Dittrich, Anna-Maria: Induktionsbedingungen und kostimulatorische Effekte von ICOS - einem neuen T-Zellspezifischen Oberflächenantigen

24

Kapitel 5. Ergebnisse

Alle Versuche wurden, sofern nicht anders angegeben, mindestens drei Mal unabhängig voneinander durchgeführt.

5.1 Untersuchung der Induktionsbedingungen des ICOS Moleküls auf T-Lymphozyten

Um die Parameter näher zu definieren, die für die in vitro Expression von ICOS notwendig sind, wurden Zeitkinetiken durchgeführt. NTZ wurden mit verschiedenen Reagenzien stimuliert und zu den angegebenen Zeiten die Expression des ICOS Moleküls im Vergleich mit bekannten, gut charakterisierten T-Zellaktivierungsantigenen durchflußzytometrisch untersucht.

Die durchgeführten Experimente zeigten deutlich, daß für die Expression von ICOS zwei Signale notwendig sind. Die Stimulation mit PMA allein führte zu einer deutlich verringerten Expression, die mit Ionomycin hob sich kaum noch von der Negativkontrolle ab. Diese Beobachtungen sind in Abb. 1 deutlich zu erkennen. In seiner Zweisignalabhängigkeit ähnelt ICOS also anderen zweisignalabhängigen Molekülen wie in Abb. 2 exemplarisch für CD40L gezeigt. Einsignalabhängige Moleküle, wie hier am Beispiel von CD69 gezeigt, sind wesentlich weniger von der simultanen Wirkung von PMA und Ionomycin abhängig.


25

Abb. 1 Zweisignalabhängigkeit des ICOS Moleküls. Die Zellen wurden mit PMA (33ng/ml), Ionomycin (200ng/ml) oder PMA und Ionomycin in 24-Loch Flachbodenplatten stimuliert, zu den angegebenen Zeiten wurde die Oberflächenexpression von ICOS in der Durchflußzytometrie untersucht. Dargestellt ist die relative Fluoreszenzintensität des ICOS Moleküls (offene Linie) im Vergleich zu einer Isotypkontrolle (schwarz). Auf der X-Achse ist die Fluoreszenzintensität dargestellt, auf der Y-Achse die Zellzahl.

Zusätzlich bestätigen die durch Stimulation mit PMA und Ionomycin erhaltenen Zeitkinetiken (Abb. 2) die Einordnung von ICOS in die Gruppe der frühen Aktivierungsantigene und ermöglichen es, das ICOS Molekül in die gut dokumentierte Expressionreihenfolge der Aktivierungsantigene dieser Gruppe einzuordnen [Graf, D. et al., 1995, Holter, W. et al., 1985, López-Cabrera, M. et al., 1993]: ICOS wird später als das früheste auf der Zelloberfläche exprimierte Aktivierungsantigen CD69 exprimiert. Die Anzahl der ICOS positiven Zellen ist nach 4 h mit 68% der prozentualen Expression von CD40L ähnlich.


26

Abb. 2a Stimulation mit PMA und Ionomycin

Abb. 2b Stimulation mit PMA


27

Abb. 2c Stimulation mit Ionomycin

Abb. 2a, b und c: Vergleich der ICOS Expression mit anderen T-Zellaktivierungsantigenen unter verschiedenen Stimulationsbedingungen. Die Zellen wurden mit PMA (33 ng/ml) und Ionomycin (200 ng/ml) stimuliert, zu den angegebenen Zeiten wurde die Oberflächenexpression von ICOS, CD25, CD40L und CD69 in der Durchflußzytometrie untersucht. Zusätzlich zu den prozentualen Anteilen positiver Zellen an der Gesamtpopulation ist jeweils der mean, d.h. die durchschnittliche Expressionsdichte der Oberflächenantigene angegeben (Zahlen in Klammern).

