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1.  Einleitung1

1.1 M. Niemann-Pick Typ C

M. Niemann-Pick Typ C (NPC) ist eine seltene, autosomal-rezessiv vererbte neuroviszerale Speicherkrankheit (Tab.1). Die Krankheit beginnt zu 95% der Fälle vor und zu 5% nach dem 15. Lebensjahr (infantile und juvenile bzw. adulte Fälle [103]). In infantilen Fällen steht die viszerale Symptomatik mit Hepatosplenomegalie im Vordergrund [45,103]. Kognitive Defizite und Ataxie sind die ersten Krankheitszeichen der juvenilen Fälle. Für die adulte Verlaufsform ist eine vertikale supranukleäre Blicklähmung charakteristisch. Alle Verlaufsformen der Krankheit sind durch eine progressive Neurodegeneration charakterisiert, die rasch zu Demenz und Tod führt, in adulten Fällen allerdings oft erst nach Jahren [45].

NPC wird ausgelöst durch Mutationen in den Genen NPC1 [14] (95%) und HE1 (=NPC2) [78] (5%), die für Proteine mit wesentlichen Funktionen im zellulären Cholesterinstoffwechsel (s. 1.4.) kodieren. NPC1 kontrolliert den Sorting-Mechanismus von Cholesterin in einem späten endosomalen Kompartiment - bei NPC1-Fehlfunktion wird die Weiterleitung endozytierten Cholesterins blockiert [18,58,63]. Vermutlich weil dadurch endozytiertes Cholesterin verzögert an die Cholesterinsensoren des Endoplasmatischen Retikulums gelangt, kommt es zur Verzögerung homöostatischer Kompensationsmechanismen auf externe Cholesteringabe [18]. Endozytiertes Cholesterin akkumuliert in der Folge in lysosomenähnlichen Vesikeln [18,63]. Über die genaue Funktion des lysosomalen, ubiquitär auftretenden, Cholesterin bindenden Proteins HE1 ist bisher wenig bekannt, es ist aber möglich, dass es mit dem NPC1-Protein in einem Komplex zusammenarbeitet [78].

Neuropathologisch äußert sich der Speicherungsprozess im NPC-Hirn in ballonierten Perikaryen und geschwollenen Zellfortsätzen [24,42]. Histochemische Färbungen für Ganglioside und neutrale Glykolipide zeigen granuläre Strukturen [24,25], die sich ultra[Seite 2↓]strukturell als multilamelläre, zytoplasmatische Einschlüsse - ‘polymorphous cytoplasmic bodies’ - darstellen [24,42]. Es gelang aber bis vor Kurzem nicht, mit histochemischen Methoden eine Anreicherung von Cholesterin im NPC-Hirn nachzuweisen, im Gegensatz zur ausgeprägten Cholesterinspeicherung in Fibroblasten und viszeralen Geweben. Ebensowenig konnte in Hirnhomogenaten, mit einer Ausnahme [79], eine signifikante Erhöhung von freiem Cholesterin festgestellt werden (Überblick in [102], Tab.2).

Neurofibrilläre Tangles (NFT - kurz ‘Tangles’, s. 1.3.) sind ein gemeinsames neuropathologisches Merkmal von NPC und M. Alzheimer (AD). Immunologisch und ultrastrukturell sind NFT in beiden Erkrankungen nicht zu unterscheiden [3], obwohl sie lichtmikroskopisch morphologische Unterschiede aufweisen - NFT in AD sind eher schlank, flammen- oder haarförmig [89], NFT in NPC eher rundlich, globös [48]. Das Sterbealter der juvenilen und adulten NPC-Fälle, in denen NFT beschrieben wurden [3,48 , 61 , 100 ], liegt zwischen 10 und 62 Jahren. Diese Fälle scheinen durch einen verhältnismäßig langsamen Verlauf der Erkrankung charakterisiert zu sein.

