3 Material und Methoden

3.1 Materialien

3.1.1 Oligonukleotide

↓32

Alle Oligonukleotid-PCR-Primer habe ich bei Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland synthetisieren lassen.

3.1.2 Bakterienstämme

↓33

Produkt

Hersteller

E.coli JM109

Promega GmbH, Mannheim, Deutschland

3.1.3 Chemikalien

Produkt

Hersteller

λHindIII

Sigma, St. Louis, CA, USA

1000bp-DNA-ladder

Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Deutschland

100bp-DNA-ladder

Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Deutschland

Agarose

Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Deutschland

Alkalische Phosphatase

usb, Bad Homburg, Deutschland

Blue Dextran

Perkin Elmer, Foster City, USA

Borsäure

Merck, Darmstadt, Deutschland

BSA

Roche, Basel, Schweiz

Chlorform

Merck, Darmstadt, Deutschland

Deionisiertes H 2 O

J.T.Baker, Phillipsburg, NJ, USA

Ethidiumbromid

Sigma, St. Louis, USA

Ethylalkohol

Merck, Darmstadt, Deutschland

Exonuklease I

usb, Bad Homburg, Deutschland

Formamid

Gibco BRL, Life Technologies GmbH, Eggenstein, Deutschland

GeneScan 500-ROX

Applied Biosystems, Foster City, CA, USA

HaeIII

New England Bio Labs, Beverly, MA, USA

IPTG

AppliChem, Darmstadt, Deutschland

KCl

Merck, Darmstadt, Deutschland

LA PCR Kit V.2.1

TaKaRa, Kyoto, Japan

LB AGAR

Sigma, St. Louis, CA, USA

LB Medium

Sigma, St. Louis, CA, USA

Na2EDTA(TitriplexIII)

Merck, Darmstadt, Deutschland

Phenol:Chloroform:Isoamyl Alkohol

Invitrogen, Renfrewshire, Großbritannien

Proteinase K

Merck, Darmstadt, Deutschland

pGEM-T Cloning Kit

Promega GmbH, Mannheim, Deutschland

QIAquick TM Gel Extraction Kit

QIAgen Inc., Chatsworth, CA, USA

ROX (6-Carboxy-X-Rhodamin)

Applied Biosystems, Foster City, CA, USA

SDS Sodium-Dodecylsulfat 10%

Sigma, St. Louis, CA, USA

SephadexTM G-50

Amersham, Uppsala, Schweden

SOC-Medium

Sigma, St. Louis CA USA

Taq-Polymerase, Puffer, MgCl

Promega GmbH, Mannheim, Deutschland

Tris Base, Tris[hydroxymethyl]amino-methan)

Sigma, St. Louis, CA, USA

X-Gal

AppliChem, Darmstadt, Deutschland

3.1.4 Puffer, Lösungen, Medien

10x TBE-Puffer pH 8,3

↓34

Tris

1 M

Borsäure

1 M

Na2EDTA

20 mM

Puffer A

NaCl

0,1 M

Tris Base

0,05 M

EDTA

5 mM

↓35

SE-Puffer pH 8,0; autoklaviert

NaCl

75 mM

Na2 EDTA*2H 2 O

25mM

1*TE Puffer pH 8,0; autoklaviert

↓36

Tris Hcl

10 mM

EDTA

1mM

Lysepuffer pH 7,4; autoklaviert

NH4Cl

155 mM

KHCO3

10 mM

Na2EDTA*2H2O

0,1 mM

↓37

Agarosegel 0,7%

1xTBE Puffer

100 ml

Agarose

0,7 g

Ethidiumbromid

(10 mg/ml)

10 μl

3.1.5 Geräte

Sequencer: ABI Prism 3700 Genetic Analyzer

 

Thermocycler: Primus 96plus

MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland

Transilluminator

Biometra, Göttingen, Deutschland

UV-Kamera:

Biometra, Göttingen, Deutschland

Zentrifuge: Centrifuge 5804R

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Pipetten

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

↓38

3.1.6 Gebrauchswaren

Falcon Röhrchen

Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA

PCR-Tubes und Caps

Biozym, Hess. Oldendorf, Deutschland

Reaktionsgefäße 0,5 und 1ml

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Standardtips (10, 100 und 1000μl)

 

Petrischalen

Greiner, Frickenhausen, Deutschland

3.1.7 Computer Software

Amplify Version 1.2β

Bill Engels, University of Wisconsin, USA
www.engels.genetics.wisc.edu

DNaid 1.8

by Frédéric Dardel
Laboratoire de Biochimie École Polytechnique
91128 Palaiseau Cedex, France
http://www.geneticengineering.org/software/dnaid.html

GeneScan

Applied Biosystems, Foster City CA USA

Primers! for the Mac

 

Sequence Navigator Version1.0.1

Applied Biosystems, Foster City CA USA

3.2 Methoden

3.2.1 DNA Extraktion

3.2.1.1 DNA Extraktion aus EDTA-Blut

↓39

Zur Gewinnung der mitochondrialen DNA aus Blutleukozyten wird EDTA Blut mit 30 ml Lysepuffer (4°C) versetzt und 15 Minuten auf Eis geschwenkt. Dies führt zur Zerstörung der Erythrozyten, während Leukozyten und DNA erhalten bleiben. Dann habe ich bei 670 g zentrifugiert, den Überstand dekantiert und noch einmal Lysepuffer hinzugegeben. Nach erneutem Zentrifugieren und Dekantieren habe ich das entstandene Pellet mit 5 ml SE Puffer resuspendiert, 50 ml Proteinase K hinzugegeben, welche denaturierte Proteine abbaut, und geschüttelt. Dann wird als Detergens 250 μl 20% SDS hinzugegeben und bei 55°C über Nacht inkubiert. Anschließend werden nochmals 5 ml SE Puffer beigefügt, weitere 10 Minuten bei 55°C inkubiert. Dann kommen 3 ml 6M NaCl hinzu und nach 15-minütigem Zentrifugieren bei 1509 g kann man den klaren Überstand in ein Falcon Röhrchen überführen. Die Beigabe zweier Volumenteile absoluten Alkohols führt zur Fällung der DNA, die man mit einer Glaspipette in ein Reaktionsgefäß überführen kann. Als letzten Schritt habe ich 70% Ethanol beigegeben, das Salze auswäscht und die Proteinase K entfernt, während die DNA in Fällung bleibt. Das Ethanol wird nach erneutem Zentrifugieren mit einer ausgezogenen Glaspipette abgesaugt, das DNA-Pellet kann nach dem Trocknen mit 1*TE-Puffer auf eine Konzentration von 200 ng DNA/μl eingestellt werden.