Allerdings dauert die Expression des ICOS Moleküls deutlich länger an als die von CD40L, dessen Expression nach 12 Stunden bereits wieder herunterreguliert wird. CD25 wird deutlich später als ICOS hochreguliert. Die Herunterregulation des ICOS Moleküls konnte unter diesen Bedingungen nicht gezeigt werden, da selbst nach 96 Stunden noch 90% der Zellen ICOS positiv waren und die Kulturen dann aufgrund des starken Mediumverbrauchs abgebrochen werden mußten. Die Zweisignalabhängigkeit eines Moleküls äußert sich außerdem in der Blockierbarkeit seiner durch PMA und Ionomycin induzierten Expression durch CsA. Auch dieser Umstand konnte für ICOS bestätigt werden. In Abb.3 ist die Expression des ICOS Moleküls, induziert durch PMA/Ionomycin Stimulation, der Expression unter CsA Einfluß gegenübergestellt. Die ICOS Expression ist deutlich herabgesetzt und somit von der Funktion des Calcineurin Moleküls, das in den durch PMA/Ionomycin induzierten Signaltransduktionsweg eingeschaltet ist, abhängig.


28

Abb. 3 Cyclosporin A Sensitivität der ICOS Expression. Die Bezeichnung "8F4" ist der ursprüngliche Name des ICOS Moleküls. Die Zellen wurden mit PMA (33 ng/ml) und Ionomycin (200 ng/ml) (links), bzw. PMA und Ionomycin und CsA (1 µg/ml) (rechts) stimuliert. Die ICOS Expression wurde nach 8 h in der Durchflußzytometrie untersucht. Dargestellt ist die relative Fluoreszenzintensität des ICOS Moleküls (offene Linie) im Vergleich zu einer Isotypkontrolle (schwarz). Auf der X-Achse ist die Fluoreszenzintensität dargestellt, auf der Y-Achse die Zellzahl.

Abb. 4 Expression des ICOS Moleküls im Vergleich mit anderen T-Zellaktivierungsantigenen nach Stimulation mit PHA P. Das PHA P wurde den Zellen unmittelbar zu Beinn der Kultur zugesetzt. Die erforderliche Konzentration war in Vorexperimenten austitriert worden. Zu den angegebenen Zeiten wurden die Zellen angefärbt und die Expression der Oberflächenantigene mittels Durchflußzytometrie untersucht.


29

Abb. 5 Expression des ICOS Moleküls im Vergleich mit anderen T-Zellaktivierungsantigenen nach Stimulation mit anti-CD3 Ak. Die Stimulation erfolgte in 96-Loch Platten, die mit anti-Maus IgG und nachfolgend mit anti-CD3 Ak beschichtet worden waren. Die Konzentration der Antikörper wurden austitriert. In jedes Loch wurden 100 000 Zellen eingebracht. Zu den angegebenen Zeiten wurden die Zellen angefärbt und die Expression der Oberflächenantigene mittels Durchflußzytometrie untersucht.

Auch Stimulationen von NTZ über PHA P bzw. immobilisierte anti-CD3 Ak bestätigten die oben dargelegten Befunde, wenn auch bedingt durch den unterschiedlichen Angriffsort dieser stimulierenden Agenzien charakteristische Unterschiede auftraten. In Abb. 4 ist die Expressionskinetik von ICOS, induziert durch PHA P, der Expression von anderen T-Zellaktivierungsantigenen, induziert durch die gleiche Stimulation, gegenübergestellt. In Abb. 5 sind die Ergebnisse einer Stimulation über immobilisierte anti-CD3 Ak dargestellt.

Auch hier zeigt sich die starke Abhängigkeit der ICOS Expression von zwei Signalen. Sowohl PHA P wie auch der CD3 Ak greifen primär am TZR an, so daß diese Stimulation einer Situation ohne Kostimulation entspricht, wenn auch diese Stimulationsformen sich nicht so genau als „Ein-Signal Situation“ definieren lassen, wie die Stimulation mit PMA oder Ionomycin allein. Die deutlich verzögerte und auch bezüglich der erreichten Dichte verringerte ICOS Expression (Abb. 2c im Vergleich zu Abb. 4 und 5) zeigen jedenfalls, daß diese Stimulationsbedingungen nicht diejenigen intrazellulären Signaltransduktionswege induzieren die für die maximale Expression des Moleküls notwendig sind.