1.2 M. Alzheimer


AD ist eine häufige neurodegenerative Erkrankung des höheren Lebensalters mit Gedächtnis- und anderen kognitiven Defiziten, die zu einer erheblichen Beeinträchtigung der Aktivitäten des täglichen Lebens führen können (Tab.1). Die Defizite sind wahrscheinlich Folge eines massiven Synapsen- und Zellverlustes [6,68]. Der Anteil von AD an allen Demenzformen liegt zwischen 40 und 50% der Fälle [107, S.40]. Die altersspezifische Inzidenz steigt von 5 pro 1000 Personenjahre für 65-Jährige auf über 30 für 85-Jährige [4,113]. Die Inzidenz ist bei Frauen erhöht [113].

Offensichtlich gibt es für AD keine einheitliche Pathogenese [8]. Als Ursachen für die neuronale Degeneration kommen u.a. mechanische und chemische Noxen und ein neuronales Energiedefizit in Frage: die Inzidenz von AD ist nach Schädel-Hirn-Traumen erhöht [73], die Demenz langjähriger Boxsportler (Dementia pugilistica) liefert ein ähnliches neuropathologisches Bild wie AD [47]; chemische Noxen sind in epidemiologischen Studien sehr schwierig als Risikofaktoren zu identifizieren, jedoch zeigte sich ein Zusammenhang zwischen Aluminiumkonzentration des Trinkwassers und AD-[Seite 3↓]Inzidenz [22]; Messungen des Glukose-und Sauerstoffumsatzes in einem frühen Entwicklungsstadium der Krankheit lassen auf einen defizitären Energiehaushalt vulnerabler Gehirnregionen schließen [49]. Die lebenslange Addition derartiger Schädigungen könnte zu einer Vorschädigung großer, stoffwechselaktiver Neurone führen, die besonders anfällig für AD-assoziierte Pathologie sind [84]. Am Ende der Entwicklung steht Zelluntergang v.a. durch Nekrose, aber auch durch Apoptose.

Tab. 1 : Gegenüberstellung der Merkmale von M. Niemann-Pick Typ C und M. Alzheimer

Merkmal

NPC

AD 1

Epidemiologie

  

Häufigkeit

1:100.000 Lebendgeburten [104]

3-34:1000 Personenjahre [4,113]

Geographie

panethnisch

Prävalenz höher in Industriestaaten

Ätiologie

95%: NPC1 defekt [78]

ApoE e4 [17,88],

 

5%: NPC2 (HE1) defekt [78]

APP, PS1, PS2 defekt [34]

Klinik

[45]

[107, S. 617-643]

Alter

infantil - juvenil - adult

senil

Psychiatrie

progressive Demenz

progressive Demenz

 

Wahnsymptome (spät)

Wahnsymptome (spät)

  

Orientierungsverlust (früh)

  

Persönlichkeitsveränderungen (früh)

  

Störung des Schlaf-Wach-Rhythmus

Neurologie

vertikale supranukleäre Blickparese

 
 

(v.a. Abwärtsblick)

 
 

Ataxie, Dysphagie, Dystonie

Aphasie, Agnosie, Apraxie, Rigor u.a.

 

Anfälle

Anfälle und Myoklonien (spät)

internistisch

Hepatosplenomegalie

 

Neuropathologie

Atrophie [104]

Atrophie [57, S.249-252]

 

Speicherzellen [24,42,104]

lysosomale Dysfunktion [15,16]

 

Verlust von Purkinje-Zellen(u.a.)[104]

massiver Zellverlust [68]

  

massiver Synapsenverlust [68]

 

Demyelinisierung [102]

Demyelinisierung (spät) [101]

 

dystrophische Axone [104]

 
 

Meganeuriten [25,104]

Meganeuriten [68]

 

NFT,NT [3,48,61,100]

NFT,NT,NP [11,84,89]

  

SP [89]

  

Störung der Blut-Hirn-Schranke [40]

   

1 APP=amyloid precursor protein; PS1,2=Präsenilin 1 bzw. 2

 

