Diepold, Katharina: Hämatologische Referenzwerte von Frühgeborenen unter 1500 g Geburtsgewicht

Kapitel 4. Methodik

4.1 Behandlungsmethoden

Blutentnahmen wurden am Tag 3 (nach der postnatalen Adaptation und vor Beginn der rhEPO Therapie) und nach 2, 4 und 6 Wochen im Rahmen der üblichen Routineuntersuchungen vorgenommen. Das Blut wurde venös oder arteriell und nicht kapillär entnommen. Dabei wurde die entnommene Blutmenge aufgezeichnet. Das über den beobachteten Zeitraum von sechs Wochen entnommene Gesamtblutvolumen (iatrogener Blutverlust) wurde auf das Geburtsgewicht normiert (Blutvolumen in ml / Geburtsgewicht in kg). Um einen Vergleich des transfundierten Gesamtvolumens zwischen den einzelnen Fällen zu ermöglichen, wurde das transfundierte Gesamtvolumen auf das Geburtsgewicht normiert (transfundiertes Gesamtvolumen in ml / Geburtsgewicht in kg).

Bei der Mehrzahl der Kinder wurde die Mutter antenatal zur Lungenreifung des Feten mit Betamethason behandelt, allerdings wurde dies im Rahmen der Studien nicht im Detail festgehalten. Das Abklemmen der Nabelschnur erfolgte nach 10 (0;20) Sekunden (Median; Quartilen). Der Großteil der Kinder erhielt eine enterale Eisensupplementation von 2 - 9 mg/kg pro Tag in Abhängigkeit von der Ferritinkonzentration oder der Transferrinsättigung.

4.2 Labormethoden

Der Hämatokrit wurde durch Zentrifugation oder in der EPO3 Studie im Coulter Counter gemessen. Die Erythrozyten-, Hämoglobin-, Thrombozyten- und Leukozytenwerte wurden im Coulter Counter gemessen. Für das Differentialblutbild wurde ein Ausstrich mit der May-Grünwald Giemsa Methode gefärbt und ausgezählt; der Leukozytenwert wurde nach Bestimmung von kernhaltigen Erythrozyten korrigiert. Die Neutrophilenwerte wurden aus dem Leukozytenwert und der im Blutausstrich bestimmten Neutrophilenprozentzahl berechnet und setzen sich aus reifen und unreifen Neutrophilenformen zusammen. Die Retikulozytenwerte wurden auf einen Hämatokrit von 45


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normalisiert, indem der im Blutausstrich bestimmte Wert mit dem tatsächlichen Hämatokrit multipliziert und durch 45 geteilt wurde.

4.3 Auswahl der Kinder

Für die Berechnung der Referenzwerte am Tag 3 wurden die Daten aller Kinder hinzugezogen. Für die Berechnung der Referenzwerte im Alter von 2, 4 und 6 Wochen von Erythrozyten, Hämoglobin, Hämatokrit, Retikulozyten und Ferritin wurden Daten derjenigen Kinder hinzugezogen, die kein rhEPO erhalten hatten. Um für die Erstellung der Referenzwerte von Thrombozyten, Leukozyten und Neutrophilen im Verlauf der ersten sechs Lebenswochen Kinder auszuschließen, die wahrscheinlich eine Infektion haben, wurden nur Werte von Kindern verwandt, die zu dem jeweiligen Zeitpunkt keine Antibiotika bekommen hatten. Wenn ein Kind Antibiotika bekommt, ist dies zwar nicht gleichbedeutend mit einer vorliegenden Infektion, ein Kind ohne Antibiotika hat aber mit großer Wahrscheinlichkeit keine Infektion. Ebenso wurden die Kinder ausgeschlossen, die zum jeweiligen Zeitpunkt Glukokortikoide bekommen hatten. Dagegen wurden Daten von Kindern mit rhEPO Therapie einbezogen.

Für die Untersuchung der Einflussgröße "Transfusionen (s. 5.3.1) wurde die Population in zwei Untergruppen geteilt. In einer Gruppe ("nicht transfundiert") befinden sich Kinder, die bis zum 3. Tag noch keine Transfusion erhalten hatten, in der anderen ("transfundiert") befinden sich jene, die bis zum 3. Tag schon mindestens eine Transfusion erhalten hatten.

Für die Untersuchung der Einflussgröße "iatrogener Blutverlust" (s. 5.3.2) wurden die Kinder aus den Jahren 91/92 in zwei gleich große Gruppen geteilt, eine Gruppe mit niedrigem entnommenen Gesamtblutvolumen (weniger als 27 ml/kg Geburtsgewicht in sechs Wochen), sowie eine Gruppe mit hohem entnommenen Gesamtblutvolumen (mehr als 27 ml/kg Geburtsgewicht). Diese Grenze wurde gewählt, da der Median der Blutverluste für diese Kinder bei 27 ml/kg liegt. Kinder aus EPO1 konnten für diese Untersuchung nicht herangezogen werden, da sie nur über einen Zeitraum von 4 Wochen untersucht wurden und dadurch einen geringeren Blutverlust haben. Von dem über 4 Wochen entnommenen Blutvolumen kann nicht auf 6 Wochen hochgerechnet werden, da in den ersten Wochen mehr Blut abgenommen wird als in den Wochen danach. Werte von Kindern aus EPO 3 wurden nicht verwendet, da alle Kinder dieser Studie rhEPO bekommen hatten.