5.2 Kostimulatorische Effekte des ICOS Moleküls

Nachfolgend werden eine Reihe von Ergebnissen vorgestellt, die die kostimulatorische Wirkung des ICOS Moleküls charakterisieren.

5.2.1 Konzentrationsabhängigkeit der kostimulatorischen Wirkung auf die Proliferation

Vorbefunde hatten gezeigt, daß die Kreuzvernetzung des ICOS Moleküls eine kostimulatorische Wirkung auf T-Zellen ausübt. Dieser Effekt sollte in der vorliegenden Arbeit genauer untersucht werden.


30

Eine Zielsetzung war den wirksamen Konzentrationsbereich des mAk F44 festzustellen. Um dies genauer zu untersuchen, wurden CD4+-T Zellen mit einer definierten, in Vorexperimenten austitrierten Menge eines immobilisierten anti-CD3 Ak stimuliert, der in dieser Konzentration alleine keine Proliferation induzieren konnte. Zusätzlich wurden die Zellen durch unterschiedliche Konzentrationen des immobilisierten mAk F44 stimuliert. Am dritten Tag der Kultur wurde die Proliferation der Zellen durch 3[H] Thymidin Einbau (wie in 4.4 beschrieben) gemessen.

Abb. 6 Konzentrationsabhängigkeit der kostimulatorischen Wirkung des ICOS Moleküls. CD4+-Zellen wurden durch immobilisierte anti-CD3 Ak und den mAk F44 in 96-Loch Platten stimuliert. In jedem Loch befanden sich 100 000 Zellen. An d 2 wurde den Zellen 1 µCi 3[H]-Thymidin zugesetzt. Nach einer 16 h Inkubation wurde die Proliferation der Zellen im Szintillationszähler gemessen. Die Werte stellen Vierfachwerte eines repräsentativen Experiments dar (n=3).

Wie in Abb. 6 zu sehen ist, ermöglichte die verwendete Konzentration des anti-CD3 Ak alleine keine Proliferation der T-Zellen. Die deutlich konzentrationsabhängige Wirkung der zusätzlichen Kostimulation über den mAk F44 ist der Abb. 6 ebenfalls zu entnehmen. Bei den fünf durchgeführten Experimenten war die notwendige Mindestkonzentration des mAk F44, die zu einem Proliferationsanstieg führte, unterschiedlich (zwischen 0,0625 µg/ml und 1 µg/ml). Auch die Konzentration, ab der ein Maximum an Proliferation zu verzeichnen war, schwankte. Die Konzentrationsabhängigkeit, die sich im Kurvenverlauf widerspiegelt, war jedoch in allen Experimenten gleich, so daß diese Schwankungen wohl am ehesten darauf zurückzuführen waren, daß die Stimulierbarkeit der Zellen eine gewisse Spenderabhängigkeit zeigt.

Durch die hier gezeigte Wirkung auf die Proliferation ergeben sich verschiedene Fragen: zunächst die Frage, welche anderen Parameter u.U. durch diese kostimulatorische Wirkung des mAk F44 reguliert werden können, was in den in 5.2.2 dargestellten Experimenten untersucht wird. Zweitens stellt sich die Frage, welche Faktoren an der Heraufregulation der Proliferation beteiligt sind. Dieser Frage wird insbesondere in 5.2.2.2.1 und in 5.2.2.2 im Allgemeinen nachgegangen.


31

5.2.2 Wirkung der Kostimulation durch das ICOS Molekül auf andere T-Zellaktivierungsparameter

Um die Auswirkungen einer kostimulatorischen Aktion des ICOS Moleküls näher zu untersuchen, wurden verschiedene Parameter im Hinblick darauf untersucht, ob sich ihre Ausprägung durch Kostimulation via ICOS verändert. Die ausgewählten Parameter spielen eine bedeutende Rolle bei der Funktion einer T-Effektorzelle und ermöglichen somit vorsichtige Rückschlüsse auf die Rolle des ICOS Moleküls bei einer Immunantwort in vivo. Als Primärstimulus, der die Parameter alleine nicht oder nur suboptimal induzieren kann, der für die Induktion der Parameter durch Kostimulation aber notwendig ist, wurden in den folgenden Experimenten immobilisierte anti-CD3 Ak benutzt (s. 4.3.1.3). Als kostimulatorisches Signal diente die Kreuzvernetzung des ICOS Moleküls und in einigen Experimenten auch des CD28 Moleküls über spezifische mAk. Zum Vergleich wurde eine Situation ohne Kostimulus hergestellt, in der neben dem anti-CD3 Ak ein unspezifischer mAk immobilisiert wurde, um auszuschließen, daß die gemessenen Effekte auf der unspezifischen Adhäsion an einen Antikörper zustande kommen.

