Dittrich, Anna-Maria: Induktionsbedingungen und kostimulatorische Effekte von ICOS - einem neuen T-Zellspezifischen Oberflächenantigen

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Kapitel 4. Material und Methoden

4.1 Materialien und Reagenzien

Nicht erwähnte Materialien, Reagenzien und Geräte entsprechen denjenigen, die in der Laborroutine in einem medizinisch-naturwissenschaftlich arbeitenden Labor verwandt werden und bei entsprechenden Firmen zu beziehen sind. Das gleiche gilt für Lösungen und Reagenzien, deren Zusammensetzung nicht näher erläutert wird. Alle Reagenzien wurden wie vom Hersteller angegeben gelöst/verdünnt und gelagert.

4.1.1 Reagenzien für ELISAs

4.1.1.1 Antikörper

Antikörperpaar zur Bestimmung von

Humanes (Hu) IFN-gamma (ein Ak biotinyliert)

Medgenix über Biosource, Fleurus, Belgien

Anti-hu IgG

Tago-Immunologicals, Camarillo, CA, USA

Anti-hu IgM

Tago-Immunologicals, Camarillo, CA, USA

Antikörperpaar zur Bestimmung von hu IL-2

(ein Ak biotinyliert)

Endogen, Cambridge, MA, USA

Antikörperpaar zur Bestimmung von hu IL-4

(ein Ak biotinyliert)

Pharmingen, San Diego, CA, USA

Antikörperpaar zur Bestimmung von hu IL-5

(ein Ak biotinyliert)

Pharmingen, San Diego, CA, USA

Anti-hu Immunglobulin (biotinyliert)

Tago-Immunologicals, Camarillo, CA, USA

4.1.1.2 Standards

IFN-gamma (hu rekombinantes (r) IFN-gamma)

Medgenix über Biosource, Fleurus, Belgien

IgG (hu)

Sigma, St. Louis, MS, USA

IgM (hu)

Sigma, St. Louis, MS, USA


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IL-2 (hu rIL-2)

Peprotech, London, Großbritannien

IL-4 (hu rIL-4)

Pharmingen, San Diego, CA, USA

IL-5 (hu rIL-5)

Pharmingen, San Diego, CA, USA

4.1.2 Antikörper und Sekundärreagenzien für die Durchflußzytometrie

4.1.2.1 Antikörper

Die Anmerkung „Hybridom“ bedeutet, daß der Antikörper durch ein laboreigenes Hybridom produziert und im Labor aufgereinigt wurde. Wenn nicht anders angegeben, stammen die Ak aus der Maus und sind gegen hu Moleküle gerichtet. Ak OKT3 und 9.3 wurden als Aszites, sonstige Ak im aufgereinigten Zustand verwendet.

Klon

Spezifität

Markierung

bezogen durch:

2A11

Isotyp

-

Hybridom

2A11

Isotyp

FITC

Hybridom

63D3

CD14

-

ATCC-Hybridom

7G7B6

CD25

-

ATCC-Hybridom

F44

ICOS

-

Hybridom

F44

ICOS

FITC

Hybridom

91d6

CD4

-

ATCC-Hybridom

9.3 [Baroja, M.L. et al., 1989]

CD28

-

freundlicherweise von Immunex, Seattle zu Verfügung gestellt

B1.49.9

CD25

FITC

Coulter-Immunotech, Hamburg

B73.1

CD16

-

Hybridom

BU12

CD19

-

Hybridom

FN50

CD69

-

4th international workshop of leucocyte typing

G28-5

CD40

-

ATCC-Hybridom

H1B19

CD19

CyChrome

Pharmingen, San Diego, CA, USA

MOPC-21

Isotyp

-

Sigma, St. Louis, MS, USA

OKM1

CD11b

-

ATCC-Hybridom

OKT8

CD8

-

ATCC-Hybridom


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SK1

CD8

FITC

Becton Dickinson, San José, CA, USA

SK3

CD4

FITC

Becton Dickinson, San José; CA, USA

TRAP-1

CD40L

-

Hybridom

TRAP-1

CD40L

FITC

Hybridom

UCHT-1

CD3

FITC

Serotec, Wiesbaden

UCHT-1

CD3

PE

Pharmingen, San Diego, CA, USA

UCHT-1

CD3

CyChrome

Pharmingen, San Diego, CA, USA

4.1.2.2 Sekundärreagenzien und -antikörper:

Reagens

Spezifität

Markierung

bezogen durch:

