1 Einleitung

1.1 Einführung

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Die Entstehung und das Wachstum von Tumoren sind Gegenstand zahlreicher wissenschaftlicher Untersuchungen. Man geht bei der Tumorgenese von einem multifaktoriellen Geschehen aus. Die Methoden der modernen Molekularbiologie ermöglichen es, genetische Faktoren aufzudecken, die das Entstehen von Tumoren verursachen und/oder fördern. Des Weiteren sind epigenetische, stochastische und auch Umweltfaktoren für die Tumorgenese von Bedeutung.

Zahlreiche Publikationen der letzten Jahre legen einen Zusammenhang zwischen Tumorentstehung und Veränderungen der Mitochondrien nahe [Polyak et al. 1998, Fliss et al. 2000]. Die mitochondriale DNA (mtDNA), ihre vom nukleären Genom unabhängige Vererbung, ihre Veränderungen und ihr Einfluss auf die Mitochondrienfunktion stehen dabei im Mittelpunkt dieser Untersuchungen.

In der vorliegenden Arbeit habe ich untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen Veränderungen der mtDNA und der phänotypischen Ausprägung der Neurofibromatose Typ 1 (von Recklinghausen) besteht, die eine der häufigsten erblichen Tumorerkrankungen ist.

1.2 Neurofibromatose Typ 1 (von Recklinghausen)

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Die Neurofibromatose Typ 1 (NF1) wurde erstmals durch Friedrich von Recklinghausen (1882) beschrieben. Sie gehört zur Gruppe der Phakomatosen (neurokutane Syndrome) und ist mit einer Prävalenz von 1:5.000-1:2.000 eine häufige autosomal-dominant vererbte Erkrankung. Hauptmerkmale der NF1 sind hyperpigmentierte Hautflecken (Café-au-lait Flecken) sowie Neurofibrome (benigne Hauttumore) und Schwannome (benigne Tumore der Markscheiden).

1.2.1 Klinik

Die Diagnose der Neurofibromatose Typ 1 basiert auf klinischen Kriterien, die auf einer Konsensuskonferenz des National Institute of Health (NIH) im Jahre 1988 festgelegt wurden.

Die Diagnose kann gestellt werden, wenn beim Patienten zwei oder mehr der folgenden Zeichen nachweisbar sind:

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  1. Sechs oder mehr Café-au-lait Flecken (CALF)
    - mit einem Durchmesser von > 5 mm vor der Pubertät
    - mit einem Durchmesser >15 mm nach der Pubertät.
  2. Zwei oder mehr Neurofibrome irgendeines Typs oder ein plexiformes Neurofibrom.
  3. Axilläres oder inguinales Freckling.
  4. Ein Tumor im Verlauf der Sehbahn.
  5. Zwei oder mehrere Lisch Knötchen (Irishamartome).
  6. Eine Knochenläsion, z.B. die Verdünnung des Cortex eines langen Röhrenknochens (mit oder ohne Pseudoarthrose) oder die Dysplasie eines Keilbeinflügels.
  7. Ein Verwandter ersten Grades mit nach oben genannten Kriterien diagnostizierter Neurofibromatose Typ 1.

Die Café-au-lait Flecken sind oft schon kurz nach der Geburt zu finden. Sie und einige andere Zeichen, wie Freckling oder Lisch Knötchen haben keine weitere klinische Bedeutung. Die Zahl der kutanen und subkutanen Neurofibrome, die bei fast allen erwachsenen Patienten vorhanden sind, variiert stark. Sie treten meist zu Beginn der Pubertät auf und vermehren sich mit zunehmendem Alter. In Phasen endokriner Umstellung, in der Adoleszenz und der Schwangerschaft, zeigen die Neurofibrome eine Wachstumstendenz und vermehren sich auch in ihrer Zahl [Friedmann et al. 1999].

Die plexiformen Neurofibrome, die bei ca. 15% der Patienten auftreten, können sich infiltrativ in umliegendes Gewebe ausbreiten und starke Schmerzen sowie Funktionsausfälle hervorrufen. Außerdem scheinen sie Ausgangspunkt für maligne Nervenscheidentumoren zu sein [Friedmann et al. 1997].

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Tumoren der Sehbahn kommen bei ca. 20% der Kinder mit NF1 vor. In den meisten Fällen verursachen sie, im Gegensatz zu Optikusgliomen bei Patienten ohne NF1, keine klinischen Symptome [Listernick et al. 1997]. Sie können aber auch durch lokale Raumforderung zu Hirndrucksteigerung sowie neurologischen und endokrinen Ausfällen führen.

Patienten mit NF1 haben ein erhöhtes Risiko, Malignome zu entwickeln. Bestimmte Tumorformen, wie periphere Nervenscheidentumoren und Tumoren des zentralen Nervensystems, treten bei NF1 Patienten gehäuft auf. Seltener sieht man aber auch eine maligne Entartung von Zellen nicht neuralen Ursprungs, wie zum Beispiel myeloische Leukämien [Hope und Mulvihill 1981].