5.2.2.1 Wirkung auf die Expression anderer Oberflächenaktivierungsantigene am Beispiel von CD25 und CD40L

Die Neuexpression zahlreicher Oberflächenantigene, sogenannter Aktivierungsantigene, ist, abgesehen von intrazellulären Veränderungen, die früheste meßbare Veränderung im Rahmen einer T-Zellaktivierung und somit einer T-Zellabhängigen Immunantwort. Die zeitlich streng kontrollierte Expression ganz bestimmter Moleküle (z.B. auch des ICOS Moleküls selbst) ermöglicht es der T-Zelle, ihre Aufgaben im Rahmen der Immunantwort wahrzunehmen. Um zu untersuchen, inwiefern eine Kostimulation über das ICOS Molekül zur Induktion/Heraufregulation der für die T-Zellfunktion wichtigen Aktivierungsantigene führt, wurde dies exemplarisch an den zwei T-Zellaktivierungsmolekülen CD25 und CD154 (CD40L, TRAP) analysiert. Beide Moleküle spielen eine wichtige Rolle in der T-Zellimmunantwort. CD25, als hochaffiner Rezeptor für den T-Zellwachstumsfaktor IL-2, versetzt die T-Zellen in die Lage auf diesen Wachstumsfaktor zu reagieren, wodurch sich die Zahl der T-Zellen, die sich an einer Immunantwort beteiligen können, drastisch erhöht [Schwartz, R.H., 1990]. Das Molekül CD40L ist essentiell an der Interaktion von T- und B-Zellen beteiligt, die letztlich zu einer humoralen Immunantwort führt. Ohne die Interaktion zwischen CD40L und CD40, sezernieren die B-Zellen deutlich weniger IgG und IgM [Banchereau, J. et al., 1994].


32

Abb. 7 Kostimulatorischer Effekt des ICOS Moleküls auf die Expression von CD25.

Abb. 8 Kostimulatorischer Effekt des ICOS Moleküls auf die Expression von CD40L.

100 000 CD4+-Zellen wurden in Löchern einer 96-Loch Platte mit immobilisiertem anti-CD3 Ak und mAk F44 oder einer Isotypkontrolle stimuliert. Nach 24 h wurde die CD40L Expression der Zellen mittels Durchflußzytometrie untersucht (n=4).

100 000 CD4+-Zellen wurden in Löchern einer 96-Loch Platte mit immobilisiertem anti-CD3 Ak und mAk F44 oder einer Isotypkontrolle stimuliert. Nach 24 h wurde die CD25 Expression der Zellen mittels Durchflußzytometrie untersucht (n=4).


33

Für die Analyse wurden CD4+-Zellen durch anti-CD3 Ak und den mAk F44 oder eine Isotypkontrolle stimuliert und mittels Durchflußzytometrie nach 12 Stunden ihre CD40L und CD25 Expression untersucht. Wie in Abb. 7 und 8 zu sehen ist, reguliert das ICOS Molekül die Expression beider Moleküle herauf. In dem Bereich der anti-CD3 Ak Verdünnung, in dem die Stimulation über das CD3 Molekül alleine nur noch einen geringen Anteil der Zellen stimuliert, CD40L oder CD25 zu exprimieren, wird durch die Kostimulation über das ICOS Molekül die Expression beider Moleküle signifikant heraufreguliert. Dies trifft nicht nur für den Anteil positiver Zellen zu, sondern auch für die Dichte der Expression, was nicht dargestellt ist. Die beiden Säulen in Abb. 7 und 8 für die 1/5000 Verdünnung zeigen diesen Effekt deutlich. Der Effekt durch Kreuzvernetzung des ICOS Moleküls beträgt für CD25 ca. Faktor 2, Faktor 5 für CD40L.