Antiserum

anti-maus IgG

FITC

Caltag, San Francisco, CA, USA

Antiserum

anti-maus IgG-Fab-Fragment

FITC

Jackson, West Grove, CA, USA

Streptavidin

bindet an

Biotin

FITC

Jackson, West Grove, CA, USA

Streptavidin

bindet an

Biotin

PE

Jackson, West Grove, CA, USA

4.2 Zellpräparation

Alle Arbeiten (bis auf 4.2.1) wurden steril ausgeführt.

4.2.1 Zellzählung

Die Zellen wurden nach Mischung mit einer 0,001% Trypanblaulösung (Biochrom, Berlin) gezählt, um vitale von nicht vitalen Zellen zu diskriminieren. Die Zählung erfolgte in einer Neubauer-Zählkammer.

4.2.2 Präparation von „Nylon-T-Zellen“

Die Präparation von sogenannten „Nylon-T-Zellen“ (NTZ) erfolgte aus „buffy coats“ von gesunden Spendern, die aus der Blutbank des UKRV sowie von Mitarbeitern aus dem Labor stammten. Durch Dichtegradientenzentrifugation über eine Ficoll-Lösung (Biochrom, Berlin) wurde aus diesen „buffy coats“ eine Interphase isoliert, die die peripheren mononukleären Zellen enthält. Darauffolgendes zweimaliges Waschen mit PBS diente dazu, Zelltrümmer und Thrombozyten zu entfernen. Die Zellen wurden dann durch eine Passage über mit Nylonwolle (Bibby Dunn, Asbach) gestopften Spritzen von


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den Monozyten und B-Zellen befreit. Die durch diese Methode gewonnen Zellen wurden jedesmal durchflußzytometrisch auf ihren T-Zellanteil untersucht, wobei als Maß der prozentuale Anteil an CD3+-Zellen galt, der immer zwischen 85% und 95% lag. Die beschriebene Vorgehensweise erfolgte in Anlehnung an Boyum, A., 1968 und Eisen, S.A. et al., 1972.

4.2.3 Aufreinigung von CD4+,CD8- bzw. CD8+ T-Zellen

Um für bestimmte Fragestellungen eine besser definierte Zellpopulation zu erhalten, wurden die Nylon-T-Zellen in weitere Untergruppen separiert. Durch geeignete Ak wurden CD4+-T Zellen erhalten, indem NK-Zellen, B-Zellen, CD8+-Zellen und Monozyten mit Hilfe dieser Ak entfernt wurden. Für andere Versuche wurden CD8--Zellen hergestellt, indem die CD8+-Zellen entfernt wurden (für die in 5.2.2.3 beschriebenen Experimente) oder CD8+-Zellen angereichert, indem NK-Zellen, B-Zellen, Monozyten und CD4+--Zellen entfernt wurden. Diese Isolation erfolgte in Anlehnung an Manyonada, I.T. et al., 1992. Exemplarisch wird im folgenden die Aufreinigung der CD4+-Zellen beschrieben. Die Vorgehensweise war für die Aufreinigung der beiden anderen Zellpopulationen identisch, abgesehen davon, daß entsprechend andere Antikörper verwandt wurden. Die Nylon-T-Zellen wurden sofort weiterverarbeitet. Alle nachfolgenden Arbeiten wurden auf Eis ausgeführt, um eine Internalisierung oder ein Abschneiden der Oberflächenantigene zu verhindern. Zu der Zellösung wurden zunächst folgende Antikörper hinzugegeben: OKM-1, L243, OKT8, BU12 und, nach einer dreißigminütigen Inkubation sowie zwei Waschschritten, die mit Ziege-anti-Maus Antikörper beschichteten Magnetpartikel (=Dynabeads) (Ziege-anti-Maus, Dynal, Oslo, Norwegen) dazu gegeben. Die Zellen wurden erneut 30 Minuten inkubiert. Anschließend erfolgte die magnetische Entfernung derjenigen Zellen, die die oben beschriebenen Antikörper und dementsprechend die Magnetpartikel gebunden hatten, durch einen Magnethalter (Dynal MCP 6R Magnethalter, Dynal, Hamburg). Der Erfolg der Aufreinigung wurde jedesmal durchflußzytometrisch überprüft, wobei die eingesetzten Zellen durchschnittlich zu 92-98% aus CD4+-Zellen bestanden, bzw. keine CD8+-Zellen mehr nachweisbar waren. Die Reinheit der CD8+-Zellen betrug im dargestellten Experiment (5.2.2.2.5) 93% CD8+-Zellen.

