Dittrich, Anna-Maria: Induktionsbedingungen und kostimulatorische Effekte von ICOS - einem neuen T-Zellspezifischen Oberflächenantigen

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Kapitel 2. Einleitung

Der auffälligste Unterschied zwischen dem Immunsystem und anderen funktionellen Systemen des menschlichen Körpers, wie z.B. dem Verdauungssystem oder dem Fortpflanzungssystem, ist die Mobilität seiner Zellen. Um ihre Funktion zu erfüllen - den Körper vor schädigenden Parasiten, Bakterien und Viren zu schützen - ist es notwendig, daß die Zellen des Immunsystems in alle Bereiche des Körpers gelangen und dadurch alle seine Bereiche kontrollieren können. Eine weitere auffällige Eigenschaft ist die Vielzahl von unterschiedlichen Zellen, die zusammen das Immunsystem bilden. Bei diesen Grundvoraussetzungen ist es für die "Eu-Funktion" des Immunsystems essentiell, daß ein komplexes Signalnetzwerk existiert. Dieses Netzwerk muß gewährleisten, daß die Zellen an unterschiedlichen Orten im Körper Signale empfangen können, daß sehr unterschiedliche Zelltypen Signale austauschen können und daß diese Signale spezifisch, auf die jeweilige Situation zugeschnitten, wirken. Dieses Netzwerk wird im wesentlichen durch zwei Formen von Botenstoffen gebildet: 1. Proteine auf der Zelloberfläche, die einen spezifischen Signalaustausch von einer Zelle zur anderen ermöglichen und 2. Zytokine, d.h. lösliche Signale, die von diesen Zellen sezerniert werden und die über weite Strecken wirken und mehr als eine Zelle ansprechen können.

Die Funktion der Zellen des Immunsystems bei einer Antigen-spezifischen Immunabwehrreaktion wird wesentlich von T-Zellen gesteuert. Um dieser Aufgabe gerecht werden zu können, verfügen die T-Zellen über ein großes Repertoire von Signalmolekülen.

Von Anfang an wird jede Immunantwort streng reguliert. Bereits die Initiation einer Immunantwort wird durch einen spezifischen, selektiven Kommunikationsweg kontrolliert: Die vollständige Aktivierung der T-Zelle in vivo und in vitro ist nur möglich, wenn ihr einerseits über ein Histokompatibilitäts-Molekül (MHC-Molekül) das Antigen (Ag) präsentiert wird, das sie über ihren T-Zellrezeptor (TZR) erkennen kann. Zusätzlich benötigt die T-Zelle allerdings auch noch ein zweites Signal, ein sogenanntes „kostimulatorisches“ Signal über ein weiteres Rezeptor-Ligandenpaar [Müller, D.L. et al., 1989, Schwartz, R.H. et al., 1990, Weiss, A., 1993]. Dieses Signal kann durch die Ag-präsentierenden Zellen (APC) vermittelt werden, die auch das Ag präsentiert, möglicherweise aber auch über „third party cells“ [Samson, D.M. et al, 1993]. Ohne die zusätzliche Kostimulation wird die T Zelle anerg, d.h. sie kann durch erneute Stimulation nicht mehr aktiviert werden, oder aber es wird sogar ein intrazellulärer Signaltransduktionsweg angeschaltet, der zum programmierten Zelltod führt [Liu, Y. et al., 1992b, Müller, D.L. et al., 1989, Noel, P.J. et al., 1996b, Schwartz, R.H., 1990]. Somit wird verhindert, daß autoreaktive T-Zellen allein über das Antigen, das ihr TZR erkennt, aktiviert werden können.

