5 Diskussion

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Ich bin in dieser Arbeit der Frage nachgegangen, ob mitochondriale Polymorphismen die unterschiedliche phänotypische Ausprägung einer monogenen Erkrankung bei monozygoten Zwillingen beeinflussen können. Monozygote Zwillinge mit einer monogenetischen Erkrankung (hier Neurofibromatose vom Typ 1, NF1) eignen sich für solch eine Untersuchung besonders, da der genetische Hintergrund des nukleären Genoms beider Zwillinge identisch ist und Unterschiede der mtDNA, falls vorhanden, einfacher mit dem Phänotyp korreliert werden können.

Bei der Untersuchung des vollständigen mitochondrialen Genoms aus Blutzellen konnte ich keinen Unterschied zwischen den phänotypisch differenten, an NF1 erkrankten Zwillingen nachweisen.

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Beim Vergleich der vollständigen mtDNA-Sequenzen fand ich bei den Zwillingen, bei denen ich auch operativ entfernte Hautneurofibrome untersuchen konnte, keine Sequenzunterschiede zwischen der aus Blutzellen und aus verschiedenen Neurofibromen extrahierten mtDNA.

Der in der Hypervariablen Region 2 (HVR2) liegende D310-Trakt liegt sowohl bei gesunden als auch bei kranken Personen oft in heteroplasmischer Form vor. In meinen Untersuchungen konnte ich zeigen, dass die einzelnen Haplotypen in einem annähernd konstanten Verhältnis von der Mutter auf die Zwillinge vererbt wurden. Auch im Vergleich zwischen verschiedenen Geweben bzw. Tumoren eines Individuums änderte sich das Verhältnis der Haplotypen nicht. Innerhalb der Tumoren zeigte sich keine Tendenz zur klonalen Ausbreitung eines der Haplotypen.

5.1 Mitochondriale Polymorphismen und der unterschiedliche NF1-Phänotyp bei monozygoten Zwillingen

Interindividuelle Sequenzunterschiede der mtDNA könnten auf die Bedeutung mitochondrialer Polymorphismen für die phänotypische Diskordanz der Neurofibromatose Typ 1 zwischen monozygoten Zwillingen hinweisen. Hierbei verfolgte ich zunächst die Hypothese, dass bei der Mutter bereits in heteroplasmischer Form vorhandene oder in der Keimbahn entstandene Sequenzvarianten in unterschiedlichen Anteilen auf die Embryonen übertragen wurden. Ähnlich den bekannten Mitochondropathien könnte ein Polymorphismus durch zufällige oder auch gerichtete Replikation einen Heteroplasmiegrad erreichen, bei dem er eine funktionelle Bedeutung erlangt. Eine andere Möglichkeit neben der asymmetrischen Vererbung wäre eine in einem der Zwillinge früh in der Entwicklung entstandene somatische Neumutation.

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Ähnlich war der Ansatz von Kösel et al. (2000). Sie untersuchten den D-loop und das Cytochrom b Gen (MTCYB) vier monozygoter Zwillingspaare, von denen jeweils einer an Morbus Parkinson erkrankt war. Sie konnten keine Sequenzunterschiede in der mtDNA nachweisen. Auch bei den hier untersuchten Patienten fand ich keine interindividuellen Unterschiede bei der Sequenzierung des kompletten mitochondrialen Genoms aus Blutzellen. Im anschließenden Vergleich der mtDNA aus Blut- und Tumorzellen sowie verschiedener Tumore untereinander fand ich ebenfalls keine Sequenzunterschiede. Somit hat nach meinen Ergebnissen das mitochondriale Genom im Falle der Neurofibromatose vom Typ 1 keinen Einfluss auf die unterschiedliche Ausprägung der Erkrankung.

