Sequenzierung des mitochondrialen Genoms

Ich habe die mtDNA vier monozygote, an Neurofibromatose Typ 1 erkrankter Zwillingspaare, sowie einer gesunden Kontrollperson jeweils einmal vollständig sequenziert.

Für die Sequenzierungs-PCR habe ich 18 PCR-Fragmente verwendet, welche die gesamte mtDNA in überlappenden Fragmenten abdecken. Sequenziert wurde mit verschachtelten Primern, von denen 37 auf dem H-, 30 auf dem L-Strang lagen. In einigen Fällen, in denen Hintergrund die Unterscheidung zwischen einem Sequenzierungsfehler oder einer echten Heteroplasmie erschwerte, habe ich die PCR-Reaktion wiederholt und bidirektional sequenziert.

Abweichungen von der Standardsequenz

Alle Patienten und die Kontrollperson zusammengenommen habe ich insgesamt 88 Abweichungen von der Standard-Genbanksequenz NC_001807 gefunden. 80 davon sind homoplasmische Polymorphismen, das heißt Sequenzvarianten, die sich von der Standardsequenz durch den Austausch eines Basenpaares unterscheiden. Sie lassen sich weiter untergliedern in 77 Transitionen (Austausch einer Purin- gegen eine andere Purinbase, bzw. einer Pyrimidin- gegen eine Pyrimidinbase) und drei Transversionen (Austausch einer Purin- gegen eine Pyrimidinbase).

Innerhalb der Mikrosatellitensequenzen des D-loops fand ich verschiedene Längenvarianten. Innerhalb eines CA-repeats bei nt 514 fand ich eine Insertion und eine Deletion. Ein typischer Hinweis auf das Vorliegen einer Längenheteroplasmie des D-310-Traktes ist, dass die Sequenzierung hinter dieser Region durch Überlagerung der verschiedenlangen Sequenzen nur schwer auszuwerten ist. Dies war in meinen Untersuchungen vor allem bei Zwillingspaar A der Fall. In der Sequenzierung fand ich bei allen Patienten die jeweils zum höchsten Prozentsatz vorkommende Längenvariante. Die anderen Varianten bestimmte ich mittels Genotypisierung. Abweichend von der Standardsequenz fand ich Insertionen von einem bis zu drei Cytosinresten, bzw. die Deletion eines Cytosinrestes.

Verteilung der Sequenzvarianten innerhalb des mitochondrialen Genoms

Bei allen Patienten und der Kontrolle fand ich insgesamt 160 Sequenzvarianten.

Ungefähr ein Drittel (36%) dieser Varianten liegt im D-loop (57/160). 48% liegen innerhalb der 13 proteinkodierenden Gene (83/160), 13% in Abschnitten für die rRNA (21/160) und 3% in den Abschnitten für die t-RNAs (4/160) (Abbildung 1). Unter den proteincodierenden Genen liegen die meisten Varianten innerhalb MTCYB-Gens (18/83). Keine Polymorphismen fand ich in den Genen für die ATPase8 und in 19 Genen der restlichen t-RNAs.

Abbildung 12: Verteilung der gefundenen Abweichungen von der Standardsequenz auf die verschiedenen Abschnitte der mtDNA.

Vergleich der Sequenzvarianten mit der Datenbank Mitomap

Alle Sequenzvarianten mit Ausnahme der Veränderungen des D310-Traktes sind homoplasmisch. Dies bedeutet, dass an der betreffenden Stelle ein einziger Genotyp vorliegt.

Ich habe alle Varianten mit der Datenbank Mitomap (http//www.mitomap.org) verglichen. In dieser Datenbank sind die meisten der bisher gefundenen Polymorphismen sowie pathogenen Mutationen der mtDNA aufgeführt.

72 der gefundenen Basensubstitutionen sind in Mitomap verzeichnete Polymorphismen. Zwei davon werden im Zusammenhang mit verschiedenen Mitochondropathien aufgeführt: 12308A>G mit Chronisch progressiver externer Ophthalmoplegie (CPEO); 13708G>A mit Leber’scher hereditärer Optikusneuropathie (LHON). An 15 Stellen findet ein Aminosäureaustausch statt. Auch alle Deletionen bzw. Insertionen innerhalb des D-loop sind in Mitomap verzeichnet.