Für die Untersuchung der Einflussgröße "veränderte Transfusionsindikation" (s. 5.4) wurde die Population der Kontrollkinder in drei Gruppen geteilt. Die erste Gruppe stammt aus den Jahren


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1989 bis 1990, die zweite aus dem Jahr 1991 und die dritte aus dem Jahr 1992. Aus dem Jahr 1995 konnten keine Kinder in die Untersuchung einbezogen werden, da es in dieser Studie keine Kontrollkinder gab.

4.4 Grenzwerte

Neutrophilenwerte unter 1,1 x 109/l wurden nach Mouzinho (1994) als Neutropenie bezeichnet. In Anlehnung an Zachman (1988) galten Leukozytenwerte über 40 x 109/l als leukämoide Reaktion. Des weiteren wurde eine Thrombozytopenie als Thrombozytenwerte unter 150 x 109/l definiert (George 1995). Eisenmangel war definiert als Ferritinkonzentration unter 20 ng/ml (Lozoff 1991, Arad 1988, Hall 1993).

4.5 Statistische Auswertung

Die Originaldaten der EPO1 Studie wurden in einer SPSS Datei gesammelt. Originaldaten von EPO2 wurden in 16 verschiedenen dBASE Dateien erfasst. Daten der EPO3 Studie wurden in 3 ASCII Dateien zusammengestellt. Die selbst erhobenen KAVH Daten wurden direkt in eine SPSS Datei eingegeben. Um eine Auswertung aller Daten vornehmen zu können, musste aus den verschiedenen Dateien und Dateiformaten eine einheitliche SPSS Gesamtdatei erstellt werden, die Grundlage der vorliegenden Arbeit war.

Alle statistischen Analysen wurden mit dem Statistikprogramm SPSS für Windows durchgeführt. Die Normalverteilung der Werte wurde mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test geprüft. Eine signifikante Abweichung von der Normalverteilung wurde bei p < 0,2 angenommen. Da die Annahme einer Normalverteilung bei allen Variablen nicht aufrechterhalten werden konnte, wurden nicht-parametrische statistische Testverfahren angewendet. Zum Vergleich der Mediane zwischen den 19 verschiedenen Zentren wurde der Kruskall-Wallis-Test angewandt. Um zwei Gruppen hinsichtlich quantitativer Variablen statistisch zu vergleichen, wurde der U-Test nach Mann-Whitney durchgeführt. Da beim Vergleich von Untergruppen aus verschiedenen Jahren mehr als zwei unabhängige Stichproben vorlagen, wurden diese mit dem Kruskall-Wallis Test verglichen. Zum Vergleich von Variablen im Verlauf der Behandlungsdauer, d.h. von mehreren abhängigen Stichproben, wurde der Friedmann Test angewendet. Als Signifikanzniveau wurde bei allen Testverfahren außer dem Kolmogorov-Smirnov-Test p < 0,05 festgelegt.


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Die verteilungsfreien Konfidenzintervalle der Quantilen wurden nach den Formeln 5.5.61 und 5.5.64 der "Formeln und Tabellen der angewandten mathematischen Statistik" berechnet (Graf 87). Um den Zusammenhang zwischen ausgewählten Blutparametern und dem Gestationsalter zu quantifizieren, wurden einfache lineare Regressionsanalysen mit Berechnung des Intercept a, Anstieg b und Bestimmtheitsmass r2 durchgeführt. Zur graphischen Darstellung wurden die Einzelwerte entweder in Abhängigkeit vom Gestationsalter (s. 5.1) oder in Abhängigkeit vom Lebensalter (s. 5.2) aufgetragen. Durch die Punktwolken wurden Quantilenkurven gelegt (25%, 50%, 75%), diese wurden nicht geglättet.

Da prinzipiell nicht auszuschliessen ist, dass Inhomogenitäten in den zusammengefügten Datensätzen (aus EPO1, EPO2, EPO3, KAVH) bestehen können, verbietet sich ein einfaches Poolen der Daten. Aus diesem Grund wurde eine Methode der Metaanalyse unter Zugrundelegung eines Modells mit zufälligen Effekten zur Schätzung mittlerer Effekte (gewichtete Mittelwerte) herangezogen. Zur Berechnung der über die Studien gewichteten Mittelwerte, deren Varianz und das zugehörige Konfidenzintervall wurde die von Wernecke beschriebene "statistische Methode zum Schätzen eines gemeinsamen Effektes aus k unabhängigen Studien" (Wernecke 01) in Anlehnung an die von Laird und Mosteller (Laird 90) beschriebene Vorgehensweise durchgeführt. Im folgenden wird aus der Arbeit von Wernecke zitiert (mit freundlicher Genehmigung des Autors):


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Tue Feb 26 12:22:32 2002