mäusen höher als bei WT Mäusen, während in den weiteren untersuchten Subregionen des Gehirns keine Unterschiede der DA-Spiegel gefunden wurden. Die Erhöhung des DA-Spiegels im Striatum der KO Mäuse war jedoch nicht mit einer Erhöhung des Metaboliten DOPAC assoziiert. Dieses Ergebnis stimmt sehr gut mit der bei adulten KO Mäusen beschriebenen Erhöhung des DA-Spiegels bei unveränderter DOPAC­Konzentration im Striatum überein (Ase et al., 2000). Die von Ase und Mitarbeitern bei adulten KO Mäusen beschriebene Verminderung des DA-Spiegels im Hypothalamus oder Erhöhung des DOPAC-Spiegels im Bulbus olfactorius waren zum Zeitpunkt P15,5 noch nicht nachweisbar. Der Grund für die Erhöhung von DA oder seines Metaboliten wurde von Ase und Mitarbeitern (2000) dahingehend diskutiert, dass die erhöhte Aktivität der serotonergen Neurone im Hirnstamm bei KO Mäusen zur Förderung der Enthemmung der dopaminergen Neurone in der Substantia nigra führen und daraus die Erhöhung von DA im Striatum sowie seinem Metabolit DOPAC in anderen dopaminergen innervierten Hirnregionen wie Bulbus olfactorius oder Substantia nigra resultieren kann. Die fehlenden dopaminergen Veränderungen im Hypothalamus und Bulbus olfactorius bei den P15,5 KO Mäusen zeigen, dass sich die Enthemmung dopaminerger Neurone teilweise erst im späteren Verlauf der Entwicklung des Gehirns einstellt. Andererseits konnte in einer Mikrodialyse-Studie demonstriert werden, dass sowohl die basale als auch die KCl-stimulierte Freisetzung von DA im dorsalen Striatum bei KO Mäusen im Vergleich zu WT Mäusen nicht verändert waren (He et al., 2001).

Bei ÜE Mäusen waren die DA-Spiegel während den Entwicklungsperioden von E12,5 bis P15,5 nur zum Zeitpunkt P1,5 höher als bei WT Mäusen. Dies entspricht dem Zeitpunkt, an dem in der Autoradiographie erhöhte 5-HT1A Rezeptorbindung und auch erhöhte Spiegel von 5-HT und 5-HIAA gefunden wurden. Ein Zusammenhang zwischen erhöhter Aktivierung des 5-HT1A [Seite 81↓]Rezeptors und dopaminerger Aktivität ist bereits aus pharmakologischen Untersuchungen an der adulten Ratte bekannt. Es wurde in in vivo Studien wiederholt gezeigt, dass durch die Behandlung mit 5-HT oder Agonisten des 5-HT1A Rezeptors die basale Freisetzung von DA in unterschiedlichen Hirnregionen wie im Frontalcortex (Tanda et al., 1994; Iyer und Bradberry, 1996; Gobert et al.1998) und im Striatum (Benloucif und Galloway,1991; Benloucif et al., 1993) erhöht war. Eine elektrophysiologische Studie an der Ratte zeigte in vivo, dass die Aktivität dopaminerger Zellen im ventralen Tegmentum durch die Agonisten des 5-HT1A Rezeptors wie
8-OH-DPAT erhöht wurde (Prisco et al., 1994). Dies deutet darauf hin, dass die Aktivierung des 5-HT1A Rezeptors die Enthemmung der dopaminergen Bahnen und Erhöhung der Aktivität der dopaminergen Neurone im ventralen Tegmentum und der Freisetzung von DA im Frontalcortex zur Folge hat (Prisco et al., 1994; Gobert et al., 1998).