In vitro kann die T-Zellaktivierung durch eine Vielzahl von Reagenzien erfolgen. Bei einigen dieser Reagenzien ist die Struktur, an der sie angreifen und zur T-Zellaktivierung führen, bekannt: Phorbolester wie Phorbol-myristat-acetat (PMA) aktivieren die Proteinkinase C. Ca2+-Ionophore wie das Ionomycin führen zu einer Erhöhung des intrazellulären Ca2+ [Weiss, A., 1993]. Zusammen gelingt es den beiden Reagenzien eine vollständige T-Zellaktivierung zu induzieren, wie sie in vivo durch Ligation des TZR und kostimulatorischer Moleküle erfolgt. Lectine wie Phytohämagglutinin P (PHA P) kreuzvernetzen Glykoproteine wie den TZR und führen dadurch zu einer T-Zellaktivierung. Schließlich ist auch eine Aktivierung der T-Zellen durch spezifische monoklonale Antikörper (mAk) gegen den


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TZR oder das TZR-assoziierte CD3 Molekül möglich [Weiss, A., 1993]. Andere Reagenzien inhibieren die Signaltransduktionswege der T-Zellaktivierung wie z.B. das Cyclosporin A (CsA). CsA inhibiert spezifisch die Ca2+/Calmodulin abhängige Phosphatase Calcineurin, die in den Signalweg eingeschaltet ist, der nach Ligation des TZR induziert wird. Die Anwendung dieser Reagenzien ermöglicht es, genauer zu definieren durch welche Signalwege die Expression eines Moleküls reguliert wird. Außerdem ist die Abhängigkeit der Expression der T-Zellaktivierungsantigene von einem Signal (nur PMA oder Ionomycin) oder zwei Signalen ein wichtiges Unterscheidungskriterium, das es ermöglicht, die T-Zellaktivierungsantigene in zwei Gruppen zu unterteilen. Einige T-Zellaktivierungsmoleküle, wie z.B. CD40 Ligand (L), benötigen für eine vollständige Induktion die Wirkung beider Reagenzien zusammen, ihre Induktion ist also stringenter reguliert als die Expression der Moleküle der einsignalabhängigen Gruppe, zu denen z.B. CD69 gehört [Lopez-Cabrera, M. et al., 1993].

Die Aktivierung der T-Zelle stellt allerdings nur einen der ersten Schritte im Laufe einer Immunreaktion dar. Die Aktivierung und Differenzierung der anderen Zellen des Immunsystems wird im folgenden von den CD4+-T-Zellen mit ihren Signalmolekülen dirigiert. Dadurch wird gewährleistet, daß eine koordinierte Aktivierung und das Zusammenwirken von Makrophagen, B-Zellen, "natürlichen killer-Zellen" (NK-Zellen) und CD8+-Zellen erfolgt.

Das in der vorliegenden Arbeit charakterisierte Molekül ICOS (= "inducible costimulator") stellt eines der Moleküle innerhalb dieses komplexen Signalnetzwerks dar. Dafür sprechen eine Reihe von Befunden, die zu Beginn des experimentellen Teils dieser Arbeit bereits bekannt waren: ICOS ist ein T-Zellspezifisches Aktivierungsmolekül. Untersuchungen der Expression des Moleküls in Zellinien und primären Zellen rechtfertigen die Bezeichnung „T-Zellspezifisch“, da, abgesehen von den T-Zellen, keine der untersuchten Zellpopulationen das Molekül exprimiert. T-Zellen exprimieren ICOS nach ihrer Aktivierung, CD4+-Zellen allerdings deutlich schneller als CD8+-Zellen. Vergleiche mit anderen T-Zellaktivierungsmolekülen zeigen bis heute keine signifikante Übereinstimmung im Expressionsmuster von ICOS mit bekannten T-Zellaktivierungsmolekülen, so daß angenommen werden muß, daß es sich bei ICOS um ein neues T-Zellaktivierungsmolekül handelt.

Bis jetzt ist das Molekül nur durch einen monoklonalen Antikörper darstellbar. Dieser Antikörper (Ak) (mAK F44) wird von einem Hybridom produziert, das einer Fusion von Myelomzellen mit Milzzellen einer Maus, die mit aktivierten T-Zellen immunisiert wurde, entstammt. Immunpräzipitationen mit dem mAk F44 und anschließende Analyse mittels Gelelektrophorese zeigen, daß ICOS im nicht-reduzierten Zustand ein Dimer darstellt, dessen Bestandteile über Disulfidbrücken verbunden sind und ein Molekulargewicht von 29 bzw. 27 Kilo Dalton haben.