4.2.4 Mitomycin-Behandlung

Um eine Proliferation von Zellen zu verhindern, ist es möglich, deren DNA durch Kreuzvernetzung mit Mitomycin der Replikation unzugänglich zu machen. Dies wird u.a. notwendig, wenn die durch T-Zellen induzierte Immunglobulinsekretion von B-Zellen untersucht werden soll [Hirohata, S. et al., 1993]. Die Zellen wurden für 40 Minuten in einer 0,05 µg/ml Mitomycin Lösung (Sigma, St. Louis, MS, USA) bei 37° C inkubiert und danach dreimal mit PBS gewaschen. Die Inkubationsdauer bei 37° C war austitriert worden und stellt einen Kompromiß aus Hemmung der Proliferation und Zellschädigung durch das Mitomycin dar.

4.2.5 Präparation von tonsillären B-Zellen

Aufgrund der einfachen Zugänglichkeit und des hohen B-Zellanteils wurden die benötigten B-Zellen aus Tonsillen (Tonsilla palatina) extrahiert. Diese Tonsillen stammten von Spendern (Alter 4-28 Jahre), denen die Tonsillen aufgrund typischer medizinischer Indikationen (rezidivierende Tonsillitiden) entnommen wurden, die ansonsten aber gesund waren. Die Tonsillen wurden nach ihrer Entnahme sofort in Zellkulturmedium (R10F+) (RPMI 1640 Medium mit 10% (v/v) FCS, 50 U/ml Penicillin,


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25 µg/ml Streptomycin) gelegt und auf Eis zum Labor transportiert. Das beschriebene Verfahren entspricht der Vorgehensweise in Splawski., J. et al., 1991 mit einigen Modifikationen.

4.2.5.1 Aufreinigung von tonsillären B-Zellen

Alle nachfolgenden Arbeiten wurden auf Eis durchgeführt, um die sehr empfindliche B-Zellpopulation [Liu, Y.-J. et al., 1989] zu schützen. Die Tonsillen wurden mit Skalpell und Schere von Fett- und Bindegewebe befreit. Das angereicherte lymphatische Gewebe wurde durch 2 Edelstahlsiebe hindurchgedrückt (Prüfsiebe à 500 und 212 µm Maschenweite, bezogen über Werkstätte für Chemie und Photo, Berlin), um eine Einzell-Zellsuspension zu erhalten. Aus dieser Zellsuspension wurde wie in 4.2.2 beschrieben eine Interphase isoliert. Anschließend erfolgte die Depletion von T-Zellen durch Rosettierung mit Schafserythrozyten. Dazu wurden die mononukleären Zellen pelletiert, in der Schafserythrozytenlösung (Herstellung der Schafserythrozytenlösung s.u.) inkubiert und zur Verbesserung der CD2-CD58-Homolog-Bindung aufeinander zentrifugiert. Nach vorsichtiger Lösung des Zellpellets in PBS wurde aus der Lösung eine Interphase isoliert (wie in 4.2.2), die die B-Zellen enthält, da die T-Zellen - an die Schafserythrozyten gebunden - pelletiert werden. Der Anteil an CD19+-Zellen (B-Zellen) betrug regelmäßig zwischen 90% und 98%.