Bei der Sequenzierung fand ich fast ausschließlich in den Datenbanken (Mitomap) bereits erfasste Polymorphismen. Diese Polymorphismen verhalten sich wahrscheinlich neutral und sind Ausdruck der genetischen Variabilität der mtDNA. Die in meiner Untersuchung nachweisbare Häufung der Polymorphismen im Bereich des D-loops und des MTCYB-Gens entspricht Regionen, die auch in großen Populationsuntersuchungen sehr variabel sind. Diese Variabilität ist so hoch, dass sie gerichtsmedizinisch zur Spurenzuordnung genutzt wird [Budowle et al. 2003].

Im Gegensatz zu den Polymorphismen der kodierenden Bereiche der mtDNA sind die meisten pathogenen mtDNA-Mutationen heteroplasmisch. Heteroplasmie konnte ich an keiner Stelle nachweisen. Nicht auszuschließen ist allerdings, dass Heteroplasmie an einigen Stellen unter der Nachweisgrenze lag. Laut Bendall et al. (1996) werden heteroplasmische Punktmutationen mit einem Anteil der geringeren Variante von unter 10–20% mit den herkömmlichen Methoden (z.B. der automatischen Sequenzierung mit der Sanger-Kettenabbruchmethode) nicht entdeckt. Durch den in solchen Fällen stark überwiegenden Anteil an Wildtyp-DNA sinkt allerdings auch die Wahrscheinlichkeit, dass diese Mutationen einen Einfluss auf die geregelte Funktion der Mitochondrien haben könnten.

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An zwei Positionen der mtDNA führt ein von mir nachgewiesener Basenaustausch, der nicht in Mitomap verzeichnet ist, zu einem Aminosäureaustausch. Diese Aminosäuren liegen am N-Terminus der Untereinheit I der Cytochrom C Oxidase bzw. am C-Terminus der Untereinheit 5 der NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase. Beim Vergleich der menschlichen Aminosäuresequenzen mit anderen Spezies zeigt sich, dass diese beiden Aminosäuren an nicht konservierten Positionen des Proteins liegen. Laut der von Di Mauro (2000) aufgestellten Kriterien (Kapitel 1.3.3) spricht dies gegen eine funktionelle Bedeutung dieser Polymorphismen, es kann aber auf der anderen Seite auch nicht vollständig ausgeschlossen werden.

Aus meinen Untersuchungen ergibt sich kein Muster an Polymorphismen, das sich bei allen Patienten wiederholt und so im Zusammenhang mit der Erkrankung stehen könnte. Die Basenaustausche, die nicht in den Datenbanken verzeichnet waren, traten als Einzelphänomene in jeweils einem Zwillingspaar auf und waren bei beiden Zwillingen in gleicher Form vorhanden.

5.2 Homoplasmische Mutationen in Tumoren

Die von mir untersuchten Zwillingspaare unterscheiden sich unter anderem in der Zahl ihrer Neurofibrome (siehe Kapitel 2). Aus diesem Grund habe ich die mtDNA zahlreicher Tumore eines Zwillingspaares untersucht und miteinander verglichen. Dabei konnte ich keine Unterschiede zwischen der mtDNA der Tumoren und der Blutzellen finden.

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Somatische homoplasmische Mutationen, über die im Zusammenhang mit verschiedenen anderen malignen Tumorarten berichtet wurde [z.B. Polyak et al. 1998], konnte ich in den untersuchten Neurofibromen nicht nachweisen.