Wurden die Zellen durch hohe Konzentrationen von anti-CD3 Antikörpern stimuliert, so war alleine durch die Stimulation über das CD3 Molekül die Expression von CD25 oder CD40L hoch, zusätzliche Ligation des ICOS Moleküls verstärkte diese Expression aber noch (Abb.8 und 9, anti-CD3 Verdünnung 1/500). Dies ist am ehesten darauf zurückzuführen, daß die durch anti-CD3 Ligation erzielte Expression bereits die maximal mögliche Expression induzierte. Dafür spricht auch, daß die erzielbare Höchstexpression der Oberflächenmoleküle beinahe identisch ist, wenn die Zellen mit anti-CD3 Ak, Verdünnung 1/5000, und mAk F44 stimuliert wurden oder eine maximale anti-CD3 Ak Konzentration (1/500) verwendet wurde. Die Verstärkung der Expression der beiden Moleküle auf eine signifikante Expressionsstärke scheint v.a. im Hinblick auf die in vivo Situation wichtig zu sein, in der die Stärke des 1. Signal durch geringe Mengen an Antigen limitiert ist, so daß die hierdurch erzielbare Expression von Aktivierungsantigenen nicht ausreichen würde, um eine effektive T Zellantwort zu ermöglichen. Erst durch die Kostimulation über das ICOS Molekül, als zweites oder kostimulatorisches Signal würde dann eine T-Zelleffektorantwort möglich. Die Experimente zeigen aber auch, daß die Stimulation der T Zellen über das 1. Signal zumindest einer bestimmten Stärke bedarf, damit die Zellen überhaupt auf eine zusätzliche Stimulation durch Kreuzvernetzung von ICOS reagieren können. Sehr niedrige anti-CD3 Ak Konzentrationen (ab einer 1/40 000 Verdünnung) ermöglichen keine Induktion/Heraufregulation der Oberflächenaktivierungsantigene CD25 oder CD40L mehr. Dies ist sicherlich darauf zurückzuführen, daß es zur Induktion des ICOS Moleküls selber einer bestimmten Stimulation bedarf. Die maximale ICOS Expression beträgt zu diesem Zeitpunkt (12 h Stimulation) etwa 20% (induziert durch eine 1/1000 Verdünnung des Anti-CD3 Ak) und ist deutlich abhängig von der Konzentration an eingesetztem anti-CD3 Ak (nicht gezeigt). Nur wenn das ICOS Molekül selbst in einer ausreichenden Dichte exprimiert wird, kann die Kreuzvernetzung über den F44 Antikörper zu den- bis jetzt noch nicht analysierten- intrazellulären Signalen führen, die eine Expression von anderen Aktivierungsantigenen verstärken.

5.2.2.2 Wirkung der Kostimulation durch das ICOS Molekül auf die Zytokinsekretion

Um genauer zu untersuchen, welche Ursachen und Wirkungsmechanismen der kostimulatorischen Funktion von ICOS - die sich auf die Proliferation, die Heraufregulation von CD25 und CD40L und die Immunglobulinsynthese auswirkt - zugrunde liegen, wurden Kostimulationsexperimente mit CD4+-T Zellen durchgeführt; nach Stimulation über 24 bzw. 48 Stunden, wurden die erzeugten Überstände abgenommen und mit IL-2, -4, -5 und IFN-gamma spezifischen ELISAs analysiert.


34

Die Kostimulation über das CD28 Molekül wurde als Vergleich zur ICOS Kostimulation mitgeführt, da CD28 das am genauesten untersuchte kostimulatorische Molekül darstellt.

Stellvertretend für jeweils drei durchgeführte Experimente stehen Abb. 9 bis 13. Dabei ist v.a. zu konstatieren, daß sich die Kostimulation über das ICOS Molekül sehr unterschiedlich auf die Sekretion der analysierten Zytokine auswirkt.

