Aus der Klinik für Pädiatrie mit Schwerpunkt Neurologie
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Untersuchung des Einflusses mitochondrialer Polymorphismen auf die phänotypische Ausprägung der Neurofibromatose Typ 1 bei monozygoten Zwillingen

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité -
Universitätsmedizin Berlin

von
Anne Katrin Detjen
aus Köln

Gutachter:
1. Prof. Dr. M. Schülke, Berlin
2. Priv.-Doz. Dr. Th. Rosenbaum, Düsseldorf
3. Prof. Dr. A. Das, Hannover

Datum der Promotion:18. November 2005

Widmung:

Meinen Eltern

Der kleinen Anne

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung
  • 1.1 Einführung
  • 1.2 Neurofibromatose Typ 1 (von Recklinghausen)
    • 1.2.1 Klinik
    • 1.2.2 Genetik
  • 1.3 Mitochondrien
    • 1.3.1 Funktion
    • 1.3.2 Mitochondriale DNA
    • 1.3.3 Homoplasmie/Heteroplasmie
    • 1.3.4 Mutationen und Polymorphismen der mitochondrialen DNA
    • 1.3.5 Vererbung
  • 1.4 Tumoren und mitochondriale Polymorphismen
  • 1.5 Zielsetzung
• 2 Patienten
  • 2.1 Kasuistiken
    • 2.1.1 Zwillingspaar A
    • 2.1.2 Zwillingspaar B
    • 2.1.3 Zwillingspaar C
    • 2.1.4 Zwillingspaar D
  • 2.2 Kontrolle
• 3 Material und Methoden
  • 3.1 Materialien
    • 3.1.1 Oligonukleotide
    • 3.1.2 Bakterienstämme
    • 3.1.3 Chemikalien
    • 3.1.4 Puffer, Lösungen, Medien
    • 3.1.5 Geräte
    • 3.1.6 Gebrauchswaren
    • 3.1.7 Computer Software
  • 3.2 Methoden
    • 3.2.1 DNA Extraktion
      • 3.2.1.1 DNA Extraktion aus EDTA-Blut
      • 3.2.1.2 DNA Extraktion aus Tumorgewebe
    • 3.2.2 Polymerasekettenreaktion (PCR)
      • 3.2.2.1 Prinzip der PCR
      • 3.2.2.2 Long-read PCR
      • 3.2.2.3 PCR-Primer Design
      • 3.2.2.4 Gelelektrophorese
      • 3.2.2.5 Durchführung
        • 3.2.2.5.1 Long read PCR
        • 3.2.2.5.2 PCR
        • 3.2.2.5.3 Gelelektrophorese
    • 3.2.3 DNA Sequenzierung
      • 3.2.3.1 Prinzip der Sequenzierung
      • 3.2.3.2 Durchführung
        • 3.2.3.2.1 Reinigung der PCR-Produkte
        • 3.2.3.2.2 Sequenzierung
        • 3.2.3.2.3 Aufreinigung der Sequenzierungsprodukte
        • 3.2.3.2.4 Gelelektrophorese am ABI Prism 3700
        • 3.2.3.2.5 Auswertung
      • 3.2.3.3 Vergleich der Aminosäuresequenzen
    • 3.2.4 Genotypisierung des D310-Traktes
      • 3.2.4.1 Prinzip der Genotypisierung
      • 3.2.4.2 Klonierung von PCR Produkten
        • 3.2.4.2.1 Klonierungs-PCR
        • 3.2.4.2.2 Klonierung
      • 3.2.4.3 PCR mit fluoreszenzmarkiertem-Primer
      • 3.2.4.4 Restriktion mit HaeIII
      • 3.2.4.5 Genescan
        • 3.2.4.5.1 Auswertung
• 4 Ergebnisse
  • 4.1 Sequenzierung des mitochondrialen Genoms
    • 4.1.1 Abweichungen von der Standardsequenz
    • 4.1.2 Verteilung der Sequenzvarianten innerhalb des mitochondrialen Genoms
    • 4.1.3 Vergleich der Sequenzvarianten mit der Datenbank Mitomap
    • 4.1.4 Ergebnisse der einzelnen Patienten und der Kontrolle
      • 4.1.4.1 Zwillingspaar A
      • 4.1.4.2 Zwillingspaar B
      • 4.1.4.3 Zwillingspaar C
      • 4.1.4.4 Zwillingspaar D
      • 4.1.4.5 Kontrolle
    • 4.1.5 Überprüfung der Sequenzen mit Aminosäureaustausch auf ihre evolutionäre Konservierung
  • 4.2 Hypervariable Regionen - Mikrosatellitensequenzen
    • 4.2.1 HVR1
    • 4.2.2 HVR2
      • 4.2.2.1 Zwillingspaar A und dessen Mutter M_A
        • 4.2.2.1.1 Vergleich der Genotypen in verschiedenen Tumoren von A₁
      • 4.2.2.2 Zwillingspaar B
      • 4.2.2.3 Zwillingspaar C
      • 4.2.2.4 Zwillingspaar D