4.2.5.2 Präparation einer Schafserythrozytensuspension für die Depletion von T-Zellen

Das Schafsblut stammte aus der Versuchstierhaltung in Berlin, Marienfelde. Als anti-Koagualans wurde dem Schafsblut bei der Entnahme Citratlösung (3,13 %, Verhältnis Blut zu Citratlösung 10:1 v/v) hinzugesetzt. Das aus dem Schafsblut durch Zentrifugation gewonnene Erythrozytenpellet wurde in 0,2 M Ammoniumethylisothiouroniumbromid (Sigma, St. Louis, MS, USA), pH 9 gelöst und 15 Minuten bei 37° C inkubiert. Nach viermaligem Waschen wurde aus dem Zellpellet eine 5% Lösung in R10F+ hergestellt, die bei 4° C bis zu vier Wochen gelagert wurde. Durch diese Präparation wird auf den Schafserythrozyten ein dem CD58 homologes Ag stabil freigelegt, so daß es das CD2 Antigen der T-Zellen binden kann.

4.3 Stimulation von Zellen

Die Inkubation der Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37° C, 5% C02. Die Inkubationsdauer ist bei den jeweiligen Experimenten vermerkt.

4.3.1 Stimulation von T-Zellen

4.3.1.1 Stimulation mit PMA und/oder Ionomycin

Die Präparation der Reagenzien erfolgte unmittelbar vor ihrem Einsatz. Um eine gute Lösung der hydrophoben Reagenzien PMA und Ionomycin (beide: Sigma, St. Louis, MS, USA) zu erreichen, wurden die Reagenzien zunächst in einem, im Vergleich zum Endvolumen der Zellsuspension, kleinen Volumen Zellkulturmedium ohne FCS (Vermeidung der Bindung der lipophilen Reagenzien an FCS) gelöst und unmittelbar darauf zur Zellsuspension gegeben und die Zellen dann in die Zellkulturflaschen/-platten gebracht. Sollte der durch PMA und Ionomycin ausgelöste Signaltransduktionsweg blockiert werden, wurde dem kleinen Volumen Zellkulturmedium neben PMA und Ionomycin noch Cyclosporin A (CsA) (Sandoz, Nürnberg) hinzugefügt. Die Endkonzentration des PMA betrug in allen


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Versuchen, in denen keine anderen Angaben gemacht werden, 33 ng/ml, die Endkonzentration des Ionomycin 200 ng/ml, die Endkonzentration des CsA betrug 1 µg/ml. Die Dichte der Zellen betrug in allen Experimenten (sofern keine anderen Angaben gemacht werden) 1x106/ml.

4.3.1.2 Stimulation mit PHA P

Das PHA P (Difco, Detroit, MI, USA) wurde in einer Endkonzentration von 1,25 µg/ml eingesetzt. Die für das Zellsuspensionsvolumen erforderliche Menge wurde diesem zugesetzt und die Suspension dann in die erforderlichen Zellkulturplatten/-gefäße gebracht. Die verwendete Konzentration war in Vorexperimenten austitriert worden. Die Dichte der Zellen betrug in allen Experimenten (sofern keine anderen Angaben gemacht werden) 1x106/ml.

4.3.1.3 Stimulation durch immobilisierte Antikörper

Die Immobilisation der Ak erfolgte nach Kruisbeek, A.M. et al., 1991. Die erforderliche Menge an Ak wurde für jeden Ak austitriert, abhängig vom Effekt, der erzielt werden sollte. Zunächst wurden 96-Loch Rundboden Platten (Nunc, Wiesbaden) mit einem unspezifischen anti-Maus Ak (anti-Maus IgG, Sigma, St. Louis, MS, USA) beschichtet (16 h bei 4° C, 50 µl Volumen/Vertiefung). Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die stimulierenden Ak hinzupipettiert, ebenfalls in einem Volumen von 50 µl und wie der erste Ak inkubiert. Die Platten wurden erneut zweifach gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt wurden 100 µl Medium (R10F+) in die Vertiefungen pipettiert. Die Zellen wurden sofort in ebenfalls 100 µl Volumen hinzupipettiert. Für 24-Loch (Nunc, Wiesbaden) Platten betrugen die Antikörpervolumina 300 µl. Sollte mehr als ein Ak immobilisiert werden, dann wurden die Ak, bevor sie in die Löcher pipettiert wurden, gemischt, damit beide Ak parallel immobilisiert werden konnten. Die Dichte der Zellen ist bei den entsprechenden Experimenten vermerkt.