Acht der Varianten waren zum Zeitpunkt der Auswertung noch nicht in Mitomap verzeichnet, bei zwei davon kommt es zum Aminosäureaustausch: an Position nt5913 im MTCOI-Gen, und an Position nt14002 im MTND5-Gen.Diese Varianten kommen jeweils nur bei einem Zwillingspaar vor.

Ergebnisse der einzelnen Patienten und der Kontrolle

Bei den Patienten habe ich im Durchschnitt 35,8 (33–38) Abweichungen von der Standardsequenz gefunden, bei der Kontrollperson 17.

Sechs Varianten kommen sowohl bei allen Zwillingen, als auch bei der Kontrolle vor. Sie entsprechen alle den Sequenzabschnitten, die mittlerweile als seltene Polymorphismen bzw. Fehler in der „Oxford-Sequenz“ identifiziert wurden (263A>G, 315-316insC, 1438A>G, 3107delC, 8860A>G, 14326A>G). Sechs Varianten kommen bei allen Zwillingen, nicht aber bei der Kontrolle vor (309-310insC, 2706A>G, 4769A>G, 7028C>T, 11719G>A, 14766C>T). Sie sind bereits alle in Mitomap beschrieben.

Im Folgenden beschreibe ich die Sequenzvarianten bei den einzelnen Zwillingspaaren.

Zwillingspaar A

Bei den Zwillingen A₁ und A₂ habe ich jeweils 34 Polymorphismen gefunden. In der Anzahl und Lage der Polymorphismen findet sich kein Unterschied zwischen den Zwillingen. Auch im Vergleich von mtDNA aus Blutleukozyten und Tumorgewebe habe ich weder bei Zwilling A₁ noch bei Zwilling A₂ einen Unterschied gefunden.

Die meisten Polymorphismen finden sich mit 44,1% (15/34) im D-loop, 35,3% (12/34) in proteinkodierenden Genen. 29 der Polymorphismen sind homoplasmische Basensubstitutionen. An acht Stellen findet ein Aminosäureaustausch statt. Zwei Polymorphismen waren zum Zeitpunkt der Auswertung nicht in Mitomap aufgeführt.

Lokus

Haplotyp

AS

Austausch

Eintrag in Mitomap

D-loop

73A>G

-

ja

185G>A

-

ja

188A>G

-

ja

228G>A

-

ja

263A>G

-

ja

295C>T

-

ja

309-310insC

-

ja

309-310insCC

-

ja

309-310insCCC

-

ja

315-316insC

-

ja

462C>T

-

ja

489T>C

-

ja

12rRNA

789T>C

-

nein

1438A>G

-

ja

16rRNA

2706A>G

-

ja

3010G>A

-

ja

3107delC

-

ja

MTND1

4216T>C

Y–H

ja

MTND2

4769A>G

M=M

ja

MTCo I

7028C>T

A=A

ja

ATPase6

8860A>G

T–A

ja

MTND3

10398A>G

T–A

ja

MTND4

11251A>G

L=L

ja

11719G>A

G=G

ja

MTND5

12612A>G

V=V

ja

13708G>A

A–T

ja

MTCYB

14766C>T

I–T

ja

14798T>C

F–L

ja

15326A>G

T–A

ja

15452C>A

L–I

ja

Thr

15947A>G

-

nein

D-loop

16069C>T

-

ja

16126T>C

-

ja

16519T>C

-

ja

Tabelle 10: Zwillinge A₁ und A₂. Analyse der mtDNA sowohl aus Blut- als auch aus Tumorzellen. Darstellung der nachgewiesenen Sequenzvarianten, deren Lage, eventueller Aminosäureaustausch und Bezug auf Eintragungen in der Mitomap-Datenbank. Für die Bezeichnung der Aminosäuren wurde der Einbuchstabencode verwendet (siehe Abkürzungsverzeichnis).

Zwillingspaar B

Bei den Zwillingen B₁ und B₂ habe ich jeweils 33 Polymorphismen gefunden, ohne einen Unterschied zwischen ihren mtDNAs festzustellen.

Einige Sequenzen von B ₁ schienen aufgrund des relativ hohen Hintergrundsignals sowohl bei der Sequenzierung des H- als auch des L-Stranges heteroplasmische Sequenzvarianten aufzuweisen. Ich habe die PCR-Reaktionen an den fraglichen Stellen wiederholt und dabei, trotz des Risikos der Amplifizierung nukleärer Pseudogene, statt des Long-range PCR-Produktes die aus Blut gewonnene mtDNA direkt als Matrize eingesetzt. Die PCR-Produkte habe ich dann noch einmal bidirektional sequenziert. Die Heteroplasmien ließen sich nicht bestätigen.