Des weiteren gibt es andere mit NF1 assoziierte Zeichen, wie Makrozephalie, Skoliose, Kleinwuchs, arterieller Hypertonus, Dysarthrie sowie signalintense Zonen im Bereich des Globus pallidus in der T2-Wichtung der kraniellen MRT. [Gutmann et al. 1997]. Die meisten NF1-Patienten haben eine normale Intelligenz. 30-60% haben jedoch Lernbehinderungen und Teilleistungsschwächen [North et al. 1997].

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Für die signifikant erhöhte Morbidität und Letalität der Patienten mit NF1 scheinen vor allem Malignität (z.B. Neurofibrosarkome) und arterieller Hypertonus verantwortlich zu sein [Zöller et al. 1997].

1.2.2 Genetik

Die NF1 hat eine Penetranz von nahezu 100%. Allerdings variieren die Ausprägung und das Manifestationsalter der verschiedenen Symptome sehr stark. Selbst eineiige Zwillinge können sich in der Verteilung und Ausprägung ihrer Symptome unterscheiden [Bauer et al. 1988].

Genetische Ursache der NF1 sind Mutationen im Neurofibromin-Gen (=NF1-Gen). Das NF1-Gen liegt auf dem langen Arm des Chromosoms 17. Es wurde 1990 durch die Bruchpunktanalyse unterschiedlicher auf Chromosom 17 liegender Chromosomentranslokalisationen bei zwei NF1-Patienten entdeckt. Mit Hilfe genetischer Marker wurde die genaue Lage der Bruchpunkte bestimmt. Aus den vier in Frage kommenden Kandidatengenen in der eingegrenzten Region konnte schließlich durch die Entdeckung weiterer Mutationen bei anderen NF1-Patienten das verantwortliche Gen identifiziert werden [Viscochil et al. 1990; Cawthon et al. 1990, Wallace et al. 1990, Upadhyaya 1990]. Das NF1-Gen erstreckt sich über 350 kbp und umfasst 60 Exons.

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In etwa 50% der Fälle treten Neumutationen auf, die meisten davon liegen auf dem paternalen Chromosom [Stephens et al. 1992]. In der Datenbank des „NF1 Genetic Analysis Consortiums“ sind bisher über 500 verschiedene Mutationen dokumentiert (http://www.nf.org/nf1gene/). Die meisten Mutationen sind Deletionen und resultieren in trunkierten Proteinen. Nur ca. 10% führen zu Aminosäuresubstitutionen (missense Mutationen) [Rasmussen und Friedman 2000].

Es gibt für die Mutationen keine "hotspots"–sie sind mehr oder weniger mit gleicher Häufigkeit über das Gen verteilt. Die relativ am häufigsten auftretende Veränderung ist eine nonsense Mutation im Exon 31 (R1947X) und ist in 1-2% der Fälle nachweisbar [Dublin et al. 1995].

Das Genprodukt Neurofibromin kommt ubiquitär im Zytoplasma der Zellen vor. Etwa 20% kolokalisiert mit Mitochondrien [Roudebush et al. 1997]. Am stärksten wird es im adulten zentralen und peripheren Nervensystem exprimiert [Upadhyaya et al. 1998].

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Eine Domäne des Neurofibromins, welche etwa 12% des Proteins umfasst, hat große Ähnlichkeit mit der Familie der ras-GAP Proteine [Xu et al. 1990]. Diese GTPase Aktivierenden Proteine (GAP) inaktivieren durch Steigerung der GTPase-Aktivität bestimmte G-Proteine wie zum Beispiel das ras-Protoonkogen. Durch Hydrolyse wird es von seiner aktiven, GTP-gebundenen Form in die inaktive, GDP-gebundene Form umgewandelt. Die ras-Onkogene spielen bei der Regulation des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung eine wichtige Rolle. Überschießende Aktivität der ras-Onkogene kann zu übermäßiger Proliferation und so zu Tumorwachstum führen. Die GAP wirken durch die Inaktivierung der ras-Onkogene als Tumorsuppressor.

Die große Bedeutung der GAP-Region für die Pathogenese der NF1 zeigten Klose et al. (1998). Sie untersuchten eine Mutation am Argininfinger, einem katalytischen Element der GAP-Region. Die Aminosäure Arginin an Position 1276 war hier durch Prolin ersetzt. Dies führte zu einer starken Reduktion der Hydrolyseaktivität der GTPase bei erhaltener Tertiärstruktur des Proteins und, im Gegensatz zu anderen häufigen Mutationen, normaler Neurofibromin-Synthese. Diese Untersuchungen lassen die Schlussfolgerung zu, dass das komplexe Krankheitsbild der NF1 allein durch die Aktivitätsminderung des Neurofibromins entstehen kann.