In der Literatur werden verschiedene Mechanismen diskutiert, durch die solche Mutationen entstehen können: Mit ihrem Computermodell zur Entstehung von Homoplasmie berechneten Coller et al. (2001), dass 58% aller Tumore mindestens eine homoplasmische Punktmutation aufweisen sollten. Die experimentellen Daten ergeben jedoch sehr unterschiedliche Zahlen. Das Vorkommen und die Häufigkeit variieren stark zwischen den verschiedenen Tumorarten. So fanden Tamura et al. (1999) 4% homoplasmische Mutationen bei der Analyse des D-loops von Magenkarzinomen. Fliss et al. (2000) analysierten die mtDNA von Blasen-, Lungenkarzinomen und Tumoren im Kopf/Hals-Bereich und fanden Mutationen in 50% der Tumore. Polyak et al. (1998) entdeckten in Kolonkarzinomen in 70% homplasmische Mutationen, Jones et al. (2001) in Pankreaskarzinomen sogar 80 %. Hier scheint ein Zusammenhang zwischen dem Auftreten homoplasmischer Polymorphismen und dem Malignitätsgrad der Tumoren zu bestehen.

Coller et al. (2001) postulieren, das Entstehen solcher Mutationen sei ein Zufallsprodukt. Aufgrund vieler durchlaufener Zellteilungen werden die meisten somatischen Mutationen sowohl in normalen als auch in Tumorzellen homoplasmisch. In Tumorzellen finden mehr Zellteilungen pro Zeiteinheit statt und daher führe es dort zur Häufung homoplasmischer Mutationen.

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Als weitere Möglichkeit für das Entstehen von Homoplasmie innerhalb von Tumoren vermutet man klonales Wachstum. Khrapko et al. (2003) wenden das Modell der klonalen Expansion auf verschiedene Phänomene an: Tumorwachstum, die Ausbreitung pathogener mtDNA-Mutationen in verschiedenen Geweben und auch die Zunahme von neutralen Mutationen im Alter. Auf diese Weise versuchen sie zu erklären, wie ausgehend von einer basalen Mutationsrate die hohe Variabilität von Heteroplasmiegraden durch gleichen Mechanismus zustande kommen kann. Am Beispiel der Tumorentwicklung bedeutet dies, dass eine Zelle zum Beispiel durch Mutation von Onko- oder Tumorsuppressorgenen zur „Gründerzelle“ eines Tumors wird und sich klonal vermehrt. Enthält diese Zelle eine Mutation ihrer mitochondrialen DNA, so wird diese Mutation parallel dazu expandiert, bis sie schließlich überwiegt und im Tumorgewebe homoplasmisch wird. Auch Khrapko et al. (2003) gehen davon aus, dass dies eher zufällig als aufgrund von gezielter Selektion geschieht. In Untersuchungen einzelner Zellen konnten Nekhaeva et al. (2002a) zahlreiche klonal expandierte somatische Punktmutationen nachweisen. Auch Bodyak et al. (2001) wiesen klonale Expansion in single-cell PCR nach. Bei Entstehung und klonaler Expansion eines Tumors aus einer einzigen Zelle, wie zum Beispiel bei Lymphomen, wird eine solche Mutation im gesamten Tumorgewebe nachweisbar sein. In Neurofibromen fällt ein solcher Nachweis schwer, da es sich in der Regel um benigne Mischtumore handelt, die aus verschiedenen Gewebeanteilen bestehen.

Ein hoher Zellumsatz und der in Tumoren erhöhte oxidative Stress durch freie Sauerstoffradikale fördern sekundär das Entstehen neuer Mutationen. Geschieht dies früh in der Tumorentwicklung können sich diese Mutationen ebenfalls auf den gesamten Tumor ausbreiten.

Entgegen dem Zufallsmodell von Coller (2001) vermuteten Polyak et al. (1998), dass die somatischen Mutationen, die sie in Kolontumoren fanden, durch einen selektiven Vorteil gegenüber dem Wildtyp-Genom Homoplasmie erlangten. Sie machten Mutationen im mitochondrialen oder aber im nukleären Genom der betreffenden Zellen dafür verantwortlich. In Zellfusionsexperimenten wurde ebenfalls mehrfach nachgewiesen, dass aus Tumorzellen stammende Mitochondrien einen Wachstumsvorteil für die Zelle bedeuten können [Shay und Ishii 1990, Polyak 1998].