4.3.2 Stimulation von B-Zellen

Die Stimulation von B-Zellen erfolgte in allen Versuchen durch stimulierte T-Zellen. Die Vorgehensweise entsprach dabei den Arbeiten von Lagresle, C. et al., 1994 und Lipsky, P.E., 1990. Die Zellen wurden in 96-Loch Zellkulturplatten stimuliert. Die T-Zellen waren jeweils am Vortrag präpariert worden und in einer Konzentration von 2 x 106/ml in R10F+ in Zellkulturflaschen (Greiner, Frickenhausen) im Brutschrank inkubiert worden. Die B-Zellen wurden unmittelbar vor der Stimulation isoliert. Die Zellen wurden gemischt, so daß sich in einem Volumen von 100 µl die für das Experiment vorgesehene Menge/Vertiefung befand. Für die Stimulation durch anti-CD3 Ak stimulierte T-Zellen wurden pro Vertiefung 50 000 T-Zellen und 25 000 B-Zellen in die Vertiefungen pipettiert. Für die Stimulation durch PHA P stimulierte T-Zellen wurden 50 000 T-Zellen und 50 000 B-Zellen in jedes Loch gebracht. Die notwendige Menge des PHA P war in Vorexperimenten austitriert worden und wurde den bereits gemischten Zellpopulationen unmittelbar vor dem Einbringen in die Vertiefungen zugesetzt.

4.4 Proliferationsassay

Die Proliferation der Zellen wurde über den Einbau an 3[H]-markiertem Thymidin (ICN, Eschwege)


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gemessen. 16 Stunden bevor die Kultur beendet werden sollte, wurde den Zellen in der 96-Loch Zellkulturplatte, pro Loch 1 µCi 3[H]-Thymidin zugesetzt. Die Zugabe erfolgte steril und die Zellen wurden anschließend im Brutschrank inkubiert. Mit Hilfe des Zellerntegeräts (PHD Cell Harvester, Dunn Labortechnik, Asbach) wurden die Zellen aus ihren Löchern auf Glaswollfilter gebracht. Die Glaswollfilterteile, die einem Loch entsprachen, wurden ausgestanzt, in Szintillationsröhrchen überführt und getrocknet. Anschließend wurde ihnen Szintillationsflüssigkeit zugesetzt und die verursachte Szintillation in einem ß-Counter (LS 1801 Szintillationszähler, Beckmann, München) gemessen. Als Maß für die Proliferation gelten die gezählten Ereignisse pro Minute (cpm). In den Experimenten entspricht dies der Angabe "Thymidin Einbau".

4.5 Enzymimmunoassays (ELISA) zur Bestimmung von löslichen Proteinen im Zellkulturüberstand

Alle Zellkulturüberstände wurden zum (bei den jeweiligen Experimenten) vermerkten Zeitpunkt geerntet, indem die Zellen abzentrifugiert und die Überstände abpipettiert wurden, und bei -80° C gelagert. Sofern nötig, wurden sie mit R10F+ verdünnt, um Absorptionswerte im linearen Bereich der Standardkurve zu erhalten. Die hierfür notwendige Verdünnung wurde austitriert. Die Konzentration des Erst- und Zweitantikörpers sowie der Konzentrationsbereich der Standardreihe waren ebenfalls in Vorexperimenten analog zu Porstmann, T. et al., 1992 austitriert worden. Die Verdünnung der Standardreihe erfolgte in dem Zellkulturmedium, das auch für die Gewinnung der Überstände eingesetzt worden war (R10F+).

4.5.1 Standardprotokoll eines Sandwich-ELISA

Im folgenden wird am Beispiel der Bestimmung von sezerniertem IgG oder IgM ein Standardprotokoll für einen Sandwich-ELISA dargestellt. Anschließend erfolgt eine Auflistung der Abweichungen von diesem Standardprotokoll bei den anderen angewendeten ELISAs. Die Verdünnungen der Erst- und Zweitantikörper wurden für alle ELISAs gemäß Porstmann, T. et al., 1992 austitriert.