Neurofibromin und auch andere GAP können durch bestimmte Fettsäuren wie Arachidonsäure inhibiert werden [Golubic et al. 1991]. Dies deutet auf eine Interaktion zwischen Neurofibromin und Membranen hin.

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Die Kolokalisation zwischen Neurofibromin und Mitochondrien gibt Anlass zu der Vermutung, dass Neurofibromin mit Proteinen der äußeren Mitochondrienmembran wie zum Beispiel Bcl-2, einem Effektorprotein der Apoptose, und einem weiteren GTP-bindenden Protein interagiert [Roudebush et al. 1997].

Die biologische Bedeutung der anderen Domänen des Neurofibromins ist ungeklärt. Riccardi (2000) wies auf die Bedeutung des Neurofibromin-Gens bei der Entwicklung von Dysplasien hin und stellte die Behauptung auf, das Neurofibromin-Gen sei generell ein Kontrollgen für das Wachstum von Geweben.

Abbildung 1: Inaktivierung der ras-Protoonkogene durch GAP-Proteine wie das Neurofibromin.

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Ein wichtiger Faktor für die Entwicklung der NF1-assoziierten Neoplasien ist der Verlust oder die Inaktivierung des zweiten Allels des NF1-Gens. Gemäß der sogenannten „Second-hit Theorie“ kommt es zur Tumorentstehung, wenn zusätzlich zur Keimbahnmutation eine somatische Mutation das verbleibende Allel schädigt [Knudson 1971]. Im Falle der NF1 wird Neurofibromin durch Mutation oder Inaktivierung des zweiten Allels nicht mehr oder nicht ausreichend produziert. So fand man in benignen Neurofibromen gemischte Zellpopulationen, in denen einige Zellen einen second-hit aufwiesen und andere nicht. In Neurofibrosarkomen und malignen Schwannomen fand man eine klonale Zellproliferation. Neurofibromin war kaum nachweisbar, bei gleichzeitig stark erhöhten Spiegeln an aktiviertem p21ras [Basu et al. 1992, DeClue et al. 1992].

Die nichtneoplastischen Symptome der NF1 scheinen auf eine Haploinsuffizienz des Neurofibromins zurückzuführen zu sein [Krohne und Kehrer-Sawatzki 2001].

Eine eindeutige Genotyp-Phänotyp Relation für die NF1-Mutationen konnte bisher in keiner Studie festgestellt werden. Miller und Hall (1978) fanden heraus, dass mütterliche Transmission der NF1 den Schweregrad der Krankheit erhöht. Bei der Ausprägung des Phänotyps scheinen aber noch andere Faktoren, wie weitere modifizierende Gene, Umwelt- und stochastische Faktoren eine Rolle zu spielen [Rasmussen 2000].

1.3 Mitochondrien

1.3.1 Funktion

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Mitochondrien sind Bestandteile des Zytoplasmas eukaryotischer Zellen. Sie sind elliptoide, ca. 2-4 μm lange und 1 μm breite, von einer Doppelmembran umgebene Strukturen. In ihrer Matrix sind spezifische Funktionen lokalisiert, wie zum Beispiel Teile der β-Oxidation, des Harnstoffzyklus und der Citratzyklus. An der inneren Mitochondrienembran befinden sich die Enzymkomplexe der Atmungskette. Hier wird der größte Teil der Energie (ATP) des menschlichen Organismus durch oxidative Phosphorylierung gewonnen.

Abbildung 2: Elektronenmikroskopisches Bild des Mitochondriums einer Muskelzelle. Einstülpungen der inneren Mitochondrienmembran in den Matrixraum bilden die Cristae. Die Enzyme der Atmungskette befinden sich an der inneren Membran, die der β-Oxidation und des Citratzyklus im Matrixraum.

In ihrer „Endosymbionten-Theorie“ über die Entstehung der Eukaryonten vermutet Lynn Margulis (1975), dass sich die Mitochondrien im Laufe der Evolution aus unabhängig lebenden Protobakterien entwickelt haben. Entsprechend des damals auf der Erde herrschenden Milieus metabolisierten diese Protobakterien Wasserstoff und CO2. Sie gingen eine Symbiose mit Organismen ein, die ihrerseits Wasserstoff und CO2 produzierten. Diese Symbiose persistierte im Verlauf der Evolution, passte sich den Veränderungen der Umweltbedingungen immer besser an und wurde zur „Endosymbiose“. Ein großer Teil der Gene des Proto-Mitochondriums wurde auf das nukleäre Genom der Wirtszelle übertragen, so dass das Funktionieren des Mitochondriums nun eng an die Intaktheit der Gastzelle gebunden ist. Eine gewisse Unabhängigkeit haben sich die Mitochondrien bewahrt, indem sie sich unabhängig vom Zellzyklus vermehren können und über eine eigene zirkuläre DNA und einen eigenen Translationsapparat verfügen. Der Triplett-Code der mitochondrialen DNA (mtDNA) weicht leicht vom „universellen“ genetischen Code ab und die Mitochondrien besitzen 22 transfer-RNAs zur Translation der mtDNA-kodierten Gene.

