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4.  Methoden

4.1 Herstellung der Schnitte


Das in 4%-igem Formalin fixierte Material wurde zu Gewebsblöcken (ca. 1x1x0,5cm) zurechtgeschnitten. Mit einem Vibratom wurden 40µm dicke Schnitte hergestellt.

4.2 Filipin-Färbung


Die Schnitte wurden 1h frei flottierend auf dem Schüttler bei Raumtemperatur im Dunkeln in 0,2M Phosphatpuffer pH7,4 (PB) ausgewaschen, 3h mit 50µg/ml des cholesterinspezifischen Fluorochroms Filipin (Filipin-Komplex von Sigma, Taufkirchen) gefärbt und 1h ausgewaschen.

Optimale Konzentration und Färbedauer wurden in Vorversuchen bestimmt. Außerdem wurde die Spezifität der Färbung für freies Cholesterin nachgewiesen und an einem Modellsystem gezeigt, dass Filipin-Fluoreszenz und Cholesterinkonzentration in einem linearen Verhältnis stehen.

4.2.1 Evaluierung

Zeitkinetik: Schnitte wurden nach unterschiedlichen Zeitpunkten aus 50µg/ml Filipin genommen und 1h ausgewaschen. Das mikroskopische Bild wurde analysiert. Die Auftragung der Fluoreszenzwerte gegen die Zeit ergab eine hyperbole Sättigungskurve (Abb.3). Diese veranschaulicht, dass die Filipin-Bindungsstellen bereits nach 2h weit gehend abgesättigt sind und nach 3h mit keiner weiteren Steigerung der Färbeintensität zu rechnen ist.

Spezifität: Einige Schnitte wurden mit 0,5u/ml Cholesterin-Oxidase von Nocardia sp. (Merck, Darmstadt), die freies Cholesterin spezifisch umsetzt [91], 1h inkubiert. Dann wurden sie zusammen mit unbehandelten Schnitten für 3h mit 50µg/ml Filipin gefärbt. Die mit Cholesterin-Oxidase vorbehandelten Schnitte blichen innerhalb von ca. 1s aus, wenn sie mit monochromatischem Licht der Wellenlänge 360nm (Anregungsfrequenz von Filipin) bestrahlt wurden. Zurück blieb das Fluoreszenzbild eines ungefärbten Schnittes. Nicht vorbehandelte Schnitte bewahrten hingegen die Filipin-Fluoreszenz [Seite 14↓]über Wochen ohne Beeinträchtigung. Dies bedeutet, dass die Filipin-Färbung für freies Cholesterin spezifisch ist, wie bereits andernorts gezeigt wurde [9].

Abb. 2 : Zeitkinetik der Filipin-Färbung

Ausgleichskurve: RF(t)=0.22t/(0.22t+1)

Abb. 3 : Filipin-gefärbte, in Gelatine verfestigte Cholesterinmizellen-suspension

Balken entspr. 10µm, x400

Abhängigkeit der Filipin-Fluoreszenz von der Cholesterinkonzentration: Ein geeignetes Modell wurde durch Verfestigung von Cholesterinmizellensuspensionen geschaffen: Hierzu wurde eine alkoholische Lösung aus 1 Gewichtsteil Tristearin, 3 Teilen Phosphatidylcholin und 1 Teil Cholesterin (alle Sigma) in warmen PB eingespritzt. Durch Einspritzen unterschiedlicher Mengen der Lösung konnte die Cholesterinkonzentration der Suspensionen variiert werden. Anschließend wurden die Suspensionen in eine warme Gelatinelösung eingerührt (Endkonzentration 20% Gelatine). Die verfestigte Masse wurde mit einem Vibratom in 40µm-Abständen geschnitten. Diese Modell[Seite 15↓]schnitte wurden mit 50µg/ml Filipin gefärbt und anschließend 1h ausgewaschen. Bei einer Stöchiometrie der Filipin-Cholesterin-Bindung von 1:1 [93] war damit Filipin im Überschuss vorhanden. Das mikroskopische Bild wurde analysiert. Abb.4 zeigt das fluoreszenzmikroskopische Bild: Fluoreszierende runde Strukturen mit einem Durchmesser von ca. 2µm sind sichtbar. Es ergab sich eine lineare Beziehung zwischen Cholesterinkonzentration und Filipin-Fluoreszenz.