3.2.1.2 DNA Extraktion aus Tumorgewebe

40 bis 50 mg des bei –80°C gefrorenen Gewebes werden zerkleinert, 400 μl Puffer A, 40 μl 10% SDS und 40 μl Proteinase K hinzugegeben und bei 37°C über 24 Stunden inkubiert. Wenn sich das Gewebe aufgelöst hat, gibt man 480 μl Phenol, Chloroform und Isoamylalkohol im Verhältnis 25:24:1 hinzu und zentrifugiert bei 15.700 g. Danach befindet sich die DNA im Überstand, den man vorsichtig abnimmt und in ein Reaktionsgefäß überführt. Dann fügt man die gleiche Menge Chloroform hinzu, zentrifugiert noch einmal bei 15.700 g und nimmt den Überstand genau ab. Es kommen 0,1 Volumenanteile Na-Acetat sowie 3 Volumenanteile Isopropanol hinzu. Wieder wird abzentrifugiert, der Überstand abgegossen und dann mit 70% Ethanol gewaschen. Schließlich erhält man ein Pellet, das in 1*TE gelöst und auf eine Konzentration von 200 ng DNA/μl eingestellt wird.

3.2.2 Polymerasekettenreaktion (PCR)

3.2.2.1 Prinzip der PCR

Die Methode der PCR wurde im Jahre 1985 durch Kary Mullis entwickelt [Mullis und Faloona 1987]. Durch dieses Verfahren wurde es möglich, bestimmte DNA Sequenzen gezielt zu vervielfältigen.

↓40

Eine aus Bakterien (z.B. T hermophilus aq uaticus oder P yrococcus fu riosus) gewonnene, thermostabile DNA-Polymerase benutzt kurze Oligonukleotidprimer als Ausgangspunkt der DNA-Synthese. Sie verlängert, in Gegenwart von Desoxynukleotiden (dNTPs) und unter den richtigen Temperaturbedingungen (gewöhnlich 72°C), den Strang entlang der Ausgangsmatrize (template) in 3’-Richtung. Die PCR ist ein zyklisches Verfahren. Ab dem dritten PCR-Zyklus entstehen Produkte, die der Länge der Zielsequenz zwischen den beiden Primern entsprechen und mit jedem weiteren Zyklus steigt die Menge der Ziel-Kopien exponentiell. Unter idealen Bedingungen sollte sich die Zielsequenz nach 20 Zyklen 220-fach vermehrt haben.

Abbildung 9: Prinzip der PCR. Die Stränge der Ziel-DNA werden durch Erhitzen aufgetrennt, damit sich spezifische Primer ( blau ) anlagern können. Mit Hilfe der Polymerase und in der PCR-Reaktionslösung enthaltener dNTPs entsteht ein neu synthetisierter DNA-Strang in 3’-Richtung. Im nächsten Schritt wird wieder denaturiert und dadurch eine erneute Primeranlagerung und Strangverlängerung ermöglicht. Ab dem dritten Zyklus entstehen Sequenzen, die der Länge der Zielsequenz entsprechen. Insgesamt läuft eine PCR-Reaktion über 25-42 Zyklen. Bis die Substrate aufgebraucht sind wird in jedem Zyklus die Zahl der DNA-Kopien verdoppelt.

Für die Spezifität einer PCR-Reaktion bedeutend ist hierbei die Hybridisierungstemperatur der Primer (Annealing-Temperatur). Zur annähernden Berechnung der Schmelztemperatur eignet sich die Formel Tm= 2(A+T)+4(G+C). Die Buchstaben A, T, G und C beziehen sich hier auf die im Primer enthaltenen Basen [nach Newton und Graham 1994].

3.2.2.2 Long-read PCR

↓41

Mit den herkömmlichen PCR-Polymerasen können Sequenzen von bis zu 5 kbp Länge amplifiziert werden. Eine spezielle LATaq TM Polymerase ermöglicht durch ihre 3’-5’-Exonukleaseaktivität das Amplifizieren von Sequenzen bis 40 kbp Länge. Die Exonuklease entfernt falsch eingebaute Basen und erhöht damit die Genauigkeit der Polymerase (=proof-reading Polymerase).

3.2.2.3 PCR-Primer Design

Die Primer habe ich mit Hilfe des freeware Computerprogramms „Primers! For the Mac“ erstellt. Um ihre Spezifität zu sichern, ist bei der Konstruktion der Oligonukleotide auf verschiedene Eigenschaften der Primer zu achten:

  1. Die Oligonukleotide sollten eine Länge zwischen 20-30 Basenpaaren haben.
  2. Beide Primer einer Reaktion sollten etwa die gleiche Hybridisierungstemperatur besitzen.
  3. Alle vier Basen sollten in einem Primer gleich häufig vertreten sein.
  4. Die Primerpaare sollten an ihren 3’-Enden weder inter- noch intramolekular komplementär sein. Ansonsten können sich Primerdimere, also Paare hybridisierter Primer, oder Haarnadelkurven ausbilden, welche die zuverlässige Hybridisierung der Primer mit der Matrizen-DNA verhindern.
  5. Dieselbe Base sollte nicht mehr als viermal hintereinander vorkommen.