1.3.2 Mitochondriale DNA

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Entdeckt wurde die mitochondriale DNA (mtDNA) durch Nass und Nass (1963). Das Genom der Mitochondrien ist ein kreisförmiges, doppelsträngiges DNA-Molekül, das aus ca. 16569 Basenpaaren besteht. Die vollständige Sequenz wurde erstmals von Anderson et al. (1981) veröffentlicht. Inzwischen wurde sie mehrfach revidiert. Eine Konsensussequenz ist unter der GenBank-Zugriffsnummer NC_001807 zugänglich.

Die Anzahl der Mitochondrien pro Zelle schwankt zwischen 10-500. Jedes Mitochondrium enthält drei bis sechs mtDNA Kopien. Einen Sonderstatus nehmen die Eizellen ein, welche bis zu 50.000 Mitochondrien enthalten können.

Das mitochondriale Genom des Menschen besteht zu 97% aus codierenden DNA-Sequenzen. 28 der insgesamt 37 Gene liegen auf dem schweren H-Strang (enthält prozentual mehr Guanin), 9 auf dem leichten L-Strang (enthält prozentual mehr Cytosin) (Abbildung 3). Sie kodieren für:

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Im Gegensatz zur nukleären DNA und der mtDNA der Hefebakterien ist die DNA der menschlichen Mitochondrien nicht in Introns und Exons unterteilt. Die Gene liegen dicht beieinander und die Gene für die ATPasen 6 und 8 überlappen sich sogar um 43 Basenpaare.

Eine 1121 bp lange, nicht-kodierende Region wird als displacement-loop (D-loop) bezeichnet. Der D-loop ist für die Regulierung von Transkription und Replikation der mtDNA zuständig. Seine Bedeutung zeigt sich auch darin, dass im D-loop drei in Wirbeltieren stark konservierte DNA-Sequenzen liegen (Conserved Sequence Blocks, CSB I-III). Darüber hinaus liegen im D-loop die beiden Promotoren für die Transkription des leichten (LSP=light strand promotor) und des schweren Stranges (HSP=heavy strand promotor). Hier befinden sich aber auch mehrere hypervariable Regionen (HVR1-3), welche den Mikrosatellitensequenzen der nukleären DNA entsprechen. Dies sind Mono- oder Dinukleotidrepeats, die häufig Längenvarianten aufweisen. Eine in der HVR2 liegende Mikrosatellitensequenz ist der D310-Trakt, ein Polycytosintrakt vor nt310. Längenvarianten mit sieben bis neun Cytosinresten sind in den Datenbanken eingetragen.

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Die Transkription wird durch den nukleär kodierten mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM) initiiert [Larsson 1997] und erfolgt mittels einer ebenfalls nukleär kodierten RNA-Polymerase. Der H-Strang wird gegen, der L-Strang im Uhrzeigersinn kontinuierlich transkribiert. Die entstehenden polycistronischen Transkripte werden erst später in die einzelnen mRNAs zerschnitten.

Abbildung 3: Das mitochondriale Genom des Menschen. Der H-Strang und die von ihm codierten Gene sind auf dem äußeren Ring, der L-Strang mit seinen Genen auf dem inneren Ring dargestellt. Neben den Genen sind die Promotoren für den H- und L-Strang (PH und PL) sowie die Ursprünge der beiden Stränge (OH und OL) eingezeichnet [www.mitomap.org].

Die Replikation der mtDNA geschieht unabhängig vom Zellzyklus [Bogenhagen und Clayton 1977]. Ausgangspunkt für die Replikation ist eine Triplett-Struktur, der sogenannte R-loop (Abbildung 4).

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Abbildung 4: Klassisches Modell der mtDNA Replikation: mtDNA Kontrollregion und Initiation der H-Strang Synthese. Der nukleär kodierte TFAM bindet unmittelbar vor dem LSP im D-loop und sorgt für die Entspiralisierung der mtDNA. Ausgehend vom LSP synthetisiert die RNA-Polymerase ein Stück RNA. Der deplazierte H-Strang und das Hybrid aus RNA und L-Strang bilden den sogenannten R-loop. Die DNA-Polymerase benutzt die RNA als Primer und beginnt mit der Synthese eines neuen H-Stranges.