Eine ausgeprägte Interaktion besteht auch zwischen den serotonergen und noradrenergen Systemen (Mongeau et al., 1997). So reduziert z.B. eine langfristige Behandlung (21 Tage) mit den selektiven 5-HT Wiederaufnahme-Hemmstoffen (Paroxetin) die Aktivität der noradrenergen Neurone im LC (Szabo et al., 1999; 2000). Andererseits reguliert auch die langfristige Behandlung mit selektiven NA Wiederaufnahme-Hemmstoffen wie Desipramin, Nisoxetin und Reboxetin die Funktion des serotonergen Systems und führt zur Erhöhung der extrazellulären
5-HT Konzentration und Ansprechbarkeit des 5-HT1A Rezeptors in den postsynaptischen Strukturen (Szabo und Blier, 2001; Yoshioka et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit waren von E12,5 bis P15,5 bei Fehlen des 5-HT1A Rezeptors sowohl die Immunreaktivität der noradrenergen Neurone im LC als auch die NA-Spiegel im Gesamthirn (E12,5-P1,5) oder in den untersuchten Subregionen (P15,5) mit denen der WT Mäuse vergleichbar. Diese Ergebnisse stimmen mit den Studien an adulten Tieren überein. Auch bei adulten Mäusen wurde mittels TH­Immunhistochemie nachgewiesen, dass die Immunreaktivität der noradrenergen Neurone im LC bei Fehlen des 5-HT1A Rezeptors der bei WT Mäusen entsprach (Heisler et al., 1998). Bezüglich der NA-Spiegel wurden auch keine wesentlichen Unterschiede zwischen adulten KO und WT Mäusen gefunden (Ramboz et al., 1998). Ase und Mitarbeiter (2000) berichteten, dass die NA­Spiegel bei Fehlen des 5-HT1A Rezeptors in verschiedenen corticalen Regionen, in dem Hippocampus, Hypothalamus und LC unverändert, und nur in dem Bulbus olfactorius, Thalamus, der Substantia nigra und dem Cerebellum im Vergleich zu WT Mäusen erhöht waren. Eine elektrophysiologische Studie zeigte auch, dass das Fehlen des 5-HT1A Rezeptors bei KO Mäusen zwar zur signifikanten Erhöhung der Aktivität der serotonergen Neurone führte, aber die [Seite 82↓]Freisetzung von 5-HT oder NA in den untersuchten Hirnregionen wie im Frontalcortex, Hippocampus und in der Raphe unverändert blieb (Richer et al., 2002). Unsere Befunde bezüglich des noradrenergen Systems während der verschiedenen Entwicklungsphasen als auch die Ergebnisse bei den adulten Mäusen zeigen, dass das Fehlen des 5-HT1A Rezeptors keine wesentlichen Konsequenzen für die Entwicklung und Erhaltung des noradrenergen Systems im ZNS hat. Es könnte daher sein, dass der 5-HT1A Rezeptor keine kritische Rolle in der Interaktion beider monoaminerger Systeme spielt oder der Verlust des 5-HT1A Rezeptors über andere 5-HT Rezeptoren kompensiert werden kann.

Bei ÜE Mäusen beobachteten wir bezüglich des noradrenergen Systems eine signifikante Erhöhung des NA-Spiegels im Gesamthirn zum Zeitpunkt P1,5 und im Hypothalamus zum Zeitpunkt P15,5. Die höheren NA-Spiegel korrelierten auch mit einer stärkeren Immunreaktivität der noradrenergen Neurone und Fasern im LC als bei WT und KO Mäusen zum Zeitpunkt P15,5. Interessanterweise war die Erhöhung des NA-Spiegels im Hypothalamus auch bei adulten ÜE Tieren nachweisbar (Hörtnagl, unveröffentliche Ergebnisse). Auch in pharmakologischen Studien konnte ein Zusammenhang zwischen Aktivierung des 5-HT1A Rezeptors und Aktivität noradrenerger Neurone bewiesen werden. An der adulten Ratte wurde in Mikrodialyse-Studien gezeigt, dass Agonisten des 5-HT1A Rezeptors, wie 8-OH-DPAT, eine Zunahme des extrazellulären NA in verschiedenen Hirnregionen des Vorderhirns wie im Frontalcortex (Gobert et al., 1998), im Hippocampus (Done CJ und Sharp T, 1994; Hajós-Korcsok und Sharp, 1996), im Hypothalamus (Suzuki et al., 1995), und im ventralen Tegmentum (Chen und Reith, 1995) zur Folge haben. Auch mittels Fos-ähnlicher Immunreaktivität, ein Marker der neuronalen Aktivität haben Hajós-Korcsok und Sharp (1999b) einen immunzytochemischen Nachweis erbracht, dass Agonisten des 5-HT1A Rezeptors zur Aktivierung der noradrenergen Neurone im LC und Erhöhung der noradrenergen Neurotransmission in den postsynaptischen Regionen des Vorderhirns wie Frontalcortex führen können. Diese Effekte wurden durch die Vorbehandlung mit Antagonisten des 5-HT1A Rezeptors wie WAY 1000635 blockiert. Zusammenfassend könnten die von uns erhobenen Ergebnisse und die oben angeführten Befunde dahingehend interpretiert werden, dass eine Überexpression / Aktivierung des 5-HT1A Rezeptors zur Reduzierung der Aktivität der serotonergen Neurone, und zur daraus resultierenden Enthemmung der noradrenergen Neurone im LC, zu einer Erhöhung der NA-Synthese und letztlich zur Erhöhung der Freisetzung von NA in die Synapse in den Projektionsgebieten führen kann.