↓42

Mit dem Programm „Amplify“ kann man die erstellten Primer auf ihre Spezifität testen. Das Programm führt dabei entlang einer vorgegebenen Sequenz eine virtuelle PCR durch. Wenn sich in Amplify für einen Primer mehrere Annealing-Orte oder Primerdimere (=Annealing der erstellten Primer untereinander) zeigten, habe ich die Primersequenzen verändert.

3.2.2.4 Gelelektrophorese

Um die Länge der PCR-Produkte zu kontrollieren, werden sie auf ein Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Hierbei wird die negative Ladung der DNA-Moleküle bei basischem pH genutzt. In ein elektrisches Feld gebracht wandern sie in Richtung des positiven Pols. Kleine Moleküle wandern schneller als große durch das aus einem Netz von Poren bestehende Agarosegel. Als Kontrolle lässt man neben den PCR-Produkten einen Längenstandard laufen.

Dem Gel wird Ethidiumbromid beigefügt, ein Fluoreszenzfarbstoff, der erst nach Interkalation mit DNA fluoresziert. So kann man die DNA-Banden mit einem UV-Transilluminator sichtbar machen.

3.2.2.5 Durchführung

↓43

Ich habe die von den Patienten gewonnene mtDNA zunächst mit einer Long-read PCR amplifiziert, deren Primer spezifisch für die mtDNA sind. Dadurch habe ich vermieden, sogenannte nukleäre Pseudogene zu amplifizieren, die teilweise identisch mit Sequenzen der mtDNA sind und dadurch die Ergebnisse verfälschen können [Tourmen et al. 2002]. Eine direkte Sequenzierung des resultierenden 16237 bp langen Fragmentes mit mehreren verschachtelten (nested) Primern gelang nicht. Deshalb habe ich die mtDNA in 17 PCR-Fragmente eingeteilt und für diese das Long-PCR Produkt als Template eingesetzt. Die Primer für die Long-read PCR liegen beide im Cytochrom B-Gen (MTCYB). Die das MTCYB umfassende PCR habe ich daher direkt von der Patienten DNA gemacht.

3.2.2.5.1 Long read PCR

Für die Long-read PCR habe ich das LA-PCR Kit V.2.1. von TaKaRa verwendet. Ein Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:

10x LA Taq Puffer (+Mg2+)

5,0 μl

dNTP 2,5 mM

8,0 μl

Vorwärts-Primer (10 mM)

2,5 μl

Rückwärts-Primer (10 mM)

2,5 μl

LA Taq (5 U/μl)

0,5 μl

Aqua bidest

ad 49,0 μl

+ Template DNA (100 ng/μl)

1,0 μl

↓44

Ich habe die Reagenzien auf Eis pipettiert, aliquotiert und dann das Template hinzugegeben. Im Thermocycler wurde unter folgenden Bedingungen amplifiziert:

94°C

10min zur Denaturierung

16x:94°C

50 s

68°C

8 min 15s

16x:94°C

50 s

68°C

8 min 15s +20s/Zyklus

62°C 1 min, danach Abkühlen auf 10°C

Tabelle 5: Für die Long-read PCR verwendete Oligonukleotidprimer.

Vorwärts-Primer

Lage

Rückwärts-Primer

Lage

5’-TGAGGCCAAATATC

ATTCTGAGGGGC-3’

15149-

15175

5’-TTTCATCATGCGGAG

ATGTTGGATGG-3’

14816-

14790

3.2.2.5.2 PCR

↓45

Für die weiteren nested PCR-Reaktionen habe ich Taq-Polymerase mit dem dazugehörigen 10 x Puffer und 25 mM Magnesiumchlorid verwendet.

Ein PCR-Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:

10x Promega Puffer

5,0 μl

MgCl 25 mM

7,0 μl

dNTP 10 mM

2,0 μl

Vorwärts-Primer (100 ng/μl)

0,5 μl

Rückwärts-Primer (100 ng/μl)

0,5 μl

Taq-Polymerase (5 U/μl)

0,2 μl

LA-TaqTM (5 U/μl)

0,2 μl

BSA (20 mg/ml)

0,4 μl

H2O

ad 49 μl

+ Template DNA

1,0 μl

↓46

Da die Zielsequenzen zum Teil eine Länge von über 1000 bp hatten, habe ich zusätzlich zur hitzestabilen Taq-Polymerase (aus Thermophilus aquaticus) eine geringe Menge proof-reading LA-Taq-Polymerase hinzugefügt, um die Ausbeute zu verbessern. Als Template verwendete ich das LA-PCR Produkt. für die das MTCYB-Gen betreffende PCR-Reaktion direkt die Patienten DNA.

Die Reagenzien wurden auf Eis pipettiert, dann in 200 μl PCR-Gefäße aliquotiert und die Template-DNA hinzugegeben.

Mit einem Thermocycler wurde unter folgenden Bedingungen amplifiziert:

↓47

96°C

6 min

16x:96°C

30 s

59°C

30 s

72°C

2 min

18x:96°C

30 s

59°C

30 s

72°C

2 min + 10 s/Zyklus

72°C 10 min, danach sofortiges Abkühlen auf 4°C.

Tabelle 6: Darstellung der Sequenzen und Lage der für die Amplifikation der 17 verschiedenen mtDNA-Fragmente verwendeten Oligonukleotidprimer als auch die Länge der entstandenen Fragmente.