Zwei verschiedene Mechanismen, die scheinbar parallel nebeneinander ablaufen, spielen bei der Replikation der mtDNA eine Rolle: In dem “klassischen“ Modell von Clayton (1982) wird zunächst, ausgehend vom OH, der neue H-Strang synthetisiert (Abbildung 4). Wenn ca. 2/3 dieses Stranges synthetisiert sind, beginnt die Replikation des leichten Stranges am OL in Gegenrichtung. Im Gegensatz dazu postulieren Bowmaker et al. (2003) eine bidirektionale doppelsträngige mtDNA-Synthese, ausgehend von verschiedenen Initiierungsstellen vor dem OH. Der OH sei nicht mehr Ursprung, sondern vielmehr Terminus der Replikation. In Zellen mit normalem Erhaltungsumsatz scheint die einzelsträngige, in Zellen mit reduzierter Anzahl von mtDNA-Kopien allerdings die doppelsträngige mtDNA Synthese zu überwiegen [Holt et al. 2000].

1.3.3 Homoplasmie/Heteroplasmie

Der größte Anteil der vielen in einem Individuum vorkommenden mtDNA-Kopien ist identisch. In diesem Fall spricht man von „Homoplasmie“. Treten verschiedene Genotypen nebeneinander auf, spricht man von „Heteroplasmie“. Der Grad der Heteroplasmie kann zwischen verschiedenen Geweben, zwischen verschiedenen Zellen eines Gewebes und innerhalb der Mitochondrien einer einzelnen Zelle variieren [Jansen 2000]. Monnat und Loeb (1985) stellten fest, dass Heteroplasmie in normalen Bevölkerungsgruppen sehr selten oder gar nicht vorkomme.

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Heteroplasmie kann entweder von der Mutter über die Keimbahn vererbt oder durch neue somatische Mutationen entstanden sein. Innerhalb einer einzelnen Zelle scheint generell die Tendenz zu bestehen, Homoplasmie zu erreichen [Nekhaeva et al. 2002a]. Entsteht eine neue Mutation, setzt sich entweder die mutierte- oder die Wildtyp-mt-DNA durch. Dies ist allerdings bei den meisten pathogenen mtDNA-Mutationen sowie den Mikrosatellitenregionen innerhalb des D-loops nicht der Fall. Der D310-Trakt, ein in der HVR2 liegender Polycytosintrakt, kommt bei vielen Personen in heteroplasmischer Form vor. Nekhaeva et al. (2002b) fanden sogar mehrere Längenvarianten des D310-Traktes innerhalb einzelner Zellen.

1.3.4 Mutationen und Polymorphismen der mitochondrialen DNA

Das mitochondriale Genom ist um ein Vielfaches anfälliger für Mutationen als das nukleäre [Habano et al. 1998]. Hierfür gibt es verschiedene Erklärungen: Die durch die Atmungskettenfunktion im Mitochondrium in besonders hoher Konzentration vorkommenden reaktiven Sauerstoffradikale können die, im Gegensatz zur nukleären DNA nicht durch Histone geschützte, freiliegende mtDNA leicht angreifen [Oberley und Buettner 1979]. Außerdem scheint die mitochondriale γ-Polymerase bei der Replikation anfälliger für Fehler zu sein als die nukleäre DNA-Polymerase [Kunkel et al. 1981].

Im Alter nimmt die Zahl der Punktmutationen und Deletionen der mtDNA in allen Geweben zu. Die Ansammlung solcher Mutationen in postmitotischen somatischen Zellen scheint für die im Alterungsprozess auftretende Gewebeschwäche mitverantwortlich zu sein [Wallace et al. 1995].

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Holt et al. (1988) beschrieben erstmals eine Deletion in der mtDNA als Ursache einer Erkrankung mit Myopathie und Herzrhythmusstörungen (Kearns-Sayre-Syndrom). Wallace et al. (1988) beschrieben im gleichen Jahr eine Punktmutation im MTND4-Gen als Ursache der Leber’schen hereditären Optikusneuropathie (LHON).

Die Auswirkungen pathogener Mutationen können teilweise dadurch kompensiert werden, dass in einer Zelle mehrere mtDNA-Kopien vorkommen. Erst wenn der Anteil der mutierten im Verhältnis zu nicht mutierten mtDNA-Kopien eine bestimmte Schwelle überschreitet, ist die Energieproduktion der Mitochondrien beeinträchtigt. Diese Schwelle kann in Abhängigkeit des betroffenen Gewebes vom oxidativen Stoffwechsel unterschiedlich hoch sein [Di Mauro et al. 2000]. Sie kann zum Beispiel überschritten werden, wenn im Laufe der Oogenese oder der frühen Embryogenese die Mitochondrien umverteilt werden und dann in einem ungünstigen Verhältnis (wildtyp versus mutiert) zueinander stehen.

Nicht alle im mitochondrialen Genom auftretenden Nukleotidvarianten müssen pathogen sein. Ein großer Teil verhält sich neutral und tritt als eine Variante zu anderen Genotypen auf. Man spricht dann von Polymorphismen. Zur Unterscheidung von Mutation und Polymorphismus formulierten DiMauro und Andreu (2000) vier „kanonische“ Kriterien.