Weniger als 5% aller AD-Fälle sind durch Mutationen in den Genen für das amyloid precursor protein (APP) und die Präseniline 1 und 2 bedingt [34]. Bei AD wird in unphysiologisch hohem Maße durch sog. b- und g-Sekretasen von APP ein 39-43 Aminosäuren langes Peptid, das Ab-Amyloid, abgespalten. Dieses aggregiert im Neuropil zu sog. Senilen Plaques (SP). Die Präseniline stellen wahrscheinlich Kofaktoren oder Teile der g-Sekretase dar [26]. Sowohl APP- als auch Präsenilin-Mutationen führen zu einer verstärkten Produktion und Ablagerung von Ab-Amyloid [34]. Diese Mutationen rechnet man zur „familiären Form“.


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Alle anderen Fälle werden als „sporadische Form“ bezeichnet. Neben dem Alter stellt Vorliegen des e4-Allels des Cholesterin-Transportproteins Apolipoprotein E (ApoE) den zahlenmäßig größten Risikofaktor für AD dar [17,88]. Das Erkrankungsalter wird durch Besitz des e4-Allels bis um 20 Jahre vorverlegt [17]. AD-Fälle mit Vorhandensein des e4-Allels weisen eine größere numerische Dichte sowohl von SP als auch von NFT auf [75]. ApoE vermittelt den Transport des für Synapsenaufbau erforderlichen Cholesterins von der perisynaptischen Glia zu wachsenden und regenerierenden Neuronen [70].

ApoE e4-Träger haben höhere Serumcholesterinspiegel als Nicht-e4-Träger [80]. Einnahme von sog. Statinen, die den Serumcholesterinspiegel senken, scheint vor AD zu schützen [110]. Die Blut-Hirn-Schranke ist bei AD geschädigt [40]. Eine Erhöhung von Cholesterin in AD-Hirnen konnte bisher nur in einer Studie gefunden werden ([97], Tab.2).

Tab. 2 : Lipidchemische Befunde in Niemann-Pick Typ C- und Alzheimer-Hirnen

Parameter

Methode 1

NPC

  

AD

  
  

Gewebe

Befund

Ref.

Gewebe

Befund

Ref.

Cholesterin, frei

HPLC

-------------

o. A.

-------

g

+

[ 97 ]

 

HPTLC

w,g

0

[ 102 ]

g

0

[ 23 ]

 

TLC

g

+

[ 79 ]

------------

o.A.

-------

Ganglioside

HPTLC

w,g

++

[ 102 ]

w,g

-

[ 101 ]

Cerebroside

HPTLC

w,g

+

[ 102 ]

w

-

[ 101 ]

        

-=erniedrigt; 0=unverändert; +=erhöht; ++=stark erhöht

    

w – weiße Substanz, g - graue Substanz

     

Ref. - Referenz; o. A. - ohne Angabe

      

1 HPLC=hochauflösende Flüssigkeitschromatographie; HPTLC=hochauflösende Dünnschichtchromatographie, TLC=Dünnschichtchromatographie

  

Neuropathologische Hauptcharakteristika von AD sind extrazelluläre Senile Plaques (SP) aus aggregiertem Ab-Amyloid und primär intrazelluläre neurofibrilläre Tangles (NFT) aus aggregiertem Protein Tau [89]. Tau-Aggregate in dystrophischen Dendriten im Bereich der SP und in gewundenen Dendriten des Neuropils werden als neuritische Plaques (NP) bzw. als Neuropilfäden (‘neuropil threads’, NT) bezeichnet [89]. Keine dieser Erscheinungen ist spezifisch für AD, und keine konnte bisher als direkt verantwortlich für Synapsen- und Zellverlusts erkannt werden. Die Anzahl der NFT korreliert jedoch besser mit dem kognitiven Defizit als die Anzahl der SP, allerdings nicht so gut wie der Synapsenverlust [6].