Bei zehn der gefundenen Basensubstitutionen kommt es zum Aminosäureaustausch. Einer davon war zum Zeitpunkt der Auswertung nicht in Mitomap verzeichnet.

Lokus

Haplotyp

AS

Austausch

Eintrag in Mitomap

D-loop

73A>G

-

ja

185G>A

-

ja

228G>A

-

ja

263A>G

-

ja

295C>T

-

ja

309-310delC

-

ja

309-310insC

-

ja

315-316insC

-

ja

C462C>T

-

ja

T489T>C

-

ja

12rRNA

1438A>G

-

ja

16rRNA

2706A>G

-

ja

3010G>A

-

ja

3107delC

-

ja

MTND1

4216T>C

Y–H

ja

MTND2

4769A>G

M=M

ja

MTCo I

7028C>T

A=A

ja

ATPase6

8860A>G

T–A

ja

MTND3

10398A>G

T–A

ja

MTND4

11251A>G

L=L

ja

11719G>A

G=G

ja

MTND5

12612A>G

V=V

ja

13708G>A

A–T

ja

13934C>T

T–M

ja

14002A>G

T–A

nein

MTCYB

14766C>T

I–T

ja

14798T>C

F–L

ja

15326A>G

T–A

ja

15394T>C

N=N

ja

15452C>A

L–I

ja

D-loop

16069C>T

-

ja

16126T>C

-

ja

16291C>T

-

ja

Tabelle 11: Zwillinge B1 und B2. Analyse der mtDNA aus Blutzellen. Darstellung der nachgewiesenen Sequenzvarianten, deren Lage, eventueller Aminosäureaustausch und Bezug auf Eintragungen in der Mitomap-Datenbank. Für die Bezeichnung der Aminosäuren wurde der Einbuchstabencode verwendet (siehe Abkürzungsverzeichnis).

Abbildung 13: 14002A>G. Diese Transition im MTND5-Gen führt bei B₁ und B₂ zum Austausch der Aminosäure Tyrosin (T) gegen Alanin (A).

Zwillingspaar C

Bei den Zwillingen C₁ und C₂ habe ich jeweils 38 Sequenzvarianten gefunden. Auch hier ergab sich kein interindividueller Unterschied. An sieben Positionen kommt es zum AS-Austausch. Ein Polymorphismus war zum Zeitpunkt der Auswertung nicht in Mitomap verzeichnet.

Lokus

Haplotyp

AS

Austausch

Eintrag in Mitomap

D-loop

73A>G

-

ja

152T>C

-

ja

195T>C

-

ja

263A>G

-

ja

309-310delC

-

ja

309-310insC

-

ja

315-316insC

-

ja

12rRNA

709G>A

-

ja

1438A>G

-

ja

16rRNA

1888G>A

-

ja

2706A>G

-

ja

3107delC

-

ja

MTND1

4216T>C

Y–H

ja

MTND2

4769A>G

M=M

ja

4917A>G

D–N

ja

MTCo I

7028C>T

A=A

ja

ATPase6

8697G>A

M=M

ja

8860A>G

T–A

ja

MTCo III

9899T>C

H=H

ja

MTND3

10143G>A

G–S

ja

Arginin

10463T>C

-

ja

MTND4

11251A>G

L=L

ja

11719G>A

G=G

ja

MTND5

12633C>A

S=S

ja

13368G>A

G=G

ja

MTND6

14281C>T

G=G

nein

MTCYB

14766C>T

I–T

ja

14905G>A

M=M

ja

15326A>G

T–A

ja

15452C>A

L–I

ja

15607A>G

K=K

ja

Thr

15928G>A

-

ja

D-loop

16126T>C

-

ja

16163A>G

-

ja

16186C>T

-

ja

16189T>C

-

ja

16294C>T

-

ja

16519T>C

-

ja

Tabelle 12: Zwillinge C₁ und C₂. Analyse der mtDNA aus Blutzellen. Darstellung der nachgewiesenen Sequenzvarianten, deren Lage, eventueller Aminosäureaustausch und Bezug auf Eintragungen in der Mitomap-Datenbank. Für die Bezeichnung der Aminosäuren wurde der Einbuchstabencode verwendet (siehe Abkürzungsverzeichnis).