Fragment

Vorwärts-Primer

Lage

Rückwärts-Primer

Lage

Länge

12sRNA,Phe, Val

5’-CCCATCCTACC

CAGCACACACA-3’

500 –

521

5’-CGCCTATACTT

TATTTGGGTAA-3’

1750 –

1729

1251bp

16sRNA

5’-ACTTGGACGAAC

CAGAGTG-3’

1590 –

1608

5’-ATGGGTACAATGA

GGAGTAGGAGGT-3’

3344 –

3320

1755bp

Leu,MTND1

5’-AGGACAAGAG

AAATAAGGCC-3’

3130 –

3149

5’-AAGATGGTAGA

GTAGATGACGG-3’

4510 –

4489

1381bp

MTND2,Ile,

Gln,Met

5’-CCAGCATTCCC

CCTCAAACCTA-3’

4280 –

4301

5’-GGGGTTTTGC

AGTCCTTAGC-3’

5604 –

5585

1325bp

Trp,Ala,Asn

Cys,Tyr

5’-CGCTACTCCTA

CCTATCTCC-3’

5470 –

5489

5’-AGAATAGTCA

ACGGTCGGCG-3’

5928 –

5909

459bp

MTCo I

5’-CTCAGCCATTT

TACCTCACCC-3’

5877 –

5897

5’-TTGAAAAAGTC

ATGGAGGCCAT-3’

7516 –

7495

1640bp

MTCo II,Ser,

Asp

5’-ATGCCCCCCAC

CCTACCACAC-3’

7394 –

7414

5’-GGCTCTAGAGG

GGGTAGAGGGG-3’

8294 –

8273

901bp

Lys ,ATPase

5’-TCGTCCTAGAA

TTAATTCCC-3’

8211 –

8230

5’-TCTGAGGCTTGT

AGGAGGGTA-3’

9745 –

9725

1535bp

MTCo III

5’-TCCAAGCCTAC

GTTTTCACAC-3’

9152 –

9172

5’-AAGGCTAGGAG

GGTGTTGATT-3’

10102 –

10082

951bp

Gly,Arg,

MTND3

5’-GAAGCCGCCGC

CTGATACTG-3’

9912 –

9931

5’-GAGGATATGAG

GTGTGAGCG-3’

10555 –

10536

644bp

MTND4L+4#1

5’-GAGTGACTACA

AAAAGGATT-3’

10371 –

10390

5’-GTGCGATGAG

TAGGGGAAGG-3’

11258 –

11238

888bp

MTND4L+4#2,

His,Ser2,

Leu2

5’-CCACTATCACG

AAAAAAACTC-3’

11020 –

11040

5’-AGGGTTAGG

GTGGTTATAGT-3’

12371 –

12352

1352bp

MTND5#1

5’-CAACATGGC

TTTCTCAACTTT-3’

12250 –

12270

5’-AAGCGGATGAG

TAAGAAGAT-3’

13124 –

13105

875bp

MTND5#2

5’-CAACACAGC

ACGGATTCAAG-3’

12828 –

12847

5’-CTATTGAGGAG

TATCCTGAGGC-3’

14453 –

14432

1626bp

MTND6,Glu

5’-TCTTCTTCCCA

CTCATCCTAA-3’

14108 –

14128

5’-TTTCATCATGCG

GCGCTGTGGATGG-3’

14816 –

14790

709bp

MTCYB

5’-CACCGACCAATG

ATATGAAAAACC-3’

14695 –

14717

5’-GGAAAAAGGTTTT

CATCTCCG-3’

15946 –

15926

1252bp

D-loop

5’-GCATCCGTACTAT

ACTTCAC-3’

15806 –

15825

5’-GGGTGAACTCACT

GGAACGG-3’

726 –

707

1489bp

3.2.2.5.3 Gelelektrophorese

Für einen 100 ml Ansatz eines 0,7%-igen Gels werden 100 ml 1x TBE Puffer und 0,7 g Agarose zum Kochen gebracht. Nach kurzem Abkühlen werden 10 μl Ethidiumbromid (10 mg/ml) hinzugegeben. Die Mischung wird nach weiterer Abkühlung auf ca. 50°C in eine Gelschlitten gegossen. Ein in den Gelschlitten ragender Kamm formt Taschen, in die nach dem Erstarren des Gels die Proben pipettiert werden. Als Laufpuffer für das Gel wurde ebenfalls 1x TBE Puffer verwendet.

↓48

5 μl des PCR-Produktes wurden nach Zugabe von jeweils 2 μl Ladepuffer (Blue Dextran + Ficoll) auf das Gel aufgetragen und bei 9 V/cm ca. 60 Minuten lang elektrophoriert. Als Längenstandard habe ich je nach erwarteter Länge des PCR-Produkts 100 bp- und 1000 bp-Leitern, für Long-range PCR-Produkte λ-HindIII verwendet.

Anschließend habe ich die Fluoreszenz der ethidiumbromidgefärbten DNA-Banden auf einem Transilluminator nach Anregung mit kurzwelligem UV-Licht (302 nm) sichtbar gemacht und mit einer Kamera fotografiert.

3.2.3 DNA Sequenzierung

3.2.3.1 Prinzip der Sequenzierung

Ich habe nach der Kettenabbruch-Didesoxy-Methode nach Sanger et al. (1977) sequenziert. Durch eine Sequenzierungs-PCR werden Reihen von Oligonukleotiden produziert, deren Summe alle möglichen Fragmente eines DNA-Segmentes darstellt. Dem PCR Ansatz werden neben den Desoxyribonukleosidtriphosphaten (dNTPs) in einem bestimmten Verhältnis Didesoxynukleotide (ddNTPs) zugegeben, die nach ihrem Einbau in die sich bildende Nukleotidkette eine weitere Ausbildung von Phosphodiesterbindungen und somit eine Verlängerung der Kette durch die DNA-Polymerase unmöglich machen. Die vier verwendeten ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) sind mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert (ddATP mit R6G, ddCTP mit ROX, ddGTP mit R110, ddTTP mit TAMRA), die jeweils unterschiedliche Exzitations- und Emissionsspektren besitzen.

↓49

Zur automatischen Sequenzanalyse habe ich einen automatischen Kapillarsequencer (ABI Prism 3700) verwendet. Er besitzt 16 mit flüssigem Polymer (POP6=Performance optimized Polymer 6) gefüllte Kapillaren. Entlang dieser Kapillaren wird eine Spannung angelegt und die DNA-Moleküle werden in die Kapillaren elektrophoriert. Dabei wandern kleine Moleküle schneller als große an einem Detektor vorbei, der mit einem Laserstrahl die fluoreszenzmarkierten ddNTPs zur Fluoreszenz anregt. Das Fluoreszenzlicht wird von einer Kamera registriert, in elektrische Information umgewandelt und an einen Computer weitergeleitet der die gewonnenen Daten mit einer speziellen Software in vierfarbige Elektropherogramme umwandelt. Jedem Didesoxynukleotid ist hierbei eine andere Farbe zugeordnet (A=grün, T=rot, C=blau, G=schwarz).