Die Bestimmung erfolgte auf 96-Loch Flachbodenplatten mit verstärkter Proteinbindungskapazität (Maxisorp, Nunc, Wiesbaden). Die Erstantikörper, die IgM detektieren, wurden in PBS verdünnt, die Antikörper, die IgG detektieren in NaHCO3-Puffer (0,1 M NaHCO3, pH 8,0) verdünnt und in einem Volumen von 50 µl/Vertiefung auf die Platte pipettiert, die Platten dann mindestens 16 Stunden bei 4° C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Platten dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die freien Bindungsstellen der Platte mit 200 µl Blockade-Puffer (PBS/3% (w/v) BSA) (BSA: Sigma, St. Louis, MS; USA) geblockt, die Platten dafür eine Stunde bei 37° C inkubiert. Die Platten wurden dann zweifach mit Waschpuffer (PBS/0,05% (v/v) Tween 20) (Tween 20: Sigma, St. Louis, MS, USA) gewaschen. 100 µl der Zellkulturüberstände (Proben), einer Standardverdünnungsreihe von hu IgM bzw. IgG sowie Zellkulturmedium (R10F+) als Leerwert wurden als Doppelwerte auf die Platte aufgetragen und 2 Stunden bei 37° C inkubiert. Nach fünf Waschschritten wurden 100 µl des biotinylierten Zweitantikörpers (verdünnt in PBS/5% (v/v) FCS) in jede Vertiefung pipettiert und erneut zwei Stunden bei 37° C inkubiert. Anschließend wurden die Platten sechs Mal gewaschen und 100 µl Streptavidin-Peroxidase (Jackson, West Grove, CA, USA für IL-2 und Ig-ELISAs, Calbiochem, La Jolla, CA, USA für alle anderen ELISAs) (verdünnt in PBS/5% (v/v) FCS) in jedes Loch gegeben.


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Nach einer erneuten Inkubationszeit von 30 Minuten bei 37° C sowie sechs Waschschritten, wurde der ELISA entwickelt. Als Substrat wurde eine TMB-Lösung hergestellt (1 Tablette TMB (Sigma, St. Louis, MS, USA) in 10 ml Substrat-Puffer (0,05 M Phosphat-Citrat Puffer, pH 5,0) gelöst), zu der 2 µl 30% H2O2 gegeben wurden. Das aufgetragene Volumen betrug 100 µl/Vertiefung. Sobald eine deutliche Abstufung in der Farbentwicklung der Standardreihe zu erkennen war, wurde die Reaktion mit 100 µl 1 M H2SO4 beendet und die Absorption im ELISA-Meßgerät (Dynatech Laboratories, Denkendorf) bei 450 nm Wellenlänge (Referenzwellenlänge 630 nm) gemessen. Die Nachweisgrenzen der ELISAs lagen bei: IgG ELISA: <0,3 ng/ml, IgM ELISA: <1,25 ng/ml.

4.5.2 Abweichungen vom Standardprotokoll bei den anderen ELISAs

IL-2 ELISA: Der 1. Antikörper wurde in 100 µl Volumen/Vertiefung aufgebracht, der 2. Antikörper in 50 µl Volumen/Vertiefung. Zweitantikörper und Proben, Standards und Leerwerte (in 50 µl Volumen) wurden zusammen inkubiert. Alle Inkubationsschritte erfolgten bei Raumtemperatur. Der Blockade-Puffer bestand aus PBS/4% BSA (w/v). Die Waschlösung bestand aus 50 mM Tris/0,2% Tween 20 (v/v). Die Nachweisgrenze des ELISAs lag bei <0,625 ng/ml.

IFN-gamma ELISA: Inkubation des 1. Antikörpers: 2 h bei 37° C. Es wurden Rundbodenplatten (Nunc, Wiesbaden) verwendet. Standards, Proben und Leerwert wurden in einem Volumen von 50 µl hinzupipettiert und 16 h bei 4° C inkubiert. Die für den 2. Antikörper vorgesehene Inkubation dauerte 2 h bei Raumtemperatur. Zum Entwickeln wurde die TMB-Lösung (240 mg TMB/ 10 ml DMSO-Ethanol Gemisch, Verhältnis DMSO/Ethanol 1/1) 1/100 in Gallati-Puffer (0,2 M Citratpuffer mit 0,03%H2O2 (v/v), pH 3,95) verdünnt (TMB-Pulver: Fluka, Buchs, Schweiz). Diese Substratlösung wurde auch für den IL-4 und IL-5 ELISA verwandt. Die Nachweisgrenze des ELISAs lag bei <30 pg/ml.