• 5 Diskussion
  • 5.1 Mitochondriale Polymorphismen und der unterschiedliche NF1-Phänotyp bei monozygoten Zwillingen
  • 5.2 Homoplasmische Mutationen in Tumoren
  • 5.3 Die HVR2 als Marker für klonales Wachstum
  • 5.4 Die phänotypische Divergenz monozygoter Zwillinge mit NF1 – andere Aspekte und Ansätze
    • 5.4.1 Modifizierende Gene
    • 5.4.2 Second hit – ein lokales Phänomen
    • 5.4.3 Neurofibromin und Mitochondrien
• 6 Zusammenfassung
• Danksagung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1: Zwillinge A₁ und A₂. Klinische Daten aus dem Jahr 2001.
• Tabelle 2: Zwillinge B₁ und B₂. Klinische Daten aus dem Jahr 1998.
• Tabelle 3: Zwillinge C₁ und C₂. Klinische Daten aus dem Jahr 1994.
• Tabelle 4: Zwillinge D₁ und D₂. Auflistung der Krankheitsmerkmale aus dem Jahr 1996.
• Tabelle 5: Für die Long-read PCR verwendete Oligonukleotidprimer.
• Tabelle 6: Darstellung der Sequenzen und Lage der für die Amplifikation der 17 verschiedenen mtDNA-Fragmente verwendeten Oligonukleotidprimer als auch die Länge der entstandenen Fragmente.
• Tabelle 7: Sequenzierungsprimer und ihre Lage auf der mtDNA. F=Forward–Primer, R=Reverse–Primer.
• Tabelle 8: Oligonukleotidprimer für die Klonierungs-PCR und ihre Lage auf der mtDNA.
• Tabelle 9: Oligonukleotidprimer für die Genotypisierung und ihre Lage auf der mtDNA
• Tabelle 10: Zwillinge A₁ und A₂. Analyse der mtDNA sowohl aus Blut- als auch aus Tumorzellen. Darstellung der nachgewiesenen Sequenzvarianten, deren Lage, eventueller Aminosäureaustausch und Bezug auf Eintragungen in der Mitomap-Datenbank. Für die Bezeichnung der Aminosäuren wurde der Einbuchstabencode verwendet (siehe Abkürzungsverzeichnis).
• Tabelle 11: Zwillinge B1 und B2. Analyse der mtDNA aus Blutzellen. Darstellung der nachgewiesenen Sequenzvarianten, deren Lage, eventueller Aminosäureaustausch und Bezug auf Eintragungen in der Mitomap-Datenbank. Für die Bezeichnung der Aminosäuren wurde der Einbuchstabencode verwendet (siehe Abkürzungsverzeichnis).
• Tabelle 12: Zwillinge C₁ und C₂. Analyse der mtDNA aus Blutzellen. Darstellung der nachgewiesenen Sequenzvarianten, deren Lage, eventueller Aminosäureaustausch und Bezug auf Eintragungen in der Mitomap-Datenbank. Für die Bezeichnung der Aminosäuren wurde der Einbuchstabencode verwendet (siehe Abkürzungsverzeichnis).
• Tabelle 13: Zwillinge D₁ und D₂. Analyse der mtDNA aus Blutzellen. Darstellung der nachgewiesenen Sequenzvarianten, deren Lage, eventueller Aminosäureaustausch und Bezug auf Eintragungen in der Mitomap-Datenbank. Für die Bezeichnung der Aminosäuren wurde der Einbuchstabencode verwendet (siehe Abkürzungsverzeichnis).
• Tabelle 14: Kontrolle. Analyse der mtDNA aus Blutzellen. Darstellung der nachgewiesenen Sequenzvarianten, deren Lage, eventueller Aminosäureaustausch und Bezug auf Eintragungen in der Mitomap-Datenbank. Für die Bezeichnung der Aminosäuren wurde der Einbuchstabencode verwendet (siehe Abkürzungsverzeichnis).
• Tabelle 15: Genescan-Analyse des D310-Traktes. Berechnung des relativen Anteils der einzelnen Haplotypen von M_A, A₁ und A₂ aus der Fläche der einzelnen Peaks.
• Tabelle 16: Genescan-Analyse des D310-Traktes bei Zwillingspaar B. Anteil der einzelnen Längenvarianten im Vergleich.
• Tabelle 17: Genescan-Analyse des D310-Traktes bei Zwilling C₁. Die Berechnung der Flächen bei Zwilling C₂ war nicht möglich.
• Tabelle 18: Genescan-Analyse des D310-Traktes bei Zwillingspaar D. Anteil der einzelnen Längenvarianten im Vergleich.