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Eine Mutation liegt dann vor, wenn:

  1. der Nukleotidaustausch keinem in gesunden Personen vorbeschriebenen und daher als neutral bekanntem Polymorphismus entspricht.
  2. der Nukleotidaustausch an einer
    - in der Evolution konservierten und
    - funktionell wichtigen
    Stelle liegt.
  3. Pathogene Mutationen sind bis auf wenige Ausnahmen heteroplasmisch.
  4. Der Grad der Heteroplasmie bei verschiedenen Familienmitgliedern sollte in grobem Zusammenhang mit der Ausprägung der Symptome stehen (Genotyp-Phänotyp-Relation).

Pathogene mtDNA-Mutationen führen meist zu Multisystemerkrankungen, da die Mitochondrien ubiquitär in allen Geweben vorkommen. Die meisten der Mutationen koexistieren neben der Wildtyp-mtDNA. Eine besonders hohe Mutationslast findet man in postmitotischen Geweben wie im Skelettmuskel, Herz und zentralem Nervensystem (ZNS). Daher treten besonders häufig muskuläre, kardiale und neurologische Symptome auf. Unterschiede im klinischen Bild hängen stark davon ab, welcher Teil der mtDNA von einer Mutation betroffen ist (z.B. t-RNA, Protein-kodierende Gene).

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Die gleiche Mutation kann aber auch zu verschiedenen Krankheitsbildern oder unterschiedlichen Schweregraden der Symptome führen (Pleiotropie). Dies kann durch eine unterschiedliche Verteilung der mutierten mtDNA in die verschiedenen Gewebe (Gewebsheteroplasmie), durch das Verhältnis von mutierter zu nicht-mutierter DNA oder auch durch nukleäre Einflüsse verursacht sein [Kirches et al. 2001a]. So bestehen zum Beispiel die einzelnen Komplexe der Atmungskette aus nukleär und mitochondrial kodierten Proteinen, die miteinander interagieren. Bei betroffenen Personen vorkommende, per se nicht pathogene Isoformen nukleär kodierter Proteine könnten in Kombination mit einer mitochondrialen Mutation die Ausprägung der Erkrankung verstärken [Carelli et al. 2003].

Manchmal ist auch nur ein einziges Organ betroffen. In diesem Fall könnte es sich um eine somatische Mutation handeln, die erst während der Embryogenese, nach der Differenzierung in die drei Keimblätter stattgefunden hat. Dies nennt man somatisches Mosaik.

1.3.5 Vererbung

Mitochondrien werden asexuell, rein maternal vererbt. Im Halsbereich der Spermien sind ebenfalls Mitochondrien enthalten. Sie liefern die für die Motilität der Spermien nötige Energie. Dabei entstehende Sauerstoffradikale schädigen die Mitochondrien. Da nur der Spermienkopf in die Oozyte eindringt, werden die väterlichen Chromosomen – mit nur wenigen Ausnahmen - nicht auf die Nachkommen übertragen [Cummins et al. 2000, Schwartz und Vissing 2002].

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Die Mitochondrien sind als genetisches System besonders anfällig für Mutationen. Dennoch ist das mitochondriale Genom seit Millionen Jahren in größten Teilen konserviert. Auf der anderen Seite können neue Nukleotidvarianten des mitochondrialen Genoms in sehr kurzer Zeit fixiert werden [Hauswirth und Laipis 1982]. Dies bedeutet, dass ein heteroplasmisch auftretender Polymorphismus innerhalb weniger Generationen homoplasmisch werden kann. Der Wechsel von einer Sequenzvariante zu einer anderen kann sogar von einer Generation auf die nächste stattfinden [Koehler et al. 1991].

Als Erklärung für diese Phänomene nimmt man an, dass es zu einem Zeitpunkt in der Keimzellentwicklung einen Engpass oder "bottleneck" geben muss, der nur eine geringe Zahl mitochondrialer Einheiten zur Weitervererbung zulässt. Zu diesem Engpass kommt es dadurch, dass die Zahl der mtDNA Moleküle pro Mitochondrium in einem Stadium der Oogenese auf 1-2 reduziert wird. Die reife Oozyte enthält ca. 50-100.000 Mitochondrien (Abbildung 5). Nach der Befruchtung werden diese Mitochondrien während der ersten mitotischen Teilungen auf die Tochterzellen verteilt. Die Replikation der mtDNA beginnt erst wieder im Morulastadium [Howell 2000a].

Jenuth et al. (1996) haben in Untersuchungen an heteroplasmischen Mäusen festgestellt, dass eine zufällige Verteilung der mtDNA-Varianten während der mitotischen Teilung der Oogonien, also vor der Differenzierung der primären Oozyten stattfinden muss. Sie gehen davon aus, dass die Anzahl der segregierenden Einheiten ca. 200 beträgt.