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1.3  Neurofibrilläre Degeneration


Im AD-Hirn entwickeln sich SP und NFT bereits Jahre bis Jahrzehnte, bevor klinische Symptome erkennbar sind. Noch ausgeprägter als bei SP folgt die Ausbreitung der NFT einem eigentümlichen Schema, das Braak und Braak [11] beschrieben und auf klinische Ausprägungen der Demenz bezogen haben: Transentorhinaler und Entorhinaler Kortex zeichnen sich durch ausgesprochene Vulnerabilität für die Tangle-Pathologie aus, sie werden zuerst von NFT befallen (Stadien I und II). In diesen Stadien zeigen sich nie Zeichen einer AD-Demenz. Daraufhin werden mehr und mehr limbische Areale einbezogen, wobei die Zahl der Tangles im medialen Temporallappen weiter zunimmt (Stadien III und IV). Diese Stadien entsprechen beginnender Demenz. Schließlich erfasst die Tangle-Pathologie auch die Assoziations- und zuletzt die Projektionsareale des Isokortex (Stadien V und VI). Diese Stadien entsprechen klinisch manifestem AD.

Elektronenmikroskopisch besteht der NFT überwiegend aus ca. 20nm breiten, aus zwei umeinander gewundenen Einzelfasern zusammengesetzten Filamenten, die alle 80nm eine Einschnürung aufweisen und als ‘paired helical filaments’ (PHF) bezeichnet werden [66]. Daneben treten auch ‘straight filaments’ (SF) mit einem Durchmesser von 15nm auf. Chemisch bestehen PHF und SF aus Protein Tau in einem hyperphosphorylierten Zustand [38]. Tau ist ein axonales, 352 bis 441 Aminosäuren langes, sehr lösliches Protein, das praktisch keine konstante Sekundärstruktur aufweist, über die C-terminale Domäne an Mikrotubuli bindet und ihnen Stabilität verleiht [66], indem es als „Schwelle“ für die „Gleise“ der Mikrotubuli fungiert. Es liegt im adulten menschlichen Hirn in sechs Isoformen vor, die durch alternatives Spleißen eines Gens entstehen [35,98]. Wird dabei Exon 10 inseriert, weist die Mikrotubuli-bindende Domäne vier je 18 Aminosäuren lange charakteristische Repeats auf, ansonsten nur drei.

NFT treten bei zahlreichen Erkrankungen und als Begleiterscheinung des normalen Alterungsprozesses [41] auf und können, müssen aber nicht, mit SP vergesellschaftet sein. Krankheitsentitäten mit NFT und SP sind neben AD u. a. das Down-Syndrom [109], Dementia pugilistica [47] und M. Parkinson [107, S. 200], solche nur mit NFT neben NPC bestimmte Prionenkrankheiten (M. Gerstmann-Sträussler-Scheinker und M. Creutzfeldt-Jakob [32]), der vermutlich durch Neurotoxin-Exposition hervorgerufene Parkinson-Demenz-Komplex von Guam [46], das 18q-Syndrom [39] und die durch Blei hervorgeru[Seite 6↓]fene Enzephalopathie [109]. Ultrastrukturelle Morphologie und Immunologie der Einschlüsse in den verschiedenen Entitäten unterscheiden sich teilweise erheblich, dies korreliert mit der Expression bestimmter Tau-Isoformen [98].

Tau, das aus PHF isoliert wird (PHF-Tau), weist eine Reihe von Besonderheiten auf: es ist hyperphosphoryliert [35], es bindet nicht an Mikrotubuli [66], es ist unlöslich [59] und es ist im Gegensatz zur physiologischen axonalen Lokalisation im somatodendritischen Kompartiment zu finden [98]. Phosphorylierung an den Stellen Ser199 und Ser202 ist für PHF-Tau so charakteristisch, dass ihr Nachweis beim Adulten durch den monoklonalen Antikörper AT8 für PHF-Tau fast zu 100% spezifisch ist [10,71]. AT8-Immunreaktivität geht der Aggregation von Tau in PHF voraus [5,10].