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Zusätzlich scheinen aber die Art des Ursprungsgewebes, die Zahl der in den Tumorzellen enthaltenen mtDNA-Moleküle und die Wachstumsgeschwindigkeit der Tumorzellen mit verantwortlich für das Auftreten homoplasmischer Mutationen der mtDNA zu sein. Alleine durch die Zellteilungsrate kommt es entsprechend des Modells von Coller bei schnell wachsenden Tumoren zu höheren Mutationsraten als bei langsam wachsenden Tumoren, zu denen die von mir untersuchten Neurofibrome zählen. Die Ausbreitung bzw. das Erreichen von Homoplasmie innerhalb eines Gewebes würde dann zusätzlich durch klonales Wachstum begünstigt, das ich bei den untersuchten Neurofibromen aber ebenfalls nicht nachweisen konnte.

Zu der Frage nach einem Unterschied der Mutationsrate zwischen schnell und langsam wachsenden Tumoren gibt es Untersuchungen von Kirches et al. (2001b). Im D-loop von Patienten mit Glioblastoma multiforme, einem malignen, sehr schnell wachsenden Hirntumor fanden sie im Vergleich mit mtDNA aus Blutleukozyten in 7 von 17 (41%) somatische mtDNA-Mutationen. Beim Vergleich von langsam wachsenden Grad II Astrozytomen mit Lymphozyten der Patienten fanden Kirches et al. (2002) hingegen außer einem quantitativen Shift einer Längenvariante des D310-Traktes keine Unterschiede. In einer Untersuchung der HVR2 von 247 Tumoren sowie hyper- und dysplastischen Läsionen im Vergleich mit Lymphozyten der gleichen Patienten fanden Sanchez-Cespedez et al. (2001) in 55 (22%) homoplasmische somatische Veränderungen. Bei den 100 in dieser Untersuchung eingeschlossenen Lungentumoren gab es keine Assoziation zwischen dem Vorkommen dieser Veränderungen und dem Alter und Geschlecht der Patienten sowie genetischen oder histologischen Parametern der Tumoren.

Vega et al. (2004) verglichen den Zusammenhang zwischen Veränderungen in den hypervariablen Regionen der mtDNA und der Malignität von Tumoren. Sie untersuchten Gliome in unterschiedlichen Stadien, sowie Meningeome und Schwannome. Sie fanden Veränderungen sowohl in den malignen als auch in den benignen Tumoren und die Unterschiede waren nicht signifikant. Dennoch sind die meisten Tumore, bei denen bisher Mutationen beschrieben wurden, maligne und schnell wachsend.

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In meiner Untersuchung fand ich in Neurofibromen keine somatischen Mutationen. Auch ergab sich kein Hinweis auf somatische Polymorphismen, welche die Tumorentwicklung hätten beeinflussen können. Somit stehen meine Ergebnisse in Einklang mit den Untersuchungen von Coller et al. (2001), die postulieren, dass somatische Mutationen in Tumoren zufällig entstehen.

Es stellt sich nun die Frage nach der funktionellen Bedeutung solcher homoplasmischen Mutationen für die Entstehung und das Wachstum von Tumoren. Solange eine Mutation keinen Einfluss auf die Replikation oder die Funktion der Mitochondrien besitzt, sich also neutral verhält, scheint es dem Zufall überlassen, ob sie sich durchsetzt oder nicht. Jenuth et al. (1997) wiesen allerdings eine organspezifische Selektion für bzw. gegen neutrale mitochondriale Haplotypen in Mäusen nach. Es gibt Polymorphismen, die fast ausschließlich in einem Gewebe vorkommen, wie zum Beispiel 189A>G im Muskel [Wang et al. 2001]. Howell et al (2000b) wiesen die negative Selektion einer pathogenen Mutation nach. Sie untersuchten heteroplasmische LHON Patienten und konnten in einer Longitudinaluntersuchung zeigen, dass der Anteil mutierter mtDNA in Leukozyten konstant abnahm. Zum Vergleich beobachteten sie einen neutralen, ebenfalls heteroplasmisch vorkommenden Polymorphismus, der über Jahre konstant blieb. In anderen Studien wurden entgegengesetzte Befunde erhoben und die bevorzugte Replikation mutierter mtDNA Moleküle, also eine positive Selektion nachgewiesen [Yoneda et al 1992, Dunbar et al. 1995].