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5.4 Korrelation zwischen dem serotonergen System und S100β

Hinsichtlich des neurotrophen Faktors, S100β Protein, konnten wir Hinweise dafür finden, dass bei einer Überexpression des 5-HT1A Rezeptors die Zahl der S100β-immunreaktiven Zellen im Hippocampus und Striatum zunimmt. Der Zusammenhang zwischen dem serotonergen System und S-100β wird auch durch andere Untersuchungen bestätigt. In primären Astrogliazellkulturen der Ratte wurde gezeigt, dass die Stimulierung von 5-HT1A Rezeptoren zur Reifung der Morphologie der Astrozyten und Feisetzung von S100β führen kann (Whitaker-Azmitia et al., 1990). In der primären Zellkultur der Raphe der Ratte wurde demonstriert, dass S100β, nicht aber Nervenwachstumsfaktor, Epidermiswachstumsfaktor, Insulin, oder Calmodulin das Wachstum des serotonergen Systems regulieren und die Verlängerung von Neuriten fördern können (Liu und Lauder, 1992; Azmitia et al., 1990; Muller et al., 1993; Nishi et al., 2000). Bei der adulten Ratte führt die Hemmung der 5-HT-Synthese zur Reduzierung von S100β (Azmitia et al., 1995; Haring et al., 1993) und die Behandlung mit Agonisten des 5-HT1A Rezeptors zur Zunahme von S100β (Azmitia et al., 1995). Darüber hinaus zeigte die Studie an Polydactylie­mutanten Mäusen (Polydactyly Nagoya), die neben verschiedenen Anomalien des Gehirns auch eine verzögerte Produktion von S100β aufweisen, dass die Spiegel von 5-HT und 5-HIAA in verschiedenen Hirnregionen wie im Cortex und Hippocampus bei den mutanten Mäusen niedriger waren als bei Wild-Typ-Mäusen (Ueda et al., 1994). Hingegen kann die Tranplantation der C6 Glioma Zelllinie, die S100β enthält und auch S100β in den extrazellulären Raum freisetzt (Van Eldik und Zimmer, 1987), in den Hippocampus der adulten Ratte den Auswuchs von serotonergen Fasern begünstigen (Ueda et al., 1995). Dies würde die Hypothese unterstützen, dass S100β die Funktion eines serotonergen Wachstumsfaktors während der Entwicklung hat und dessen Erhöhung das Wachstum der serotonergen Terminale sogar bei adulten Tiere stimulieren kann. Der kürzlich veröffentlichte Befund der normalen Entwicklung des serotonergen Systems im Gehirn bei S100β knockout Mäusen zeigt aber, dass S100ß kein essentieller Faktor für die Entwicklung des serotonergen Systems ist oder seine Funktion durch andere Wachstumsfaktoren kompensiert werden kann (Nishiyama et al. 2002). Auch bei Mäusen mit S100β Überexpression mit 2-3fach höheren Spiegeln der S100β mRNA im Gehirn sind keine wesentlichen Unterschiede bezüglich der 5-HT Spiegel im Vorderhirn und der immunhistochemischen Verteilung der serotonergen Fasern zu erkennen. Die Überexpression [Seite 84↓]von S100β führt außerdem nicht zum Schutz serotonerger Neurone vor der selektiven Neurotoxizität von 5,7-DHT (Bendotti et al., 2002).