Zwillingspaar D

Bei den Zwillingen D₁ und D₂ habe ich 38 Polymorphismen gefunden, die jeweils bei beiden Patienten vorkommen. An sieben Stellen kommt es zum AS-Austausch. Vier Polymorphismen waren nicht in Mitomap aufgeführt.

Lokus

Haplotyp

AS

Austausch

Eintrag in Mitomap

D-loop

73A>G

-

ja

146T>C

-

ja

195T>C

-

ja

263A>G

-

ja

309-310insC

-

ja

309-310insCC

-

ja

315-316insC

-

ja

523-524insCA

-

ja

12rRNA

1189T>C

-

ja

1438A>G

-

ja

16rRNA

1811A>G

-

ja

2706A>G

-

ja

3107delC

-

ja

MTND1

3480A>G

L=L

ja

MTND2

4769A>G

M=M

ja

MTCo I

5913G>A

D–N

nein

7028C>T

A=A

ja

7211A>A

M=M

nein

ATPase6

8860A>G

T–A

ja

9055G>A

A–T

ja

MTCo III

9698T>C

L=L

ja

MTND3

10398A>G

T–A

ja

MTND4L

10550A>G

M=M

ja

10646G>A

V=V

ja

MTND4

11299T>C

T=T

ja

11467A>G

L=L

ja

11719G>A

G=G

ja

Leu

12308A>G

-

ja

MTND5

12372G>A

L=L

ja

12738T>G

A=A

nein

13194G>A

L=L

nein

MTND6

14167C>T

Q=Q

ja

MTCYB

14766C>T

I–T

ja

14798T>C

F–L

ja

15326A>G

T–A

ja

D-loop

16224T>C

-

ja

16311T>C

-

ja

16519T>C

-

ja

Tabelle 13: Zwillinge D₁ und D₂. Analyse der mtDNA aus Blutzellen. Darstellung der nachgewiesenen Sequenzvarianten, deren Lage, eventueller Aminosäureaustausch und Bezug auf Eintragungen in der Mitomap-Datenbank. Für die Bezeichnung der Aminosäuren wurde der Einbuchstabencode verwendet (siehe Abkürzungsverzeichnis).

Abbildung 14: 5913G>A. Diese Transition im MTCOI-Gen führt bei D₁ und D₂ zum Austausch von Asparaginsäure (D) gegen Asparagin (N).

Kontrolle

Bei der Kontrollperson fand ich 17 Sequenzvarianten, alle waren in Mitomap verzeichnet. Bei sieben kommt es zum AS-Austausch.

Lokus

Haplotyp

AS

Austausch

Eintrag in Mitomap

D-loop

263A>G

-

ja

315-316insC

-

ja

522-523delCA

-

ja

12rRNA

1438A>G

-

ja

16rRNA

3107delC

-

ja

MTND1

3992C>T

T – M

ja

4024A>G

T – A

ja

MTND2

4769A>G

M = M

ja

5004T>C

L = L

ja

MTCo II

8269G>A

Ter = Ter

ja

ATPase6

8860A>G

T – A

ja

9123G>A

L = L

ja

MTND6

14365C>T

V = V

ja

14582A>G

V – A

ja

MTCYB

15326A>G

T – A

ja

D-loop

16104C>T

-

ja

16260C>T

-

ja

Tabelle 14: Kontrolle. Analyse der mtDNA aus Blutzellen. Darstellung der nachgewiesenen Sequenzvarianten, deren Lage, eventueller Aminosäureaustausch und Bezug auf Eintragungen in der Mitomap-Datenbank. Für die Bezeichnung der Aminosäuren wurde der Einbuchstabencode verwendet (siehe Abkürzungsverzeichnis).

Überprüfung der Sequenzen mit Aminosäureaustausch auf ihre evolutionäre Konservierung

Die beiden Sequenzvarianten mit Aminosäureaustausch, die nicht in der Mitomap verzeichnet waren, habe ich bezüglich ihrer evolutionären Konservierung untersucht und sie dazu mit den Aminosäuresequenzen von Maus, Huhn, Drosophila und Saccharomyces verglichen. Die Veränderung im MTCOI-Gen des Zwillingspaars D liegt im 5’-Bereich des Gens und betrifft die vierte von 514 Aminosäuren.