Veränderungen in der Zahl der Mitochondrien, ihrer Struktur, der Komponenten der Atmungskettenenzyme und der Transportsysteme wurden schon vor längerer Zeit in vielen Tumoren entdeckt [Pedersen 1978, Wilkie et al. 1983]. Augenlicht und Heerdt (2001) vermuten, dass sich unter den vielen zufällig entstandenen Mutationen, die sozusagen den „Hintergrund“ bilden, einige befinden, welche die Mitochondrienfunktion und die Zellphysiologie beeinflussen und so die Entwicklung von Tumoren fördern. Bereits 1994 untersuchten sie die Promotorregion des D-loops von Mitochondrien aus Kolonkarzinomen. Die gefundenen Polymorphismen lagen außerhalb der Promotorregion, in der Nähe der Bindungsstelle für den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM). Sie spekulierten, dass dadurch eventuell posttranskriptionelle Regulationsmechanismen der mitochondrialen Genexpression beeinflusst würden.

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Eine andere Hypothese stammt von Bandy und Davison (1990). Sie besagt, dass Mutationen im mitochondrialen Genom Veränderungen in der Funktion der Atmungskette und damit die erhöhte Bildung freier Sauerstoffradikale bewirken können. Diese können dann sekundär die mitochondriale und auch die nukleäre DNA, zum Beispiel Onkogene oder Tumorsuppressorgene schädigen.

Ein eindeutiger Nachweis von Mutationen, die das Tumorwachstum begünstigen, konnte bisher nicht erbracht werden. Man fand keine mit einem bestimmten Tumortyp wiederholt gemeinsam auftretenden Polymorphismen. Die Regionen, in denen in Tumoren besonders häufig somatische Mutationen zu finden sind entsprechen den Regionen, die in menschlichen Populationen den höchsten Grad an Instabilität und die höchsten Mutationsraten zeigen [Vega et al. 2004]. Einheitliche Aussagen lassen sich nur schwer treffen, da viele unterschiedliche Tumorarten untersucht wurden. Die Sequenzvarianten der von mir untersuchten Zwillingspaare liegen außerhalb der Bindungsstellen der Promotoren. Die in codierenden Regionen liegenden Polymorphismen sind bekannte, neutrale Sequenzvarianten. Auch aus diesen Ergebnissen ergibt sich, dass die in meiner Untersuchung nachgewiesenen Sequenzvarianten sehr wahrscheinlich keinen Einfluss auf das Tumorwachstum haben.

5.3 Die HVR2 als Marker für klonales Wachstum

Es gibt experimentelle Ansätze, Regionen wie den in der HVR2 liegenden D310-Trakt als Marker für klonales Wachstum in malignen Tumoren heranzuziehen [Ha et al. 2002].