Die Sequenz, in der Tau Eigenschaften des PHF-Tau erwirbt, ist letztlich nicht geklärt. Folgender Ablauf wird jedoch auf der Basis von in vitro-Aggregationsexperimenten diskutiert [28] (Abb.1):

  1. Hyperphosphorylierung führt zur Loslösung von Tau von den Mikrotubuli [38];
  2. Tau reichert sich im somatodendritischen Kompartiment an;
  3. Tau verändert seine native Sekundärstruktur in einer Weise, dass die Repeat-Regionen zweier Moleküle aneinanderlagern (Konformationsänderung - [106]), dieser Prozess wird in vitro durch freie Fettsäuren (FFS) beschleunigt [108];
  4. über Zysteinreste der Repeat-Regionen dimerisieren zwei Moleküle kovalent durch Sulfhydridbrückenbildung, dieser Prozess wird durch ein oxidatives Milieu wesentlich beschleunigt [28];
  5. 5-7 Dimere lagern sich zu einem Nukleationskeim (‘nucleation sead’) zusammen, dieser Prozess wird durch Polyanionen wie Heparin, Glykosaminoglykane und Ribonukleinsäure beschleunigt [36];
  6. relativ rasche Elongation des Filaments durch Anlagerung weiterer Dimere an den Nukleationskeim, durch Anwesenheit von Polyanionen beschleunigt.


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Abb. 1 : Hypothetischer Ablauf der Bildung von paired helical filaments aus Tau-Molekülen (modifiziert nach [28])

1.4 Cholesterin

Das gering polare Isoprenoid Cholesterin (engl. cholesterol)2 ist in Säugerzellen ein unverzichtbarer Bestandteil von Membranen [20] und Vorstufe für lebenswichtige Steroidhormone und für Gallensäuren [21]. Seitenwege des Cholesterinstoffwechsels führen zu weiteren Isoprenoiden mit wichtigen zellulären Funktionen, wie Dolichol, Ubichinon, Geranylgeranyl- und Farnesylpyrophosphat [12]. Physikalische (Dicke, Fluidität) und biologische Eigenschaften der Membran (Proteinfunktion) werden durch deren Gehalt an Cholesterin entscheidend beeinflusst [20]. Cholesterin- und Sphingolipid-reiche Membrandomänen, sog. Rafts (‘Flöße’), tragen zur hoch organisierten Proteinverteilung in der Plasmamembran bei und beeinflussen wichtige Membranfunktionen wie Substanzaufnahme, -abgabe und Signaltransduktion [96].


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Die Leber hält als zentrales Organ des Cholesterinstoffwechsels die Cholesterinplasmaspiegel durch Verwertung von Cholesterin aus der Nahrung, Eigensynthese und Elimination mit der Gallenflüssigkeit weit gehend konstant, so dass die Versorgung extrahepatischen Gewebes mit Cholesterin gewährleistet ist. Der Transport von Cholesterin im Blut erfolgt in Lipoproteinen. Diese sind durch verschiedene Apolipoproteine charakterisiert, die zusammen mit zellulären Lipoproteinrezeptoren Aufnahme und Abgabe zellulären Cholesterins kontrollieren [21].

Nach Aufnahme von Cholesterin durch Endozytose oder auf rezeptorunabhängigem Wege [27] unterliegt Cholesterin, wie andere Bestandteile des Endosoms, einem Sorting-Mechanismus: es wird an die Zelloberfläche zurücktransportiert oder im Zellinnern weiter verarbeitet [27,96]. Im letzteren Fall spalten lysosomale Hydrolasen die Cholesterinester auf, das Cholesterin gelangt direkt oder über den Golgi-Apparat zur Plasmamembran [96]. Das NPC1-Protein signalisiert die Anwesenheit endozytierten Cholesterins an den zentralen Sensor der zellulären Cholesterinhomöostase im Endoplasmatischen Retikulum [53], vermutlich das Protein sterol regulatory element-binding protein cleavage-activating protein (SCAP) [13]. SCAP vermittelt die Proteolyse von sterol regulatory element-binding protein (SREBP), welches im Zellkern u.a. die Transkription des cholesterinsynthetisierenden Enzyms 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase (HMGR) und damit die endogene Cholesterinsynthese unterdrückt. Zusätzlich werden Cholesterinaufnahme und -veresterung gehemmt [96].