Abb. 4:Abhängigkeit der Filipin-Fluoreszenz von der Cholesterinkonzentration einer verfestigten Mizellensuspension, RF=relative Fluoreszenz, cpp=counts per pixel, Chol=Cholesterin, Ausgleichsgerade:

RF(Chol)=510*Chol

Dies bedeutet, dass die Filipin-Fluoreszenz im untersuchten Bereich der Cholesterinkonzentration proportional ist und damit von einem Fluoreszenzwert auf einen Cholesterinkonzentrationswert geschlossen werden kann.

4.3 Immunhistochemie

Nach Filipin-Färbung wurden die Schnitte 1h in 1,5%-igem bovinem Serumalbumin (BSA, Sigma) blockiert, über Nacht mit 1:1000 (in BSA) monoklonalem Maus-AT8-Antikörper [71] (NBS Biologicals, Huntingdon, Großbritannien) inkubiert, am Folgetag 1h ausgewaschen, 2h mit 1:200 (in BSA) sekundärem Antikörper inkubiert und 1h ausgewaschen. Als sekundäre Antikörper dienten Alexa-594- oder Alexa-488-konjugierte Schaf-Anti-Maus-Antikörper (beide von Molecular Probes, Leiden, Niederlande).


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Die Ausprägung des Auftretens der durch die Immunzytochemie detektierten Strukturen NFT, NT bzw. NP (s. 1.3.) wurde subjektiv durch Einteilung in 5 Grade abgeschätzt:


0

keine NFT/NT/NP

+

1-2 NFT/NT/NP pro Schnitt

++

wenige NFT/NT/NP

+++

zahlreiche NFT/NT/NP

++++

massenhaftes Auftreten


Gewebe mit bekanntem massenhaftem Auftreten neurofibrillärer Degeneration zeigte zahlreiche immunopositive Strukturen (Positivkontrolle). Nur mit sekundärem Antikörper behandelte Schnitte zeigten hingegen keine immunopositiven Strukturen (Negativ-kontrolle).

4.4 Fluoreszenzmikroskopie


Als für die Fluoreszenzmikroskopie geeignetes Eindeckmedium wurde Vectashield (Vector, Burlingame, Kalifornien) verwendet. Als Lichtquelle diente eine Xenon-Kurzbogenlampe (Ushio, Tokio, Japan). Ein zwischengeschalteter, softwaregestützter Monochromator (Till Photonics, Planegg) ermöglichte die Verwendung monochromatischen Lichtes. Das Fluoreszenzbild der Schnitte wurde durch ein invertiertes, für ultraviolettes Licht geeignetes Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX 70) betrachtet. Filipin wurde mit 360nm angeregt und durch Filter MBA510 betrachtet, die Wellenlängen und Filter für Alexa-488 bzw. Alexa-594 waren 480nm und Filter BA550 bzw. 560nm und Filter BA590.

Für Fotografien wurde wegen des intensiveren Signals Alexa-488-konjugierter sekundärer Antikörper verwendet. Für Filipin-Fluoreszenzmessungen wurden die Schnitte hingegen mit dem weniger intensiven Alexa-594-konjugierten Antikörper behandelt, da die für Filipin verwendete Anregungsfrequenz von 360nm Alexa-488 geringfügig angeregt [82], was zu falsch-hohen Filipin-Fluoreszenzwerten immunopositiver Strukturen führt.