Abbildung 15: 5913G>A. Der Polymorphismus führt zum Austausch einer Asparaginsäure (D) gegen Asparagin (N) an Position 4 des Proteins. Dieser Bereich erweist sich im Laufe der Evolution als variabel. Bei Maus und Huhn finden sich an Position vier jeweils ein Asparagin, während dieser Proteinabschnitt bei Drosophila und Bäckerhefe nicht vorhanden ist.

Der Austausch im MTND5-Gen von Zwillingspaar B liegt im 3’-Bereich des Gens und betrifft die 557. von 604 Aminosäuren. Threonin wird gegen Alanin ausgetauscht. Bei den zum Vergleich herangezogenen Spezies (Mus musculus, Gallus gallus, Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae) ist dieser Bereich des Proteins nicht vorhanden.

Hypervariable Regionen - Mikrosatellitensequenzen HVR1

Der PolyC-Trakt zwischen nt16184-16193 war bei den einzelnen Sequenzierungsreaktionen aller Patienten unauffällig und es fanden sich keine Hinweise auf das Vorliegen einer Heteroplasmie an dieser Stelle.

Bei Zwillingspaar C fand ich einen Polymorphismus (16189T>C), der laut Literaturangaben oft mit Heteroplasmie des PolyC-Traktes assoziiert sein soll [Malik et al. 2002]. Auch hier war die Sequenzierung unauffällig.

HVR2

Die Genotypisierung der HVR2 ergab bei allen Patienten eine Heteroplasmie des D310-Traktes. Der PolyC-Trakt zwischen nt303-316 hat in der zum Vergleich herangezogenen Standardsequenz eine Länge von 14 bp. Laut der Beschreibungen dieser Region in der Literatur finden sich die Insertionen bzw. Deletionen in der ersten Hälfte des PolyC-Traktes 5’ des T bei nt310. Die zweite Hälfte zwischen nt311-316 scheint mit einer Länge von sechs Cytosinresten konstant zu sein [Parella et al. 2003]. Mit der Genotypisierung konnte ich allerdings nur Veränderungen in der Gesamtlänge des Restriktionsproduktes (65 bp) feststellen. In der vorangegangenen Sequenzierung dieses Abschnitts konnte ich ausschließen, dass an anderen Stellen des für die Genotypisierung eingesetzten Produktes Insertionen oder Deletionen nachweisbar waren. Als Varianten gebe ich im Folgenden also die Veränderungen der gesamten PolyC-Sequenz zwischen nt311-316 an.

Bei der Auswertung des Längenstandards fand ich neben der eigentlichen Längenvariante zusätzliche niedrige Peaks (<13% der Gesamtfläche). Da der Standard, garantiert durch die Klonierung, nur aus einer Längenvariante bestehen kann, habe ich solche niedrigen Peaks als PCR-Artefakte gewertet und nicht mit in die Auswertung einbezogen.

Zwillingspaar A und dessen Mutter M_A

Die Mutter M_A sowie ihre beiden Töchter A₁ und A₂ besitzen jeweils drei verschiedene Längenvarianten des D310-Traktes.

Die Verteilung der einzelnen Haplotypen unterscheidet sich bei Mutter und Töchtern kaum (siehe Abbildung 16). Am häufigsten ist eine Traktlänge von 16 bp mit einem Anteil von 64% im Mittelwert, dann folgen 15 bp mit 23% und schließlich 17 bpmit 13%.

Auch der Vergleich zwischen der Verteilung der Haplotypen im Blut mit der in Tumorgewebe von A₁ und A₂ zeigt keinen wesentlichen Unterschied (siehe Abbildung18).

Probe

14bp

15bp

16bp

17bp

Standard

100%

M _A

Blut

26%

61%

13%

A1

Blut

21%

67%

12%

Tumor I

22%

65%

13%

Tumor II

24%

64%

12%

Tumor III

23%

65%

12%

Tumor IV

24%

64%

12%

Tumor V

26%

62%

12%

Tumor VI

26%

61%

13%

Tumor VII

25%

61%

14%

Tumor VIII

22%

63%

15%

Tumor IX

22%

64%

14%

Tumor X

23%

62%

15%

Tumor XI

26%

63%

11%

Tumor XII

21%

63%

16%

Tumor XIII

24%

62%

14%

Tumor XIV

26%

62%

12%

Tumor XV

30%

58%

12%

Tumor XVI

25%

62%

13%

A2

Blut

22%

65%

13%

Tumor

28%

61%

11%

Tabelle 15: Genescan-Analyse des D310-Traktes. Berechnung des relativen Anteils der einzelnen Haplotypen von M_A, A₁ und A₂ aus der Fläche der einzelnen Peaks.

