6 Zusammenfassung

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Einleitung: Die Entdeckung somatischer homoplasmischer Mutationen der mitochondrialen DNA (mtDNA) in Tumoren gab Anlass zu der Frage, ob Mutationen der mtDNA einen Einfluss auf Entstehen und Wachstum von Tumoren haben könnten. Die Neurofibromatose Typ 1 (von Recklinghausen) ist eine der häufigsten erblichen Tumorerkrankungen. Eineiige Zwillinge mit Neurofibromatose Typ 1 (NF1), die in ihrem Genom identische Chromosomen und somit Erbinformationen aufweisen, können sich dennoch erheblich in ihrem Phänotyp unterscheiden. Da die Mitochondriengenome im Morulastadium nicht unbedingt gleichmäßig auf die Embryonen verteilt werden, könnten heteroplasmische mtDNA-Polymorphismen den Phänotyp der Neurofibromatose Typ 1 unterschiedlich beeinflussen. Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, ob es interindividuelle Unterschiede in der mtDNA-Sequenz monozygoter Zwillinge gibt, die an Neurofibromatose Typ 1 erkrankt sind. Des Weiteren habe ich nach intraindividuellen Unterschieden der mtDNA-Sequenz zwischen Blut und Tumorgewebe gesucht. Die Frage war, ob es somatische mtDNA-Mutationen gibt, die einen Einfluss auf das Entstehen der Tumore haben könnten.

Innerhalb der mtDNA gibt es hypervariable Regionen (HVR), von denen der oft in heteroplamischer Form vorkommende D310-Trakt im D-loop als Marker für klonales Wachstum in Tumoren empfohlen wurde. Ich habe versucht, in Neurofibromen Klonalität dieser Region nachzuweisen.

Methoden: Ich habe die mitochondriale DNA vier monozygoter Zwillingspaare untersucht, die an Neurofibromatose Typ 1 erkrankt sind, sich jedoch im Phänotyp unterscheiden. Die DNA wurde sowohl aus Blutleukozyten als auch aus exstirpierten Neurofibromen extrahiert. Um die Amplifikation nukleärer Pseudogene zu verhindern, habe ich zunächst mit mtDNA-spezifischen Primern eine Long-range PCR durchgeführt. Nur das Cytochrom b-Gen wurde direkt von der Patienten DNA amplifiziert. Die Long-range PCR-Produkte habe ich in 17 überlappende PCR-Fragmente unterteilt, welche sequenziert und mit der Genbank-Standardsequenz NC_001807 verglichen wurden. Heteroplasmische Varianten des D310-Traktes ermittelte ich mittels Genotypisierung. Mit Hilfe der GenScan Analysis Software konnte ich den jeweiligen relativen Anteil der verschiedenen Längenvarianten der einzelnen Patienten berechnen.

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Ergebnisse: Beim Vergleich der mtDNA-Sequenzen der vier Zwillingspaare mit der Standardsequenz (Genbanksequenz NC_001807) habe ich insgesamt 88 Abweichungen gefunden. Die meisten waren in der Datenbank Mitomap verzeichnet. 80 davon sind homoplasmische Polymorphismen, die anderen sind Insertionen oder Deletionen an hypervariablen Regionen der mtDNA. Bei den Zwillingspaaren fand ich im Schnitt 35,8 Polymorphismen (33-38). Es fanden sich keine interindividuellen Unterschiede innerhalb der einzelnen Paare. Beim Vergleich der mtDNA-Sequenzen aus Blut- mit denen aus Tumorzellen eines Zwillingspaares fand ich keinen intraindividuellen Unterschied.

Der D310-Trakt innerhalb der HVR2 kam bei allen Zwillingspaaren in heteroplasmischer Form mit jeweils drei Längenvarianten vor. Alle Längenvarianten sind bereits in der Datenbank Mitomap verzeichnet. Bei den Zwillingen A1 und A2 sowie deren Mutter MA konnte ich annähernd die gleiche Verteilung der Längenvarianten in Blutzellen sowie in Neurofibromen von A1 und A2 zeigen.

Schlussfolgerungen: Ich konnte keinen Hinweis dafür finden, dass Veränderungen in der mtDNA die phänotypische Ausprägung einer monogenetischen Erkrankung, hier der Neurofibromatose Typ 1, beeinflussen. Innerhalb der einzelnen Zwillingspaare konnte ich keinen Unterschied in der mtDNA-Sequenz nachweisen. Die gefundenen Polymorphismen verhalten sich wahrscheinlich neutral und sind Ausdruck der genetischen Variabilität der mtDNA. Für die Ausprägung des Krankheitsbildes scheinen vielmehr andere Einflussfaktoren wie modifizierende Gene, epigenetische Faktoren, Umwelteinflüsse oder auch Zufallsereignisse von Bedeutung zu sein.

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Ursprungsgewebe und Wachstumsgeschwindigkeit sind für das Entstehen somatischer mitochondrialer Polymorphismen in Tumoren von Bedeutung. Somatische Mutationen der mtDNA sind am ehesten ein Zufallsprodukt. Sie kommen aufgrund der erhöhten Zellteilungsrate in Tumorgewebe vermehrt vor. Neurofibrome sind benigne, langsam wachsende Mischtumoren. Klonalität von Tumorzellen lässt sich bei Untersuchung dieses Mischgewebes nicht nachweisen.


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30.03.2006