Histologische Untersuchungen von primärem und sekundärem lymphatischem Gewebe sowie von lymphatischen Neoplasien zeigten ein sehr spezifisches Expressionsmuster von ICOS. Die Expression des ICOS Moleküls ist fast ausschließlich auf die helle Zone der Keimzentren des sekundären lymphatischen Gewebes beschränkt. Durchflußzytometrische Analysen der T-Zellen aus sekundärem lymphatischen Gewebe zeigen, daß innerhalb dieser Zellpopulation ca. 50-80% der Zellen ICOS+ sind. Im Knochenmark und Thymus des älteren Erwachsenen wird ICOS nicht exprimiert. Die Helle Zone des Keimzentrums, der Bereich der Hauptexpression des ICOS Moleküls, besteht aus den Zentro


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zyten, d.h. B-Zellen, follikulär dendritischen Zellen (FDC) und T-Zellen [McLennan, I.C.M. et al., 1994]. In diesem Bereich findet eine positive Selektion, Proliferation und Differenzierung derjenigen B-Zellen statt, die nach Hypermutation die Immunglobuline (Ig) exprimieren, die die stärkste Affinität zum Immunantwort auslösenden Ag zeigen [Kelsoe, G., 1996]. Dies erfolgt einerseits über die Präsentation von Ag durch das enge Netzwerk von FDC, andererseits auch über T-Zelloberflächenstrukturen, wie z.B. CD40L. Zusammen verhindern Ag und T-Zelloberflächenstrukturen, daß die B-Zellen den Weg der Apoptose einschlagen [Koopman, G. et al., 1994, Liu, Y.-J. et al., 1989] (Zusammenfassungen der Prozesse z. B. in Clark, E.A. et al, 1991, Grouard, G. et al., 1995, McLennan, I.C.M. et al., 1997 und Parker, D.C., 1993). Zahlreiche Versuche und genetische Aberrationen unterstreichen die entscheidende Rolle, die die Interaktion von CD40 mit CD40L für die Regulation [Garonne, P. et al., 1995, Lagresle, C. et al., 1995, Schattner, E.J. et al., 1995] bzw. Rettung vor Apoptose [Lederman, S. et al., 1994, Liu, Y.-J. et al, 1989], Proliferation [Nishioka, Y. et al., 1994, Kwekkeboom, J. et al., 1994], Immunglobulinklassenwechsel [Lederman, S. et al., 1994, Oxenius, A. et al., 1996], Immunglobulinsekretion [Kwekkeboom, J. et al, 1994, Lederman, S. et al., 1992, Splawski, J. et al., 1993] und Entdifferenzierung [Arpin, C. et al., 1995, Gray, D. et al., 1996] der B-Zelle spielt [Banchereau et al., 1994]. Einige dieser Versuche zeigen allerdings auch, daß dieses Rezeptor-Ligandpaar nicht allein für die Vorgänge bei der Entwicklung im Keimzentrum verantwortlich ist, sondern, daß noch weitere, bisher unbekannte Signalmoleküle existieren müssen, die die Entwicklung der B-Zelle durch die T-Zellhilfe steuern [Kwekkeboom, J. et al, 1994, MacLennan, I.C.M. et al., 1997, Nishioka, Y. et al., 1994]. Diese Untersuchungen sind v.a. im Anbetracht des ICOS-Expressionsmusters überaus interessant, da sie eine mögliche Funktion von ICOS nahelegen.