3.2.3.2 Durchführung

Ich habe das gesamte mitochondriale Genom von ca. 16,5 kbp einmal vollständig sequenziert. Die Sequenzierprimer lagen teilweise auf dem H- und teilweise auf dem L-Strang der mtDNA. Fragliche Sequenzen habe ich zum Ausschluss von Fehlern zusätzlich auf dem jeweils komplementären Strang kontrolliert.

3.2.3.2.1 Reinigung der PCR-Produkte

Für die Sequenzierungsreaktion ist es von Bedeutung, dass dNTPs und ddNTPs in einem bestimmten Verhältnis beigegeben werden. In den als Matrize verwendeten PCR Produkten sind meist noch Reaktionsprodukte enthalten, die bei der PCR-Reaktion nicht verbraucht wurden und zunächst entfernt werden müssen. Dies erfolgte mit alkalischer Phosphatase und Exonuklease I. Die Phosphatase spaltet von den dNTPs die Phosphatreste ab, wodurch sie nicht mehr reaktionsfähig sind. Exonuklease I lysiert einsträngige DNA und vernichtet so unverbrauchte Oligonukleotidpromer, lässt aber die doppelsträngigen PCR-Produkte intakt. Je 0,5 μl Exonuklease und alkalische Phosphatase wurden auf 2 μl PCR-Produkt plus 3 μl Aqua bidest gegeben. Im Thermocycler wurde diese Mischung 30 Minuten bei 37° inkubiert, danach 15 Minuten auf 85°C erhitzt, um die beiden Enzyme wieder zu inaktivieren.

3.2.3.2.2 Sequenzierung

↓50

Die Sequenzierungsreaktion erfolgte mittels des ABI Prism® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit Version 2.0.

Das Kit enthält einen Mix aus AmpliTaq-Polymerase FS, MgCl, dNTPs und farbmarkierten ddNTPs, sowie einen Tris-HCl Puffer (pH 9,0). Die Taq-Polymerase FS wurde speziell gentechnisch verändert und baut, im Gegensatz zur normalen Taq-Polymerase, dNTPs und die durch die Fluoreszenzmarkierung sehr großen ddNTPs gleich gut in den entstehenden DNA-Strang ein.

Der Sequenzierungs-PCR-Ansatz setzt sich wie folgt zusammen:

↓51

gereinigtes PCR-Produkt

6,0 μl

(incl. Exonuklease, Alkalische Phosphatase und Aqua bidest)

Primer (25 ng/μl)

1,0 μl

BD-Mix

2,0 μl

BD-Buffer

1,0 μl

Es wurde auf Eis pipettiert und unter folgenden Bedingungen im Thermocycler amplifiziert:

32X:96°C

1°/s

96°C

10 s

50°C

1°/s

50°C

5 s

60°C

1°/s

60°C

4 min danach sofortiges Abkühlen auf 4°C

↓52

Als Sequenzierungsprimer habe ich die oben aufgeführten PCR-Primer verwendet (Tabelle 6) und zusätzlich mit Hilfe des Programms „Primers! For the Mac“ weitere verschachtelte (nested) Primer hergestellt (Tabelle 7). So entstanden sich überlappende Sequenzen von 300 bis 500 bp Länge.

Tabelle 7: Sequenzierungsprimer und ihre Lage auf der mtDNA. F=Forward–Primer, R=Reverse–Primer.

Fragment

Primer-Sequenz

Lage

Vorwärts /

Rückwärts

12sRNA,Phe,

Val

5’-CCCATCCTACCCAGCACACACA-3’

500–

521

F

 

5’-TCCCAGTTTGGGTCTTAGCTATTG-3’

1075–

1052

R

 

5’-CGGTCACACGATTAACCCAAG-3’

900–

920

F

 

5’-CGCCTATACTTTATTTGGGTAA-3’

1750-

1729

R

16sRNA

5’-ACTTGGACGAACCAGAGTG-3’

1590–

1608

F

 

5’- AACCTTTCCTTATGAGCATGCCT-3’

2456–

2434

R

 

5’- AAACAGGCGGGGTAAGATTTG-3’

2499–

2479

R

 

5’- TCATTATTACCCTCACTGTCAACCC-3’

2404–

2428

F

 

5’- ACCTCGGAGCAGAACCCAA-3’

2820–

2838

F

Leu,MTND1

5’- AGGACAAGAGAAATAAGGCC-3’

3130–

3149

F

 

5’- TCCTATTTATTCTAGCCACCTC-3’

3611–

3632

F

 

5’- AAGATGGTAGAGTAGATGACGG-3’

4510–

4489

R

MTND2,Ile,Gln,

Met

5’- CCAGCATTCCCCCTCAAACCTA-3’

4280–

4301

F

 

5’- ACCGCATCCATAATCCTTCTA-3’

4661–

4681

F

 

5’- GCCTTCTCCTCACTCTCTCAA-3’

4923–

4943

F

 

5’- GGGTTTTGCAGTCCTTAGCTGTT-3’

5603–

5581

R

Trp,Ala,Asn,

Cys,Tyr

5’- CGCTACTCCTACCTATCTCC-3’

5470–

5489

F

 

5’- AGAATAGTCAACGGTCGGCG-3’

5928–

5909

R

MTCo I

5’- TTATGTTGTTTATGCGGGGAA-3’

6204–

6184

R

 

5’- CAACCTTCTAGGTAACGACCACATC-3’

6038–

6062

F

 

5’- CGTCCTAATCACAGCAGTCCT-3’

6464–

6484

F

 

5’- GTTCTTTTTTTCCGGAGTAGT-3’

6702–

6682

R

 

5’- ATTTTGGCGTAGGTTTGGTCT-3’

7138–

7118

R

 

5’- TTGAAAAAGTCATGGAGGCCAT-3’