Obwohl fast alle extrahepatischen Gewebe ihren Cholesterinbedarf durch Aufnahme aus dem Blut decken, ist der Proteinapparat zur endogenen Cholesterinsynthese offensichtlich in allen Säugerzellen vorhanden [21]. Das im Endoplasmatischen Retikulum synthetisierte Cholesterin gelangt über den Golgi-Apparat zur Plasmamembran, wo es zusammen mit der gesamten Membran an einem kontinuierlichen Rezyklierungsprozess teilnimmt [27,96]. Wichtige Aspekte der zellulären Cholesterinhomöostase sind weitherhin der Efflux von Cholesterin aus der Zelle [27] und seine Verstoffwechselung zu Oxysterolen [64].

Das adulte Gehirn ist zwar eines der cholesterinreichsten Organe des Säugerkörpers, was v.a. auf seinen Gehalt an Myelinmarkscheiden zurückzuführen ist [51], es nimmt aber am Cholesterinstoffwechsel des restlichen Körpers praktisch nicht teil: es verstoffwechselt Cholesterin sehr langsam, nimmt es in nur verschwindend geringer [Seite 9↓]Menge aus dem Blut auf und produziert es überwiegend selbst [21]. Der zelluläre Efflux scheint in erster Linie in Form von 24S-Hydroxycholesterin (24OHCh) zu erfolgen [64]. Bildung von 24OHCh aus freiem Cholesterin erfolgt durch die Zytochrom-Oxidase Cholesterin-24-Hydroxylase (CYP46=cytochrome P450 No. 46) im Endoplasmatischen Retikulum [62].

1.5 Filipin

Filipin, eine Mischung aus mindestens vier Einzelsubstanzen, bildet mit Cholesterin einen Komplex mit dem stöchiometrischen Verhältnis 1:1 [93,95]. In Membranen führen Aggregate solcher Filipin-Cholesterin-Komplexe zu Deformationen, die im gefrierbruchelektronenmikroskopischen Bild als ‘pits’ und ‘protrusions’ von 15-25nm Durchmesser in Erscheinung treten. Die Dichte dieser Deformationen wird als Maß für den Cholesteringehalt von Membranen angesehen [95]. Filipin hat zwei Absorptionsmaxima bei 338 und 356nm. Es emittiert Fluoreszenz mit einem Emissionsmaximum von 490nm (blau). Durch die Bindung an Cholesterin wird die Intensität der Emission gesenkt [93]. Filipin wird als zytochemisches Fluorochrom zur Lokalisation [9] und Quantifizierung [43,56] von Cholesterin eingesetzt.


Fußnoten und Endnoten

1 

Im Dissertationstext durchgängig verwendete Abkürzungen:

7KCh - 7-Ketocholesterin, 24OHCh - 24-Hydroxycholesterin, AD - Alzheimer’s disease, ApoE - Apolipoprotein E, BSA - bovines Serumalbumin, CA - Cornu ammonis, CCD - charge-coupled device, cdk5 - cyclin dependent kinase 5, CYP46 - cytochrome P450 No. 46, FFS - freie Fettsäuren, HMGR - b-Hydroxy-b-Methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase, MAPK - Mitogen-aktivierte Proteinkinasen, NFT - neurofibrillary tangle, NP - neuritic plaque, NPC - Niemann-Pick type C disease, NT - neuropil thread, PHF - paired helical filament, ROS - reactive oxygen species, SCAP - SREBP cleavage-activating protein, SF - straight filament, SP - senile plaque, SREBP - sterol regulatory element-binding protein

2 Innerhalb der Zelle wird Cholesterin als Ester gespeichert. Nicht verestertes Cholesterin wird auch als „freies Cholesterin“ bezeichnet. In dieser Arbeit ist mit „Cholesterin“ immer „freies Cholesterin“ gemeint.



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19.11.2003