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Hauswirth und Laipis (1982) postulieren, Heteroplasmie sei lediglich ein Zwischenstadium, in dem neue Mutationen den Prozess der Segregation zur Homoplasmie durchlaufen. Nekhaeva et al. (2002a) demonstrierten diese Tendenz zum Erreichen von Homoplasmie innerhalb einzelner Zellen. Dennoch kommt gerade der D310-Trakt bei vielen Individuen in heteroplasmischer Form vor und die Längenvarianten bleiben während der gesamten Lebenszeit relativ konstant [Lagerstrom-Fermer et al. 2001]. Ha et al. (2002) vermuteten, dass es innerhalb von Tumoren eine besondere Neigung zur Expansion bzw. Deletion in dieser Region gebe. Sanchez-Cespedez et al. (2001) fanden inTumoren eine Tendenz der D310-Trakt-Varianten zur Homoplasmie. Sie empfehlen, solche hochpolymorphen Regionen als „molekulare Uhren“ für das Entstehen von Malignität zu verwenden. Voraussetzung ist hier allerdings, dass diese Regionen bei den betreffenden Patienten in normalem Gewebe heteroplasmisch sind und, dass die im Tumor gefundene Homoplasmie kein gewebsspezifischer Polymorphismus ist. Sie konnten zeigen, dass die Patienten, die Veränderungen der HVR2 innerhalb ihrer Tumore besaßen, in den Lymphozyten heteroplasmisch waren. Eine innerhalb einer Tumorzelle enthaltene Längenvariante der HVR2 erreichte dabei im Tumor Homoplasmie. Dieser Mechanismus wäre dem Modell des Flaschenhalses ähnlich, den man während der Reifung der Oozyte vermutet: eine sehr geringe Zahl an mitochondrialen DNAs wird zur „Gründergeneration“ für die im Tumor enthaltenen mtDNAs.

Der D310-Trakt kommt in der mtDNA aus Blutzellen aller meiner Patienten in mehreren Längenvarianten vor. Haplotypen mit sieben bis neun Cytosinresten vor nt310 sind als Polymorphismen in den Datenbanken verzeichnet und scheinen in keinem Zusammenhang mit irgendeiner Art von Symptomen zu stehen. In keinem der Neurofibrome der Zwillinge A1 und A2 zeigt sich eine Tendenz zur Homoplasmie. Vielmehr fand ich in den Neurofibromen und den Blutleukozyten der Mutter MA, den Zwillingen A1 und A2 annähernd die gleiche Verteilung der Längenvarianten. Sie wurden in einem konstanten Verhältnis von der Mutter auf die Zwillinge vererbt.

Die Entstehung jedes einzelnen Neurofibroms ist ein lokales Ereignis. Ein Vergleich mit monoklonalen Tumoren wie Lymphomen oder Kolonkarzinomen, bei denen man im Tumor und allen Metastasen die gleichen Polymorphismen erwarten kann, ist dadurch nicht möglich. Geht man bei einem einzeln betrachteten Neurofibrom von klonalem Wachstum aus, so würde man erwarten, zumindest in einigen sowohl homoplasmische somatische Mutationen, als auch eine Tendenz der D310-Trakt-Varianten zur Homoplasmie zu finden. Beides konnte ich nicht nachweisen. Allerdings enthalten Neurofibrome, im Gegensatz zu Neurofibrosarkomen noch einen großen Anteil an „normal“ funktionierenden Schwann-Zellen und der Gehalt an Neurofibromin ist nur vermindert. Ich habe daher nicht nur die klonal vermehrten Schwann-Zellen, sondern Mischgewebe untersucht. Dieses Mischgewebe spiegelt das gleiche Heteroplasmiemuster wieder, wie es in den Leukozyten zu finden war.

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Histologisch bestehen die Neurofibrome aus Schwann-Zellen und sind mit kollagenem Bindegewebe und fibroblastenartigen Zellen durchsetzt. Progenitorzellen für die Tumorentstehung sind die Schwann-Zellen [Kluwe et al. 1999]. Nach der Second-hit Theorie [Knudson 1971] ist neben der vererbten Mutation eine weitere Mutation des zweiten Wildtypallels für die Tumorentstehung notwendig, die zum Verlust der Heterozygotie führt. Man kann davon ausgehen, dass diese Zweitmutation in den Progenitorzellen nur einmal vorkommt und sich diese Zelle daraufhin klonal vermehrt. Second-hit Mutationen wurden hauptsächlich in malignen Tumoren von NF1-Patienten nachgewiesen [Legius et al. 1993] und nur zu geringerem Teil in Neurofibromen [Colman et al. 1995]. Daschner et al. (1997) führen dies auf den hohen Anteil an „normalen“ Zellen innerhalb der Neurofibrome zurück. Sie untersuchten neben dem Second-hit zusätzlich Inaktivierungsmuster des X-Chromosoms in Neurofibromen. Nur in einem Teil der untersuchten Tumoren fanden sich Muster die auf Klonalität der Tumorzellen hinwiesen.