IL-5 ELISA: Inkubation des 2. Antikörpers für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Die Nachweisgrenze des ELISAs lag bei <60 pg/ml.

Für den IL-4, -5 und IFN-gamma ELISA wurden Rund- statt Flachbodenplatten verwendet.

Die Nachweisgrenzen der anderen ELISAs lagen bei: IL-4 ELISA: <16 pg/ml, ATAC ELISA: <1 pg/ml.

4.6 Durchflußzytometrie

Die Durchflußzytometrie wurde benutzt, um die Expression von Oberflächenantigenen auf Zellpopulationen zu untersuchen. Mit Hilfe des Durchflußzytometriegerätes können durch Lichtstreuung Aussagen über Zellgröße und -granularität getroffen werden, sowie durch die von den Fluoreszenzfarbstoffen ausgesendeten Strahlen unterschiedlicher Wellenlänge Aussagen über die Expressionsdichte der analysierten Oberflächenantigene und ihre prozentuale Verteilung innerhalb der untersuchten Zellpo


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pulation gemacht werden. Zu diesem Zweck werden diese Oberflächenantigene durch mAk gebunden. Diese Ak sind entweder direkt mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert (=direkte Durchflußzytometrie/Färbung) oder der Ak, der das untersuchte Ag bindet, wird von einem weiteren Ak erkannt und gebunden. Dieser zweite Ak ist dann derjenige, der fluoreszenzmarkiert ist, so daß er vom Durchflußzytometriegerät detektiert werden kann (=indirekte Durchflußzytometrie/Färbung). Als dritte Möglichkeit bietet sich die Markierung des Oberflächenantigens durch einen biotinylierten spezifischen mAk an, an den in einem Folgeschritt fluoreszenzmarkiertes Streptavidin gebunden wird. Methodisch erfolgte eine Anlehnung an Fleisher, T.A. et al., 1992 und Melamed, M.R. et al., 1990.

4.6.1 Anfärbung der Zellen

Alle Arbeitsschritte erfolgten auf Eis. Die Menge an Erst- und Zweitantikörper bzw. fluoreszenzmarkiertem Streptavidin wurden in Vorexperimenten austitriert. Die Waschschritte erfolgten mit FACSR-PBS (PBS, 2,5% FCS (v/v) und 0,1% (w/v) NaN3). Je nach Experiment wurden in die Vertiefungen einer 96-Loch Rundbodenplatte zwischen 50 000 und 200 000 Zellen pro Loch pipettiert. Der erste Ak wurde in 50 µl Volumen zu den pelletierten Zellen dazupipettiert. Die Zellen wurden 30 Minuten auf Eis inkubiert und dann zweimal gewaschen. Wurden direkt gekoppelte Ak verwendet, war die Färbung dann beendet und die Analyse erfolgte gemäß 4.6.2. Für indirekt gekoppelte Ak wurde anschließend der fluoreszenzmarkierte Zweitantikörper bzw. das fluoreszenzmarkierte Streptavidin in 50 µl Volumen hinzugegeben und die Zellen erneut 30 bzw. 15 Minuten (Streptavidin) inkubiert. Nach zwei weiteren Waschschritten wurden die Zellen gemäß 4.6.2 analysiert.