Bilder

• Abbildung 1: Inaktivierung der ras-Protoonkogene durch GAP-Proteine wie das Neurofibromin.
• Abbildung 2: Elektronenmikroskopisches Bild des Mitochondriums einer Muskelzelle. Einstülpungen der inneren Mitochondrienmembran in den Matrixraum bilden die Cristae. Die Enzyme der Atmungskette befinden sich an der inneren Membran, die der β-Oxidation und des Citratzyklus im Matrixraum.
• Abbildung 3: Das mitochondriale Genom des Menschen. Der H-Strang und die von ihm codierten Gene sind auf dem äußeren Ring, der L-Strang mit seinen Genen auf dem inneren Ring dargestellt. Neben den Genen sind die Promotoren für den H- und L-Strang (P_H und P_L) sowie die Ursprünge der beiden Stränge (O_H und O_L) eingezeichnet [www.mitomap.org].
• Abbildung 4: Klassisches Modell der mtDNA Replikation: mtDNA Kontrollregion und Initiation der H-Strang Synthese. Der nukleär kodierte TFAM bindet unmittelbar vor dem LSP im D-loop und sorgt für die Entspiralisierung der mtDNA. Ausgehend vom LSP synthetisiert die RNA-Polymerase ein Stück RNA. Der deplazierte H-Strang und das Hybrid aus RNA und L-Strang bilden den sogenannten R-loop. Die DNA-Polymerase benutzt die RNA als Primer und beginnt mit der Synthese eines neuen H-Stranges.
• Abbildung 5: Mitochondriales „bottleneck“: Die geringste Anzahl der Mitochondrien und mtDNAs, und damit der Flaschenhals, liegt im Stadium der primordialen Keimzellen (Gonozyten) vor [Jansen und De Boer 1998]. Danach nimmt die Zahl der Mitochondrien/Zelle stetig zu und liegt im Stadium der sprungreifen Oozyte bei 50-100.000. Während der gesamten Zeit scheint die Zahl der mtDNA-Kopien/Mitochondrium bei eins zu liegen. Die mtDNA-Replikation und Mitochondrienteilung sistiert in der befruchteten Oozyte bis zum Morulastadium.
• Abbildung 6: Zwillinge A₁ (links) und A₂ (rechts)
• Abbildung 7: Zwillinge D₁ und D₂.
• Abbildung 8: Zwillinge B₁ und B₂. Zwilling B₂: Plexiformes Neurofibrom der linken Schulter
• Abbildung 9: Prinzip der PCR. Die Stränge der Ziel-DNA werden durch Erhitzen aufgetrennt, damit sich spezifische Primer ( blau ) anlagern können. Mit Hilfe der Polymerase und in der PCR-Reaktionslösung enthaltener dNTPs entsteht ein neu synthetisierter DNA-Strang in 3’-Richtung. Im nächsten Schritt wird wieder denaturiert und dadurch eine erneute Primeranlagerung und Strangverlängerung ermöglicht. Ab dem dritten Zyklus entstehen Sequenzen, die der Länge der Zielsequenz entsprechen. Insgesamt läuft eine PCR-Reaktion über 25-42 Zyklen. Bis die Substrate aufgebraucht sind wird in jedem Zyklus die Zahl der DNA-Kopien verdoppelt.