5.5 Einfluss des 5-HT1A Rezeptors auf die Synaptogenese und Myelinisierung

In der vorliegenden Arbeit wurde mittels Western Blot untersucht, ob die synaptischen Vesikelproteine wie Synaptobrevin, Synaptophysin, Synaptotagmin und SNAP-25 bei den drei Mäuse-Linien unterschiedliche Entwicklungsprofile zeigen. Zum Zeitpunkt E12,5 war mittels Western Blot-Analyse bei WT Mäusen eine höhere Konzentration von Synaptobrevin und Synaptotagmin nachweisbar als bei KO und ÜE Mäusen. SNAP-25 war nur bei ÜE Mäusen niedriger als bei WT Mäusen. Von E14,5 bis P15,5 waren keine Unterschiede von Synaptobrevin und Synaptophysin bei den drei Mäuse-Linien erkennbar. Das Fehlen der Detektion von Synaptophysin bei den drei Mäuse-Linien in der frühen pränatalen Periode (E12,5) könnte dahingehend erklärt werden, dass sich Synaptophysin unabhängig davon, ob der 5-HT1A Rezeptor nicht, normal oder vermehrt expremiert wird, langsamer als die anderen untersuchten synaptischen Proteine entwickelt oder die Empfindlichkeit der Western Blot-Analyse nicht ausreichend war. Hingegen sprechen unsere Befunde dafür, dass sowohl bei Überexpression des 5-HT1A Rezeptors als auch bei dessen Fehlen die Expression von Synaptobrevin und Synaptotagmin im Gehirn der frühen embryonalen Periode im Vergleich zu normaler 5-HT1A Rezeptor-Expression verzögert wird. Für eine Beeinflussung der Expression von synaptischen Proteinen durch 5-HT sprechen auch die von Whitaker-Azmitia (2001) beschriebenen Ergebnisse, dass die Hemmung der 5-HT-Synthese bei Ratten während der postnatalen Periode P10 bis P20 den Verlust von Synapsen zur Folge hat, wie dies mittels immunhistochemischer Färbung mit Synaptophysin oder SNAP 25 gezeigt wurde.

Die Myelinisierung wird als einer der morphologischen Hinweise zur Beobachtung der Entwicklung und Reifung des ZNS angesehen und ist ein biologischer Vorgang, bei dem die Oligodendrozyten ihre plasmatischen Membranen verlängern, die Axone umhüllt werden und Myelin gebildet wird. Aus früheren Untersuchungen geht hervor, dass 5-HT bei der axonalen Myelinisierung eine Rolle spielt (siehe Übersicht Whitaker-Azmitia, 2001). In der vorliegenden Arbeit wurde der Grad der Myelinisierung anhand des Myelin-assoziierten Proteins MBP mittels immunhistochemischer Methode und Western Blot-Analyse zum Zeitpunkt P15,5 untersucht, um festzustellen, ob das Fehlen des 5-HT1A Rezeptors oder die Überexpression des 5-HT1A Rezeptors den Vorgang der Myelinisierung beeinflussen kann. MBP positive Fasern wurden im [Seite 85↓]frontalen Cortex, Hippocampus und Septum intensiv gefärbt, es waren aber keine wesentlichen Unterschiede zwischen den drei Mäuse-Linien zu erkennen. Dies wurde auch durch Western Blot-Analyse bestätigt. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass der 5-HT1A Rezeptor keine essentielle Rolle bei der Myelinisierung spielt. Es kann aber nicht ausgeschlossen werden, dass die Sensitivität der verwendeten Methoden nicht ausreichend war, um geringfügige Veränderung zu erfassen. Das Fehlen des Nachweises von MBP bei P1,5 Mäusen mittels immunhistochemischer Methode und der Western Blot-Analyse stimmt mit dem Befund von Hamano und Mitarbeiter (1996) im Gehirn der Ratte überein, dass die Myelinisierung verschiedener Nervenbahnen erst während der ersten postnatalen Woche oder später beginnt.


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03.02.2004