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Die Frage, ob die Genotypen, die an die nächste Generation vererbt werden, zufällig ausgewählt werden, oder ob es eine Art „Funktionsprüfung“ der Mitochondrien gibt, ist noch ungeklärt. Es gibt mathematische Modelle, die eine Fixierung von Mutationen durch reine Zufallsverteilung im Sinne des von Jenuth aufgestellten Verteilungsmusters in Frage stellen. Schülke et al. (1998) fanden in einer Familie eine Zunahme des Heteroplasmiegrades einer tRNA-Mutation zwischen zwei Generationen von 4 auf 100%. Diese Zunahme lässt sich unter der Annahme eines „bottleneck“ von 200 Einheiten und einer Zufallsverteilung nicht erklären. Eine schnelle Fixierung von Mutationen innerhalb einer Generation könnte durch weitere Phänomene wie Clusterverhalten von Mitochondrien, positive Selektion und Replikationsvorteile der mutierten mtDNA erklärt werden [Yoneda et al. 1992].

Abbildung 5: Mitochondriales „bottleneck“: Die geringste Anzahl der Mitochondrien und mtDNAs, und damit der Flaschenhals, liegt im Stadium der primordialen Keimzellen (Gonozyten) vor [Jansen und De Boer 1998]. Danach nimmt die Zahl der Mitochondrien/Zelle stetig zu und liegt im Stadium der sprungreifen Oozyte bei 50-100.000. Während der gesamten Zeit scheint die Zahl der mtDNA-Kopien/Mitochondrium bei eins zu liegen. Die mtDNA-Replikation und Mitochondrienteilung sistiert in der befruchteten Oozyte bis zum Morulastadium.

1.4 Tumoren und mitochondriale Polymorphismen

Die Forschung zur Entstehung von Tumoren konzentriert sich stark auf genetische Veränderungen, die zur Aktivierung von Onkogenen, zur Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen und zu Defekten des mismatch-repair Systems führen können.

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In den letzten Jahren wurde vermehrt von somatischen Mutationen der mtDNA in den Zellen verschiedener Tumoren berichtet. Man fand zum Beispiel Deletionen und Punktmutationen der mtDNA in kolorektalen Tumoren [ Polyak et al. 1998 ] , Magen- [Burgart et al. 1995] , Nierenzell- [Horton et al. 2000] , Lungen- und Blasenkarzinomen [ Fliss et al. 2000 ]Meist sind die beschriebenen Veränderungen homoplasmische Nukleotidsubstitutionen, von denen die meisten bereits als Polymorphismen bekannte sind [Kirches et al. 2001b].

Am besten untersucht ist der D-loop und die in ihm liegenden hypervariablen Regionen, die als hotspots für Mutationen maligner Tumoren gelten [Fliss et al. 2000].

Gegenstand der Diskussion ist, ob diese Mutationen zufällig entstanden und eine Folge klonalen Wachstums von Tumoren sind oder ob sie selektive Vorteile gegenüber dem Wildtypgenom besitzen. Es ist ungeklärt, ob sie das Entstehen und das Wachstum von Tumoren fördern oder sich neutral verhalten. Daraus ergibt sich die Frage, ob man diese Mutationen als Marker für klonales Wachstum verwenden kann.

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Coller et al. (2001) entwickelten ein Computermodell mit dem sie zeigten, dass Homoplasmie von somatischen Mutationen allein durch zufällige Replikation nach einer bestimmten Anzahl von Zellteilungen entstehen kann. Die Zellteilungsrate in Tumorvorläuferzellen ist bis zu dreifach höher als in normalem Gewebe. Dadurch könnte die Entstehung von Homoplasmie beschleunigt werden. Dennoch sind homoplasmische mtDNA-Mutationen kein tumorspezifisches Phänomen. Sie sind, allerdings seltener, auch in gesundem Gewebe zu finden.

Gleichzeitig werden aber auch Selektionsmechanismen diskutiert, die sich vor- oder nachteilig auf die Ausbreitung von Mutationen auswirken können. Chen et al. (2003) postulieren, dass die Mutationen in Tumoren nicht rein zufällig entstanden sein können, da die Mutationsfrequenz in Tumoren höher sei als man nach 300 bis 600 Teilungszyklen erwarten würde. Polyak et al. (1998) untersuchten Kolonkarzinome und fanden in 70% homoplasmische somatische Mutationen. Sie leiteten aus dieser Feststellung ab, dass das mutierte mitochondriale Genom einen Replikationsvorteil gegenüber dem Wildtyp-Genom hätte. Attardi et al. (1995) konnten zeigen, dass Signale von funktionsdefizienten Mitochondrien als eine Art Kompensationsmechanismus deren Überreplikation stimulierten. Jenuth et al (1997) konnten eine organspezifische Selektion für bzw. gegen neutrale mitochondriale Genotypen nachweisen.