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Einschätzung von Störfaktoren bei der Auswertung der Filipin-Fluoreszenz: Da bekannt ist, dass autofluoreszierende Granula in Tangle-tragenden (hier immunopositiven) Neuronen häufiger vorkommen [99], musste der Beitrag der Autofluoreszenz zur Gesamtfluoreszenz bei Anregung mit 360nm abgeschätzt werden. Ebenso musste der Beitrag des sekundären Antikörpers abgeschätzt werden (s.o.). Hierzu wurde das immunhistochemische Färbeverfahren ohne Filipin-Färbung durchgeführt. Das mikroskopische Bild wurde bei 360nm Anregung/Filter MBA510/50ms Anregungszeit analysiert. Die Schnitte zeigten ein schwarzes Bild ohne immunopositive oder autofluoreszierende Strukturen (Abb.5, links). Unter Verwendung der Anregungsfrequenz des sekundären Antikörpers (560nm/BA590/200ms) waren hingegen sowohl immunopositive als auch autofluoreszierende Strukturen zu sehen (Abb.5, rechts, selbe Stelle wie links). Dieser Versuch verdeutlicht, dass unter den Bedingungen der Messung der Filipin-Fluoreszenz (Anregungsfrequenz, Filter, Anregungszeit) Autofluoreszenz des Gewebes und Fluoreszenz des sekundären Antikörpers einen zu vernachlässigenden Beitrag zur Gesamtfluoreszenz leisten.

Abb. 5 :

links: Immunhistochemie ohne Filipin-Färbung, Analysebedingungen der Filipin-Fluoreszenzmessung; rechts: selbe Stelle unter anderen Bedingungen: es zeigen sich zentral ein Tangle und die Autofluoreszenz von Gefäßen (Pfeil); Balken entspr. 10µm; x400


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4.5  Fotografie

Es wurden eine Kamera Om-4 Ti (Olympus)und der Film Elite Color 400 (Kodak) verwendet. Für Fluoreszenzmessungen wurden digitale Aufnahmen mit einer an das Mikroskop angeschlossenen charge-coupled device(CCD)-Kamera angefertigt. Steuerung dieser Kamera, des Monochromators und Bildanalyse erfolgten durch das Fluorometrie-Programm Fucal 5.12 C (Till Photonics). Die Aufnahme der Bilder erfolgte mit 40ms Anregungs- (und damit Belichtungs-)zeit für Filipin und bis zu 200ms für die sekundären Antikörper. Die Bilder wiesen Intensitäten im linearen Messbereich der CCD-Kamera auf.

4.6 Bildanalyse


Zur Fluoreszenzmessung einzelner Neurone wurden der Gyrus temporalis superior aller AD-Fälle herangezogen und diejenigen Regionen der NPC-Fälle, die eine für die Analyse ausreichende numerische Dichte an NFT aufwiesen.

Fluorometrische Bestimmung des Cholesteringehalts Tangle-tragender Neurone: Von immunopositiven Neuronen wurden Bilder sowohl mit 480nm (Abb.6a)als auch mit 360nm Anregung (Abb.6b ) aufgenommen. Es wurden Skizzen der Filipin-Bilder angefertigt, auf denen jene Strukturen eingetragen wurden, die als Pyramidenzellen zu identifizieren waren. Als Kriterien für Pyramidenzellen galten: Größe (über 10µm breitester Durchmesser in der Aufnahmeebene), Form (pyramidenförmig), Orientierung (Längsachse senkrecht zur Kortexoberfläche) und Lokalisation (L. III und V). Im Anschluss an die Anfertigung der Skizzen wurden die korrespondierenden Immunfluoreszenzbilder betrachtet und drei Skizzenstrukturen markiert (Abb.6c):

  1. das immunopositive Neuron ‘T+’,
  2. das nächst liegende immunonegative Neuron ‘T1-‘ und
  3. das T1- nächst liegende immunonegative Neuron ‘T2-‘.