4.6.2 Analyse der angefärbten Zellen

Die Analyse erfolgte im FACSCaliburR Gerät (Becton Dickinson, San José, CA, USA). Bis unmittelbar vor der Analyse wurden die Zellen auf Eis gehalten. Nach dem letzten Waschschritt wurden die Zellen in 150 µl FACSR-PBS aufgenommen und unmittelbar vor der Analyse mit 150 µl FACSR-sheath Flüssigkeit (0,9% NaCl-Lösung, 0,1% (w/v) NaN3) gemischt oder mit 150 µl FACSR-sheath Flüssigkeit gemischt, die mit 1 µg/ml Propidiumiodid versetzt war. Durch das Propidiumiodid ist es möglich, die Vitalität der Zellen zu beurteilen und somit nur vitale Zellen zu analysieren. Vor der eigentlichen Analyse erfolgte die für die Durchflußzytometrie übliche Einstellung des Geräts unter Eingrenzung der vitalen Lymphozytenpopulation aufgrund ihrer Größe und Granularität und Abgleich der Laserspannung der verwendeten Kanäle. Anschließend erfolgte die Analyse der Proben, wobei mindestens 10 000 Zellen/Probe aufgenommen und für spätere Analysen bezüglich der Dichte und prozentualen Häufigkeit des Oberflächenantigens mit dem CellQuestR-Programm (Becton Dickinson, San José, CA, USA) gespeichert wurden. Für jeden Typ Fluoreszenzfarbstoff wurde zudem als Negativ-Kontrolle eine Probe aufgenommen, die Zellen enthielt, die mit einem Ak angefärbt worden waren, der kein Oberflächenantigen auf der eingesetzten Zellpopulation erkennt, so daß ein Maß für unspezifische Bindung und Eigenfluoreszenz der Zellen vorhanden war.

4.7 Herstellung und Analyse von F(ab)2 Fragmenten

Um eine Bindung von Ak über ihren Fc-Teil zu verhindern, wurden in 5.2.2.4 F(ab)2-Fragmente von Ak verwendet. Die Funktionalität der F(ab)2-Fragmente wurde in der Durchflußzytometrie analysiert.


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Es wurden aufgereinigte mAk, die in PBS gelöst waren, verwendet. Inkubationszeiten, pH-Werte und Konzentrationsverhältnisse wurden Ak-spezifisch vorher austitriert. Dabei wurde im wesentlichen wie in Parham, E.M. et al., 1997 vorgegangen. Die Antikörperlösung wurde mit Hilfe von 1 M Citratpuffer und 1 M HCl auf einen pH von 3,5 oder 4,2 eingestellt. Die Pepsinlösung wurde in 0,1 M Citratpuffer hergestellt, in dem das Pepsin (Sigma, St. Louis, MS, USA) auf 1 mg/ml verdünnt wurde, der pH wurde auf 3,5 eingestellt. Die Pepsinlösung wurde zu der vorbereiteten Antikörperlösung hinzugegeben, das Verhältnis Pepsin-/Antikörperlösung betrug 1/70 (v/v). Die Lösung wurde bei 37° C im Wasserbad inkubiert. Nach Beendigung der Inkubationszeit wurde die Enzymaktivität durch Neutralisation mit 2 M Tris/HCl, pH 8,0 gehemmt. (Verhältnis Tris/HCl-Lösung zu Antikörperlösung 1/7) Der Ak wurde dann zwei Tage gegen PBS dialysiert. Sofern durch die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) zu erkennen war, daß kein vollständiger Ak mehr vorhanden war und nur noch F(ab)2 Fragmente übriggeblieben waren, wurde der dialysierte Ak auf 1 mg/ml eingestellt, sterilfiltriert und bei 4° C gelagert. Die SDS-PAGE erfolgte in 7,5% SDS-Polyacrylamid-Gelen (Ammoniumpersulfat, SDS, TEMED: Biorad, Hercules, CA, USA, Polyacrylamid: Roth, Karlsruhe) im BioRad Mini-ProteanR System (Biorad, Hercules, CA, USA). Es wurden mindestens 1 µg Gesamtprotein/Probe aufgetragen (berechnet durch ursprüngliche Antikörperkonzentration abzüglich der verdauten Fc-Fragmente). Die Elektrophorese erfolgte für 30 Minuten bei 80 V, dann bis zum Ende bei 150 V. Die Färbung der Proteine erfolgte durch Färbung mit Coomassieblau (0,1% Coomassieblau (v/v) in Coomassie-Entfärberlösung: 40% Ethanol, 10% Essigsäure) für 30 Minuten, dann erfolgte eine Entfärbung mit Entfärberlösung.


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