7516–

7495

R

MTCo II,Ser,

Asp

5’- ATGCCCCCCACCCTACCACAC-3’

7394–

7414

F

 

5’- GGCTCTAGAGGGGGTAGAGGGG-3’

8294–

8273

R

Lys,ATPase

5’- TGAGGGAGGTAGGTGGTAGTTTGT-3’

8479–

8456

R

 

5’- TCGTCCTAGAATTAATTCCC-3’

8211–

8230

F

 

5’- ACCCGCCGCAGTACTGATCAT-3’

8577–

8597

F

 

5’ CACACCTACACCCCTTATCCC-3’

8922–

8942

F

MTCo III

5’- TCCAAGCCTACGTTTTCACAC-3’

9152–

9172

F

 

5’- TCTGAGGCTTGTAGGAGGGTA-3’

9745–

9725

R

 

5’- AAGGCTAGGAGGGTGTTGATT-3’

10102–

10082

R

Gly,Arg,MTND3

5’- GAAGCCGCCGCCTGATACTG-3’

9912–

9931

F

 

5’- GAGGATATGAGGTGTGAGCG-3’

10555– 10536

R

MTND4L+4#1

5’- GAGTGACTACAAAAAGGATT-3’

10371– 10390

F

 

5’- GTTTTTTTCGTGATAGTGGT-3’

11039– 11020

R

 

5’- TCAATCTCCAACACATATGGCCT-3’

10707– 10729

F

 

5’- GTGCGATGAGTAGGGGAAGG-3’

11258– 11238

R

MTND4L+4#2,

His,Ser2,Leu2

5’- CCACTATCACGAAAAAAACTC-3’

11020– 11040

F

 

5’- TACGCCTCACACTCATTCTCA-3’

11490– 11510

F

 

5’- GGACTTCAAACTCTACTCCC-3’

11798– 11817

F

 

5’- AGGGTTAGGGTGGTTATAGT-3’

12371– 12352

R

MTND5#1

5’- GCTATCCATTGGTCTTAGGCCC-3’

12283– 12304

F

 

5’- GCTAAGGCGAGGATGAAACC-3’

12896– 12877

R

 

5’- AAGCGGATGAGTAAGAAGAT-3’

13124– 13105

R

 

5’- TACCGCTAACAACCTATTCCAACTG-3’

12732– 12756

F

MTND5#2

5’- CAACACAGCAGCCATTCAAG-3’

12828– 12847

F

 

5’- TCTTCTTACTCATCCGCTTCC-3’

13105– 13125

F

 

5’- TAGAGGGGGATTGTTGTTTGGA-3’

13790– 13769

R

 

5’- TCCCCACCCTTACTAACATTAACG-3’

13646– 13669

F

MTND6,Glu

5’- TCTTCTTCCCACTCATCCTAA-3’

14108– 14128

F

 

5’- TAAACCCATATAACCTCCCCCAA-3’

14515– 14537

F

 

5’- AGGTCGATGAATGAGTGGTT-3’

14786– 14767

R

MTCYB

5’- CACGACCAATGATATGAAAAACC-3’

14695– 14717

F

 

5’- CTGAGTAGCCTCCTCAGATTCAT-3’

15254– 15232

R

 

5’- GCAACTATAGCAACAGCCTTC-3’

15110– 15130

F

 

5’- GAATGGGAGGTGATTCCTAGG-3’

15390– 15370

R

 

5’- CCTCCCATTCCGATAAAATC-3’

15381– 15400

F

 

5’- GGAAAAAGGTTTTCATCTCCG-3’

15946– 15926

R

D-loop

5’- TAAGGGTGGGTAGGTTTGTTGGT-3’

16299– 16277

R

 

5’- GCATCCGTACTATACTTCAC-3’

15806– 15825

F

 

5’- GGATGAGGCAGGAATCAAAGAC-3’

151– 130

R

 

5’- CAACCCTCAACTATCACACAT-3’

16218– 16238

F

 

5’- CACCCTATTAACCACTCACGGG-3’

15–36

F

 

5’-TTATGGGGTGATGTGAGCCC-3’

644– 625

R

 

5’-GGGTGAACTCACTGGAACGG-3’

726– 707

R

3.2.3.2.3 Aufreinigung der Sequenzierungsprodukte

Nach der Sequenzierungs-PCR folgt die Aufreinigung der Produkte mit 75%-igem Ethanol. Dieser Schritt ist notwendig, um nicht eingebaute fluoreszenzmarkierte ddNTPs zu entfernen.

↓53

Dem Cyclesequencing-Mix habe ich 26 μl deionisiertes, autoklaviertes Wasser und 64 μ l 95%iges Ethanol zupipettiert. Nach 20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur habe ich bei 1699 g 60 Minuten zentrifugiert, um das Produkt auszufällen. Nach dem Abgießen des Überstands habe ich noch einmal 100 μ l 70% Ethanol zugegeben und 10 Minuten bei 1699 g zentrifugiert. Den Überstand habe ich wieder abgegossen und das Pellet für die Gelelektrophorese weiterverarbeitet.

3.2.3.2.4 Gelelektrophorese am ABI Prism 3700

Zu den aufgereinigten Produkten der Sequenzierungs-PCR habe ich jeweils 16 μl deionisiertes Wasser gegeben. Da für die Gelelektrophorese geringe Konzentrationen von Produkt ausreichen, habe ich die Proben für die Sequenzierung noch mal 1:4 mit deionisiertem Wasser verdünnt (Sequenziervolumen 20 μl).

3.2.3.2.5 Auswertung

Die vom Sequencer ermittelten Daten werden an einen Computer weitergeleitet und mit einer Analyse-Software in Kurvendiagramme umgewandelt. Die vier Basen werden dabei in verschiedenen Farben dargestellt. Kurven, die nicht eindeutig einer Base zugeordnet werden können, werden mit N gekennzeichnet.