Klonales Wachstum von Tumorzellen kann zur schnellen Ausbreitung von Mutationen innerhalb von Tumoren führen. Die Idee der klonalen Expansion mutierter DNA Moleküle stammt von Albertini aus den siebziger Jahren aus Versuchen mit mutierten T-Zellen [Übersichtsartikel Albertini (2001)]. Man geht davon aus, dass Mutationsfraktionen in Clustern liegen, entstanden durch klonales Wachstum ausgehend von einer einzigen Mutante. Innerhalb eines Mitochondriums liegen die mitochondrialen Genome in Clustern, die perinukleär liegenden werden bevorzugt repliziert [Davis und Clayton 1996]. Ein solches Cluster kann sich expansiv auf eine ganze Zelle und in der Folge auf ein Organ oder einen ganzen Organismus ausbreiten, je nachdem wie früh und in welcher Zelle die Mutation entstanden ist.

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Die funktionelle Bedeutung der in Tumoren gefundenen Mutationen ist ungeklärt. Taylor et al. (2003) fanden somatische Mutationen der mtDNA in Kolon-Stammzellen, was auf das Vorhandensein solcher Mutationen bereits vor der Tumorentstehung hinweist. Diese zufällig entstandenen Mutationen könnten, wenn sie sich ausbreiten, bereits durch geringe Veränderungen der Mitochondrienfunktion (zum Beispiel des Energiestoffwechsels, der ATP-Produktion und der Apoptosemechanismen) begünstigend auf die Tumorentstehung wirken. Polyak et al. (1998) postulieren hingegen, die Mutationen, die sie in Kolonkarzinomen fanden, seien erst während der Tumorigenese entstanden.

Jones et al. (2001) empfehlen, die homoplasmischen Mutationen in Tumoren als diagnostische Marker zu nutzen. Klonales Wachstum könnte etwa durch Untersuchung des D310-Traktes als Marker festgestellt werden [Ha et al. 2002]. Der in der HVR2 gelegene D310-Trakt, kommt bei vielen Individuen in heteroplasmischer Form mit mehreren Längenvarianten vor. Trotz seiner Nähe zur mitochondrialen Replikationsmaschinerie scheinen die verschiedenen Varianten keinen Einfluss auf die Replikation zu haben. In Tumoren wurde eine Tendenz dieser Region zu Homoplasmie nachgewiesen [Liu et al. 2003].

1.5 Zielsetzung

Monozygote Zwillinge verfügen über identische nukleäre DNA Kopien. Dies bedingt ihre große phänotypische Ähnlichkeit. Dennoch können sich monozygote Zwillinge in ihrem Phänotyp erheblich voneinander unterscheiden. Da beide Zwillinge in ihrem nukleären Genom identische Chromosomen aufweisen und somit über die gleiche Erbinformation verfügen, müssen diese phänotypischen Unterschiede durch andere Faktoren bedingt sein. Einer dieser Faktoren sind Umwelteinflüsse. Andere Faktoren umfassen sekundäre Genmodifikationen (z.B. Imprinting) und Gene, die nicht durch die Chromosomen vererbt werden.

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Die Mitochondrien mit ihrem Genom und den darin enthaltenen Polymorphismen werden im Morulastadium nicht immer gleichmäßig auf beide Embryonen verteilt. Ungleich verteilte Polymorphismen in mtDNA-kodierten Genen könnten daher den Phänotyp monozygoter Zwillinge bei einer Multisystemerkrankung, wie hier der Neurofibromatose Typ 1, in unterschiedliche Richtungen modifizieren.

Da mtDNA-Varianten auch bei der Tumorigenese eine Rolle zu spielen scheinen, wollte ich herausfinden, ob diese die Ursache für den Unterschied monozygoter Zwillinge mit NF1 bezüglich ihrer Tumorerkrankung und anderer phänotypischer Auffälligkeiten sein könnten.

Hierfür habe ich das mitochondriale Genom vier monozygoter, an Neurofibromatose Typ 1 erkrankter Zwillingspaare vollständig sequenziert und analysiert. Polymorphismen, die sich zwischen den Zwillingen unterschieden, sollten mit der phänotypischen Ausprägung ihrer Erkrankung korreliert werden.

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Des Weiteren habe ich die intraindividuelle Verteilung von Polymorphismen bei einem Zwillingspaar untersucht und dabei nach Unterschieden zwischen mtDNA aus Blut- und Tumorgewebe gesucht. Die Frage war, ob ich in Neurofibromen somatische mtDNA-Mutationen nachweisen kann und ob diese unter Umständen einen Einfluss auf das Entstehen der Tumore haben könnten.

Da in vorhergehenden Publikationen der D310-Trakt als Marker für klonales Tumorwachstum empfohlen wurde, wollte ich durch den Vergleich der Längenvarianten des D310-Traktes zwischen einem Zwillingspaar und seiner Mutter sowie verschiedener Tumore eines Patienten feststellen, ob es in Neurofibromen die in anderen Tumoren nachgewiesene Tendenz dieser Region zur Homoplasmie als Zeichen klonalen Wachstums gibt.


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30.03.2006