• Abbildung 10: Ort der Hybridisierung des FAM-markierten Primers, der D310-Trakt (CCCCCCCTCCCCCC) und die Schnittstelle für HaeIII im D-loop. Der D310-Trakt ist aus einer Sequenzierungsreaktion mit der Plasmid DNA in die Abbildung eingefügt. Die für die Genotypisierung verwendete Standardsequenz hat eine Länge von 65 bp.
• Abbildung 11: Gelelektrophorese. In der Mitte ist das PCR Produkt für die Genotypisierung vor (links) und nach (rechts) der Restriktion mit Hae III aufgetragen. Am Rand ist zu beiden Seiten ein Längenstandard aufgetragen.
• Abbildung 12: Verteilung der gefundenen Abweichungen von der Standardsequenz auf die verschiedenen Abschnitte der mtDNA.
• Abbildung 13: 14002A>G. Diese Transition im MTND5-Gen führt bei B₁ und B₂ zum Austausch der Aminosäure Tyrosin (T) gegen Alanin (A).
• Abbildung 14: 5913G>A. Diese Transition im MTCOI-Gen führt bei D₁ und D₂ zum Austausch von Asparaginsäure (D) gegen Asparagin (N).
• Abbildung 15: 5913G>A. Der Polymorphismus führt zum Austausch einer Asparaginsäure (D) gegen Asparagin (N) an Position 4 des Proteins. Dieser Bereich erweist sich im Laufe der Evolution als variabel. Bei Maus und Huhn finden sich an Position vier jeweils ein Asparagin, während dieser Proteinabschnitt bei Drosophila und Bäckerhefe nicht vorhanden ist.
• Abbildung 16: Genescan-Analyse der Zwillinge A₁ und A₂ (Blut und Tumor) sowie ihrer Mutter M_A (Blut). Beim Vergleich mit dem Längenstandard zeigt sich, dass die Varianten jeweils ein, zwei bzw. drei Basenpaare länger sind. Ebenso kann man die fast konstante Aufteilung der Varianten erkennen.
• Abbildung 17: Genotypisierung des D310-Traktes. Vergleich von 16 Tumorproben von Zwilling A₁. Relative Anteile und Trendlinien der drei vorkommenden Genotypen. λ 15bp Traktlänge, ν 16bp Traktlänge, σ 17bp Traktlänge.
• Abbildung 18: Genescan-Analyse. Vergleich des D310-Traktes von 16 verschiedenen Tumoren des Zwillings A₁. Alle Tumoren besitzen die Varianten mit 15, 16 und 17 bp Traktlänge in fast konstanter Aufteilung.
• Abbildung 19: Genscan. Vergleich des D310-Traktes der Zwillinge B, C und D mit dem Längenstandard. Bei allen finden sich jeweils drei Längenvarianten. Die anteilig am stärksten vertretene Variante entspricht bei B1 und B2 sowie C1 und C2 der Länge des Standards. Bei D1 und D2 ist sie ein Basenpaar länger.