↓54

Die Kurvendiagramme habe ich mit einer speziellen Software (Sequence Navigator Version 1.0.1) mit der Genbanksequenz NC_001807, die als die mtDNA-Standardsequenz festgelegt ist, verglichen.

Mit Hilfe dieses Programms kann man die zu vergleichenden Sequenzen aneinander ausrichten (Alignment). Hierbei werden ungleiche Stellen automatisch markiert. Dadurch wird die Suche nach Polymorphismen und Mutationen erheblich erleichtert.

Heteroplasmische mtDNA-Varianten werden durch die Software nicht immer sicher erkannt, da in diesem Falle zwei Kurven unterschiedlicher Höhe übereinander liegen. Es kann passieren, dass der Computer die kleinere der Kurven als Hintergrund wertet. Aus diesem Grund habe ich alle Sequenzen zusätzlich visuell ausgewertet.

3.2.3.3 Vergleich der Aminosäuresequenzen

↓55

Das Programm Sequence Navigator ermöglicht die Umwandlung von DNA-Sequenzen in die entsprechenden Aminosäuren. Beim Vergleich mit der Aminosäuresequenz der Genbanksequenz NC_001807 konnte ich bei allen Polymorphismen überprüfen, ob sie zu einem Aminosäureaustausch führen.

3.2.4 Genotypisierung des D310-Traktes

Bei allen Patienten sowie der Mutter (MA) des Zwillingspaares A habe ich eine hypervariable Region zwischen bp 303 und 310 (D-310-Trakt) auf das Vorkommen von Heteroplasmie im Blut untersucht. Bei den Zwillingen A1 und A2 standen mir zusätzlich mehrere Neurofibrome für diese Analyse zur Verfügung.

3.2.4.1 Prinzip der Genotypisierung

Mit dem ABI Prism® 3100 Genetic Analyzer können fluoreszenzmarkierte DNA Fragmente ihrer Länge nach aufgetrennt werden. Durch den Vergleich mit einem der Reaktion beigefügten Standard kann die Länge jedes Fragments auf ein Basenpaare genau bestimmt werden. Die Signale werden wie bei der Sequenzierung durch einen Laser erfasst und in elektrische Signale umgewandelt. Mit Hilfe der GeneScan Analysis Software werden Kurvendiagramme erstellt. Das Integral unter jeder Kurve ist proportional zur relativen Menge der jeweiligen Fragmente in der Probe.

3.2.4.2 Klonierung von PCR Produkten

↓56

Zur Bestimmung der Längen unterschiedlicher HVR2-Regionen benötigt man einen Standard mit definierter Länge. Um solch einen Standard zu erhalten, habe ich ein die HVR2 enthaltendes PCR-Produkt der Kontrollperson in einen Vektor kloniert. Durch die Klonierung wird es möglich, eine einzelne Gensequenz gezielt zu vervielfältigen und zu sequenzieren. Die Sequenzierung ermöglicht die direkte Abzählung der repetitiven Bassensequenzen. In diesem Falle war dies wichtig, da die HVR2 bei einem Individuum in verschiedenen Haplotypen, also heteroplasmisch vorliegen kann.

Das zu klonierende Genfragment wird in einen Vektor ligiert und das entstandene rekombinierte Molekül durch Transformation in eine Wirtszelle (hier Escherichia coli JM109) eingebracht. In der Wirtszelle wird der Vektor vervielfältigt. Es entsteht ein Klon, der viele identische Kopien des gewünschten Fragments enthält.

Der Vektor besitzt bestimmte Eigenschaften, die für die Klonierung wichtig sind: An einer Restriktionsschnittstelle kann das ringförmige Molekül mit Hilfe einer Restriktionsendonuklease Typ II geöffnet und das DNA-Fragment durch Zugabe einer Ligase eingebaut werden. Die Schnittstelle sitzt inmitten des lacZ’-Gens, das für einen Teil der β-Galactosidase kodiert. Wird das DNA-Fragment eingebaut, kann keine β-Galactosidase synthetisiert werden. Durch Zugabe von X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid), einem Substrat, das durch die β-Galactosidase gespalten und in ein blaues Produkt umgewandelt wird, kann man Kolonien, die das Fragment eingebaut haben (weiß), von Kolonien ohne Fragment (blau) unterscheiden.

↓57

Ausserdem enthält der Vektor ein Antibiotikaresistenzgen (hier Ampicillin) das bewirkt, dass nur ein mit diesem Vektor transformiertes Bakterium auf einem mit Ampicillin versetzten Medium wachsen kann.

3.2.4.2.1 Klonierungs-PCR

Die Klonierungs-PCR habe ich nach den unter 3.2.2.5.2 genannten Bedingungen durchgeführt. Als einziger Unterschied wurde dem Ansatz keine LA-Taq zugegeben, da die Zielsequenz nur eine Länge von 412 bp hat.

Tabelle 8: Oligonukleotidprimer für die Klonierungs-PCR und ihre Lage auf der mtDNA.

Vorwärts-Primer

Lage

Rückwärts-Primer

Lage

5’-CACCCTATTAACCA

CTCACGGG-3’

15–36

5’-TTAAAAGTGCATAC

CGCCAAAAG-3’

426-404

↓58

Das PCR-Produkt habe ich anschliessend in einem 1,5%-igen Agarosegel aufgetrennt und ausgeschnitten. Mit dem QIAquick Gel Extraction Kit wurde das Produkt laut Protokoll der Firma aus dem Gel gelöst. So stand es in gereinigter Form für die Klonierung zur Verfügung.

3.2.4.2.2 Klonierung

Zur Klonierung habe ich das pGEM®-T Vektor System von Promega verwendet. Es enthält den pGEM®-T Vektor (50 ng/μl), Control Insert DNA (4 ng/μl), T4 DNA Ligase (100 U) und 2x Rapid Ligation Buffer.

Der pGEM®-T Vektor wird mit der Restriktionsendonuklease EcoR V geschnitten. An den 3’-Enden der Insertionsstelle wird jeweils einen Thymidin-Rest angehängt. Bei dieser, auch TA-Cloning genannten Methode nutzt man aus, dass die Taq-DNA-Polymerase bei der PCR Reaktion an das 3’-Ende des Produkts ein 3’-überhängendes Adenin anfügt. Die A-und T-Reste in Vektor und Amplifikat erleichtern die Ligation.