Abbildung 16: Genescan-Analyse der Zwillinge A₁ und A₂ (Blut und Tumor) sowie ihrer Mutter M_A (Blut). Beim Vergleich mit dem Längenstandard zeigt sich, dass die Varianten jeweils ein, zwei bzw. drei Basenpaare länger sind. Ebenso kann man die fast konstante Aufteilung der Varianten erkennen.

Vergleich der Genotypen in verschiedenen Tumoren von A₁

Die Analyse des D310-Traktes von 16 verschiedenen Neurofibromen des Zwillings A₁ ergibt ebenfalls keine auffallenden Unterschiede in der Verteilung der einzelnen Genotypen. Die Mittelwerte für die einzelnen Genotypen liegen bei 24% für 15 bp Traktlänge (Werte schwanken zwischen 21% und 30%), 63% für 16 bp (Werte schwanken zwischen 61% und 65%) und 13% für 17 bp (Werte schwanken zwischen 11% und 15%).

Abbildung 17: Genotypisierung des D310-Traktes. Vergleich von 16 Tumorproben von Zwilling A₁. Relative Anteile und Trendlinien der drei vorkommenden Genotypen. λ 15bp Traktlänge, ν 16bp Traktlänge, σ 17bp Traktlänge.

Abbildung 18: Genescan-Analyse. Vergleich des D310-Traktes von 16 verschiedenen Tumoren des Zwillings A₁. Alle Tumoren besitzen die Varianten mit 15, 16 und 17 bp Traktlänge in fast konstanter Aufteilung.

Zwillingspaar B

Bei dem Zwillingspaar B₁ und B₂ fand sich ebenfalls eine Heteroplasmie mit drei verschiedenen Haplotypen, die bei beiden eine ähnliche Verteilung zeigen. Am häufigsten ist die Längenvariante von 14 bp mit 84% bzw. 85%.

13bp

14bp

15bp

Standard

100%

B1

Blut

7%

84%

9%

B2

Blut

7%

85%

8%

Tabelle 16: Genescan-Analyse des D310-Traktes bei Zwillingspaar B. Anteil der einzelnen Längenvarianten im Vergleich.

Zwillingspaar C

Auch bei C₁ und C₂ ergab die Genescan-Analyse drei Varianten des D310-Traktes. Die Berechnung der Fläche unterhalb des dritten Peaks von Zwilling C₂ mittels der GeneScan Software gelang nicht. Eine Wiederholung der PCR-Reaktion war leider nicht möglich, da von der Patientin nicht mehr genügend mtDNA vorhanden war. Der visuelle Vergleich der Genescans der beiden Patienten zeigt jedoch eine annähernd gleiche Verteilung der Längenvarianten (Abbildung 19).

13bp

14bp

15bp

Standard

100%

C1

Blut

7%

85%

8%

Tabelle 17: Genescan-Analyse des D310-Traktes bei Zwilling C₁. Die Berechnung der Flächen bei Zwilling C₂ war nicht möglich.

Zwillingspaar D

D₁ und D₂ besitzen neben zwei weiteren Haplotypen als häufigste Variante den Haplotyp mit 15 bp Traktlänge. Auch hier zeigt sich eine annähernd gleiche Verteilung der Haplotypen.

14bp

15bp

16bp

Standard

100%

D1

Blut

11%

81%

8%

D2

Blut

12%

80%

8%

Tabelle 18: Genescan-Analyse des D310-Traktes bei Zwillingspaar D. Anteil der einzelnen Längenvarianten im Vergleich.

Abbildung 19: Genscan. Vergleich des D310-Traktes der Zwillinge B, C und D mit dem Längenstandard. Bei allen finden sich jeweils drei Längenvarianten. Die anteilig am stärksten vertretene Variante entspricht bei B1 und B2 sowie C1 und C2 der Länge des Standards. Bei D1 und D2 ist sie ein Basenpaar länger.