Erste Befunde zur Funktion von ICOS bestanden bereits zu Beginn der Arbeit: Bezüglich des Parameters "Proliferation" konnte gezeigt werden, daß ICOS ein kostimulatorisches Molekül ist. Als kostimulatorische Moleküle werden solche Moleküle bezeichnet, die in der Lage sind, bestimmte Zellaktivierungsparameter zu induzieren bzw. hochzuregulieren, wenn diese Parameter durch suboptimale Stimulation über den TZR alleine nicht oder nur schwach induziert werden. Dies ist von besonderer Relevanz, da in vivo die Antigenkonzentration den limitierenden Parameter für die Aktivierung der T-Zellen darstellt. Dadurch ist in vivo die zusätzliche Ligation eines kostimulatorischen Moleküls notwendig, um einen Schwellenwert zu überschreiten, der zur Aktivierung der T-Zelle führt. Die Liste derjenigen Moleküle, die in der Lage sind, Kostimulation auszuüben, ist in den letzten Jahren stark gewachsen. Es zählen hierzu: CD5 [Alberola-Ila, J. et al., 1992], CD26 [Dang, N.H. et al., 1990], CD27 [Kobata, T. et al., 1994], CD28 [Baroja, M.L. et al., 1989], CD69 [Cebrián, M. et al., 1988] und eine Reihe anderer Moleküle (Aufzählung in Kuiper, H.M. et al., 1995 und Liu, Y. et al., 1992b). Allerdings ist für die meisten Moleküle nur untersucht worden, ob sie die Wirkung der Ligation des TZRs bezüglich der Proliferation und z.T. der Zytokinsekretion verstärken können. Am genauesten bezüglich der kostimulatorischen Funktion wurde bis jetzt das CD28 Molekül untersucht. Unter anderem werden durch Kostimulation über das CD28 Molekül die T-Zellproliferation und eine Reihe von Zytokinen induziert, die T-Zellhilfe für APCs gesteigert und die T-Zellanergie verhindert (Zusammengefaßt z.B. in Lenschow, D.J., 1996 und Linsley, P.S. et al., 1993).

Allerdings ist bis jetzt keine befriedigende Erklärung gefunden worden, warum eine Vielfalt von kosti


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mulatorischen Moleküle existiert, die scheinbar identische Aufgaben erfüllen. Die in vivo-Funktion der bereits bekannten kostimulatorischen Moleküle bleibt oft unklar, da in vitro-Versuche häufig eine funktionelle Redundanz zeigen; die Ursache, warum anscheinend redundante Moleküle exprimiert werden, aber nicht genau geklärt wird. Viele dieser Moleküle werden gewebsspezifisch oder aktivierungsabhängig exprimiert, was darauf hindeutet, daß durch diese Vielfalt eine Feinregulation der Kostimulation erreicht wird. Trotz dieser Vorstellung werden die Details dieser Feinregulation und das Zusammenspiel der Moleküle nur schlecht verstanden. Die vorliegende Arbeit charakterisiert eine Reihe von Parametern, die von ICOS kostimulatorisch beeinflußt werden. Sie zeigt auf, wo Gemeinsamkeiten mit anderen kostimulatorischen Molekülen bestehen. Andererseits verdeutlichen die Ergebnisse aber auch, daß zumindest für dieses Molekül, die oftmals beschriebene Redundanz nur bedingt zutrifft, da durch das ICOS Molekül auch Effekte ausgelöst werden, die in dieser Weise bis jetzt nicht für andere Moleküle beschrieben worden sind. Möglicherweise kann die Aufklärung der durch das ICOS Molekül ausgelösten Wirkungen helfen, das Phänomen der Kostimulation besser zu verstehen. Für die Funktion von T-Zellen als „Dirigenten“ der Immunantwort und als Effektorzellen ist ihre Aktivierung durch Kostimulation essentiell. Die Charakterisierung des kostimulatorisch wirkenden ICOS Moleküls kann daher zur Aufklärung des komplexen Kommunikationsnetzwerks des Immunsystems beitragen und es somit ermöglichen, die physiologischen und pathologischen Vorgänge des Immunsystems besser zu verstehen.


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Fri Mar 16 20:17:39 2001