T+ wird im Folgenden auch als ‘Tangle-tragendes Neuron’, T1- und T2- werden als ‘Tangle-freie Neurone’ bezeichnet. Das Zentrum der Aufnahme lag jeweils in der Mitte [Seite 19↓]zwischen diesen 3 Zellen, so dass keine Zelle durch eine zentralere Lage im Beleuchtungskegel systematisch eine höhere Intensität haben konnte.

Abb. 6 : Fluoreszenzmessung der Cholesterinkonzentration Tangle-tragender Neurone:

a Immunofluoreszenzbild, b Filipin-Bild, c Identifizierung der Perikaryen, d Blindmarkierung der zu vermessenden Perikaryen, e Messung, f Rückidentifizierung, g Bestimmung der Verhältniszahlen, Balken entspr. 10µm, x400


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Es kamen nur Zellen zur Analyse, die in ihrer Querschnittsfläche nicht mehr als +/-50% voneinander abwichen. Da kleinere Neurone wegen Einstrahlens von Fluoreszenz aus dem Neuropil generell höhere Fluoreszenzwerte haben konnten, wurde für eine Zufallsstichprobe von Neuronen die Schnittfläche bestimmt, Tangle-tragende (T+) und Tangle-freie (T-) Neurone wurden miteinander verglichen. T+ und T- einer Stichprobe mit 239 Zellpaaren unterschieden sich nicht signifikant in der Schnittfläche (Abb.7). Mediane±Medianabweichungen (s. Statistik 4.7.) sind für T+ 1375 p²(Quadratpixel)±566 und für T- 1371±551.

Abb. 7 : Größen (Schnittflächen) in Quadratpixel [p²] Tangle-tragender (T+) und Tangle-freier (T-) Neurone in einer Stichprobe (n=239 Zellpaare)

Auf Kopien der Skizzen wurden die 3 Perikarya T+, T1- und T2- mit einem Kreuz markiert (Abb.6d). Ein zweiter Untersucher, der nicht wusste, ob eine Zelle immunopositiv war oder nicht, umrahmte im fluorometrischen Programm mit der Maus die markierten Perikarya. Das Programm gab die mittleren Intensitäten der umrahmten Flächen in counts-per-pixel an (Abb.6e). In einem letzten Schritt wurden die vermessenen Neurone als T+, T1- bzw. T2- rückidentifiziert (Abb.6f). Die Verhältniszahlen ‘T+/T1-‘ wurden als Maß für die Konzentration an freiem Cholesterin des Tangle-tragenden Neurons verwendet. Sie wurden mit den Verhältniszahlen ‘T2-/T1-‘ verglichen.


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4.7  Statistik

Während mit T+/T1- zwei benachbarte Neurone verglichen werden, von denen eines einen NFT trägt, vergleicht T2-/T1- zwei benachbarte, aber Tangle-freie Neurone. Da beide Zahlen den gleichen Nenner aufweisen, handelt es sich statistisch gesehen um verbundene Werte, was die Aussagekraft erhöht. Für einen Fall wurden je über 30 Bilder zur Analyse herangezogen, pro Fall also über 90 Zellen. Da eine parametrische Verteilung der Verhältniszahlen nicht unbedingt vorausgesetzt werden konnte, wurden nichtparametrische statistische Tests verwendet. Entsprechend wurden Mediane bzw. Medianabweichungen als Mittel- bzw. Streuungsmaße der Verteilungen der Verhältniszahlen herangezogen.

Die Verteilungen der beiden Verhältniszahlen wurden mit dem Wilcoxon-Vorzeichen-Rangtest für verbundene Stichproben verglichen. Korrelationen der Mediane von T+/T1- für die AD-Fälle mit Alter, Autolyse- und Lagerungszeit wurden mit dem Spearman-Rangkorrelationskoeffizienten evaluiert. Unterschiede der Verteilungen für männliche und weibliche AD-Fälle bzw. für ApoE e4-Träger und -Nichtträger wurden mit dem Zweistichprobentest nach Kolmogorov und Smirnov auf Signifikanz überprüft.

Die Signifikanzschwelle der statistischen Tests war a=0,05.


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19.11.2003