In Neurofibrosarkomen lässt sich, da beide Allele mutiert sind, kaum oder kein Neurofibromin nachweisen [Basu et al. 1992, De Clue et al. 1992]. Es gibt Mausmodelle, anhand derer die Hypothese entwickelt wurde, dass bei der Entstehung maligner Nervenscheidentumore zusätzliche Mutationen im p53-Gen eine Rolle spielen [Cichowski et al. 1999]. Interessant wäre es zu untersuchen, ob sich in diesen malignen Tumoren der D310-Trakt in homoplasmischer Form findet. Keiner der von mir untersuchten Patienten hatte einen solchen malignen Tumor. Von dem Optikusgliom der Patientin A1 stand kein Operationsmaterial zur Verfügung, ebenso wenig von den plexiformen Neurofibromen der Patienten A2 und B2.

Meine Untersuchungen zeigen, dass sich - zumindest bei der Untersuchung von Neurofibromen - die HVR2 nicht als Marker für klonales Wachstum eignet, wenn man die mtDNA aus dem Mischgewebe des Tumors untersucht.

5.4 Die phänotypische Divergenz monozygoter Zwillinge mit NF1 – andere Aspekte und Ansätze

5.4.1 Modifizierende Gene

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Die Penetranz der Neurofibromatose liegt bei nahezu 100%, aber ihre Variabilität ist extrem hoch. Easton et al. (1993) veröffentlichten eine Studie, in der sie 175 Individuen, darunter sechs monozygote Zwillingspaare mit NF1 untersuchten. Die Korrelation der Merkmale Neurofibrome und Café-au-lait-Flecken war zwischen monozygoten Zwillingen am höchsten und nahm mit abnehmendem Verwandtheitsgrad ab. Dies galt auch für weitere Merkmale wie Optikusgliome, Skoliose etc. Die Ergebnisse dieser Studie lassen vermuten, dass neben dem mutierten NF1-Gen weitere modifizierende Gene einen Einfluss auf die Ausprägung der Erkrankung haben. Einen Einfluss der mtDNA auf die Erkrankung konnte ich nicht nachweisen.

Krone und Kehrer-Sawatzki (2001) nennen als die NF1 modifizierende Faktoren:

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Bei eineiigen Zwilliingen müssten diese Modifikatoren allerdings die gleichen sein. Größere Variabilität kann man zum Beispiel bei der Modifikation von Genen bzw. Genexpressionsmustern durch epigenetische Einflüsse erwarten.

5.4.2 Second hit – ein lokales Phänomen

Die Zwillingspaare in dieser Studie unterscheiden sich unter anderem in der Zahl ihrer Neurofibrome. Nach der Second-hit Theorie kommt es erst zur Entstehung eines Neurofibroms, wenn das zweite, nicht mutierte Allel des NF1-Gens geschädigt wird. In verschiedenen Neurofibromen eines einzelnen Patienten findet man unterschiedliche Mutationen des zweiten Allels z.B. Serra et al. 2001, Eisenbarth et al. 2000. Dies führte zu der Hypothese, dass jedes Neurofibrom das Ergebnis eines unabhängigen somatischen Mutationsereignisses in einer einzelnen Schwann-Zelle ist. So ließe sich erklären, wie es zu interindividuellen Unterschieden in der Zahl der Neurofibrome kommen kann, eventuell abhängig von interindividuellen Unterschieden in der somatischen Mutationsrate. Diese kann zum Beispiel durch Störungen des „mismatch repair“-Systems beeinflusst werden Wiest et al. 2003, die zu Punktmutationen und kleinen Deletionen im Wildtyp-Allel führen. Ein anderer externer Einflussfaktor ist zum Beispiel UV-Strahlung. Entsprechend des Modells von Coller et al. (2001), können aber auch einfach zufällige Ereignisse zu Mutation und Tumorentstehung führen.