↓59

Für die Ligation habe ich folgenden Ansatz hergestellt und über Nacht bei 4°C inkubiert:

2x Ligasepuffer

5 μl

pGEM®-T Vektor

1 μl

T7 DNA Ligase

1 μl

Aqua bidest

2 μl

+ PCR-Produkt

1 μl

Zur Transformation habe ich 5 μl des Ligationsansatzes auf 50 μl Escherichia coli JM109 gegeben. Um die Vektoren in die Zellen einzubringen, wurde der Ansatz für 45 Sekunden bei 42°C hitzegeschockt, danach wieder auf Eis gestellt. Damit sich die Zellen regenerieren konnten habe ich 500 μl SOC-Medium hinzugegeben und den Ansatz für eine Stunde bei 37°C und 225 rpm auf den Schüttler gestellt.

↓60

Für die Platten wurden 17,5 g LB Agar in 0,5 l H2O gelöst, autoklaviert und mit Ampicillin (125 mg/ml) versetzt. Nach dem Erstarren des Agars habe ich auf jede Platte 100 μl IPTG (Isopropylthiogalactosid) und 20 μl X-Gal aufgetragen. Das IPTG ist ein Induktor der bakterienllen RNA-Polymerase und führt zur Transkription des lacZ’-Gens, welches für den blau/weiss-Test benötigt wird. Auf zwei Agarplatten wurden jeweils 50 μl des Transformationsansatzes ausgestrichen und diese bei 37°C über Nacht bebrütet.

Um anschliessend einzelne weiß gefärbte, also rekombinantes Plasmid enthaltende Kolonien weiter zu vermehren, habe ich sie in eine Minikultur aus 5 ml LB-Medium und Ampicillin (125 mg/ml) gegeben und über Nacht bei 37°C geschüttelt (225 rpm). Mit einem Minipräp Kit (QIAgen) wurde das rekombinante Plasmid schließlich laut Protokoll der Firma aufgereinigt.

Um festzustellen, ob das richtige Fragment kloniert wurde, habe ich die Plasmid-DNA als Template für eine PCR eingesetzt und das Produkt sequenziert.

3.2.4.3 PCR mit fluoreszenzmarkiertem-Primer

↓61

Zur Genotypisierung wird ein PCR-Produkt erstellt, bei dem der Vorwärts-Primer mit FAM (6-carboxy-fluorescin) fluoreszenzmarkiert ist.

Tabelle 9: Oligonukleotidprimer für die Genotypisierung und ihre Lage auf der mtDNA

FAM-Primer Vorwärts

Lage

Rückwärts-Primer

Lage

5’-FAM-GCCACTTTCC

ACACAGACATCATA-3’

260 – 283

5’-TTAAAAGTGCATAC

CGCCAAAAG-3’

426 – 404

Die zu analysierenden Proben habe ich unter folgenden Bedingungen amplifiziert:

↓62

96°C

10 min

42 x 94°C

1 min

58°C

1 min

72°C

1 min

72° 10 min

danach sofortiges Abkühlen auf 4°C

3.2.4.4 Restriktion mit HaeIII

Die PCR-Produkte aus 3.2.3.4.5 wurden mit dem Restriktionsenzym Hae III (aus Haemophilus aegypticus) verdaut. Das Enzym erkennt die GGCC-Sequenz und der Schnitt führt zu glatten Enden. Die GGCC-Sequenz liegt unmittelbar hinter dem zu untersuchenden D310-Trakt an Position 322-325.

Der Restriktionsansatz:

↓63

Hae III (10000 U/ml)

1,0 μl

10 x NEB Puffer

1,0 μl

BSA (1 μg/μl)

1,0 μl

PCR-Produkt

6,0 μl

wurde auf Eis pipettiert und dann über Nacht bei 37°C inkubiert.

Zur Erfolgskontrolle habe ich auf einem 2,5 %igen Agarosegel 3,0 μl des geschnittenen, 64 bp langen Produktes neben dem ungeschnittenen, 167 bp langen PCR-Produkt aufgetragen (Abbildung 11).

3.2.4.5 Genescan

↓64

Zur Genotypisierung habe ich jeweils 0,1 μl des Restriktionsproduktes zu einem Ansatz aus 9,0 μl Formamid und 0,25 μl ROX 500 (6-carboxy-X-rhodamin) gegeben. Das Formamid verhindert die Doppelstrangbildung, ROX 500 ist ein fluoreszenzmarkierter Längenstandard für die Genotypisierung. Unmittelbar vor der Analyse müssen die Proben bei 96°C 5 Minuten denaturiert und dann auf Eis zum Sequencer überführt werden.

Abbildung 10: Ort der Hybridisierung des FAM-markierten Primers, der D310-Trakt (CCCCCCCTCCCCCC) und die Schnittstelle für HaeIII im D-loop. Der D310-Trakt ist aus einer Sequenzierungsreaktion mit der Plasmid DNA in die Abbildung eingefügt. Die für die Genotypisierung verwendete Standardsequenz hat eine Länge von 65 bp.

Abbildung 11: Gelelektrophorese. In der Mitte ist das PCR Produkt für die Genotypisierung vor (links) und nach (rechts) der Restriktion mit Hae III aufgetragen. Am Rand ist zu beiden Seiten ein Längenstandard aufgetragen.

3.2.4.5.1 Auswertung

↓65

Die Auswertung der Genotypisierung erfolgte mit Hilfe der GeneScan Analysis Software. Es entstehen Kurvendiagramme, jede Kurve entspricht einer Längenvariante. Durch Vergleich mit dem Längenstandard ROX 500 kann man die genaue Länge in Basenpaaren bestimmen. Die Software integriert auch die Fläche unter den jeweiligen Kurven, welche die relative Menge der Variante angibt.


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30.03.2006