Epigenetische Faktoren können durch Veränderung der Genexpression zur Inaktivierung des Wildtyp-Allels führen. In vitro konnten Mancini et al. (1999) zeigen, dass Methylierung des NF1-Promotors die Bindung von Transkriptionsfaktoren hemmt. In vivo konnten Horan et al. (2000) diese Hypermethylierung der des NF1-Promotorregion in Neurofibromen bisher allerdings nicht nachweisen. Auch die „mismatch repair“-Gene können durch Methylierung inaktiviert werden, wie man in Untersuchungen von Kolonkarzinomzellen zeigen konnte [Jones und Laird 1999].

5.4.3 Neurofibromin und Mitochondrien

Roudebush et al. (1997) beschrieben die Kolokalisation von Neurofibromin und Mitochondrien. Diese Entdeckung sowie die Beschreibung von mitochondrialen Polymorphismen in Tumoren waren Anlass, in dieser Arbeit den Einfluss von Mutationen und Polymorphismen des mitochondrialen Genoms auf die phänotypische Ausprägung und das Tumorwachstum bei der Neurofibromatose zu untersuchen. Die Sequenzierung des gesamten mitochondrialen Genoms meiner Patienten ergab keinen Hinweis auf die Beeinflussung der Krankheitsschwere durch die mitochondriale DNA. Dennoch gibt es eventuell auf anderen Ebenen Interaktionen von Mitochondrien und Neurofibromin:

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  1. Regulation der Apoptose: Neurofibromin spielt durch die Inaktivierung von ras-Protoonkogenen eine Rolle als Kontrollprotein der Zellproliferation und –differenzierung [Gutman und Collins 1993]. Vogel et al. (1995) vermuteten, Neurofibromin könne als Effektor des programmierten Zelltodes in embryonalen Neuronen wirken. Sie untersuchten das gesteigerte Wachstum NF1-defizienter Neurone im Vergleich zu Wildtyp-Neuronen. Diese wuchsen nur im Beisein von neurotrophen Faktoren und gingen ansonsten unter. Roudebush et al. (1997) leiteten daraus ab, das Neurofibromin könne durch Unterdrückung eines Bcl-2 vermittelten Mechanismus Apoptose induzieren. Bcl-2 Proteine befinden sich in den Membranen von Zellkern, Endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien. Sie haben durch Inhibition von Caspasen und Regulation der Membranpermeabilität der Mitochondrien anti-apoptotisches Potential. Experimentell konnte ein Zusammenwirken von Neurofibromin und Mitochondrien bei der Regulation der Apoptose bisher allerdings nicht nachgewiesen werden.
  2. Die GAP-Funktion des Neurofibromins:
    Die GAP-Region des Neurofibromins interagiert unter anderem mit dem p21ras Onkogen und führt zu dessen Inaktivierung [Martin und Viscochil 1990]. Backer und Weinstein (1986) fanden heraus, dass p21ras in seiner aktivierten Form die Phosphorylierung zweier in den Mitochondrien liegender Proteine beeinflusst ohne auf die weitere Bedeutung dieser Proteine einzugehen.

Dies sind einige Aspekte, die Ansatz weiterer Forschungsbemühungen über die Zusammenhänge zwischen Mitochondrien und Neurofibromin und mögliche Einflüsse auf Tumorwachstum bei der NF1 sein könnten. Auf der Ebene des mitochondrialen Genoms konnte ich keinen solchen Zusammenhang finden.


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30.03.2006