5.2.2.2.1 Auswirkungen auf die IL-2 Sekretion

Die kostimulatorische Wirkung des ICOS Moleküls auf die Sekretion von IL-2 war marginal und ließ sich auch durch eine längere Inkubation (48 Stunden) nicht steigern (Abb. 9). In allen drei Experimenten lagen die Werte direkt oberhalb oder unterhalb der Nachweisgrenze (durch Stimulation mit anti-CD3 Ak ohne Kostimulation ließ sich nie eine IL-2 Sekretion nachweisen). Dies überraschte, da hier also deutliche Unterschiede zur Kostimulation via CD28 auftraten. CD28 induzierte - in Übereinstimmung mit zahlreichen Publikationen, z.B. Thompson, C.B. et al., 1989 - eine starke IL-2 Sekretion. Dieser Unterschied ließ sich nicht durch die mangelhafte Expression des ICOS Moleküls erklären, da die in diesen Experimenten verwendete anti-CD3 Ak Konzentration in einem Bereich lag, in dem die Höhe und Dichte der ICOS Expression ein Maximum erreichte (In Vorexperimenten austitriert, nicht gezeigt). Auch wurden als Kontrolle parallel Proliferationsassays durchgeführt (nicht gezeigt), um auszuschließen, daß sich die Zellpopulationen nicht stimulieren ließen.

Abb. 9 Auswirkungen der Kostimulation via ICOS und CD28 auf die IL-2 Sekretion.

100 000 CD4+-Zellen wurden in 96-Loch Platten mit immobilisiertem anti-CD3 Ak und mAk F44 oder mAk 9.3 oder einer Isotypkontrolle stimuliert. Die Überstände wurden zu den angegebenen Zeiten abgenommen und mit einem IL-2 spezifischen ELISA analysiert. Die Werte stellen Mittelwerte aus Dreifachwerten dar, die aus einem repräsentativen Experiment stammen (n=3). Die Stimulation mit anti-CD3 Ak und Isotyp oder mAk F44 induzierte keine IL-2 Sekretion.

Die Proliferation zeigte sich im Bereich der geringen anti-CD3 Ak Konzentration deutlich abhängig von


35

der Kostimulation via ICOS oder CD28,eine kostimulatorische Wirkung auf die Zellen war also vorhanden. Somit bleibt festzustellen, daß bezüglich der Induktion der IL-2 Sekretion ein deutlicher Unterschied zwischen ICOS und CD28 besteht.

5.2.2.2.2 Auswirkungen auf die IL-4 Sekretion

Die Sekretion von IL-4 dagegen ist durch ICOS deutlich induzierbar; die Stimulation nur mit anti-CD3 Antikörper induziert keine IL-4 Sekretion (Abb. 10). Die kostimulatorische Wirkung des ICOS Moleküls läßt sich durch eine längere Inkubationszeit auf etwa das Vierfache steigern (68 pg/ml nach 24 h, 252 pg/ml nach 48 h). Dies ist insofern erwähnenswert, als die Expression des ICOS Moleküls durch Stimulation mit anti-CD3 Ak nach 24 Stunden noch nicht ihren Maximalwert erreicht hat (s. 5.1, Abb. 5). Möglicherweise ist diese Vervierfachung also nicht nur auf die Akkumulation des Zytokins im Überstand durch die zusätzlichen 24 h Kultur zurückzuführen. Vielmehr könnte der Grund für die Vervierfachung darin liegen, daß eine gesteigerte Expression von ICOS während der zusätzlichen 24 h Kultur zu einer verstärkten Kreuzvernetzung von ICOS führen kann. Die verstärkte Kreuzvernetzung des ICOS Moleküls könnte sich dann direkt auf die Induktion von IL-4 auswirkt.

Abb. 10 Auswirkungen der Kostimulation via ICOS und CD28 auf die IL-4 Sekretion.

100 000 CD4+-Zellen wurden in 96-Loch Platten mit immobilisierten anti-CD3 Ak und mAk F44 oder mAk 9.3 oder einer Isotypkontrolle stimuliert. Die Überstände wurden zu den angegebenen Zeiten abgenommen und mit einem IL-4 spezifischen ELISA analysiert. Die Werte stellen Mittelwerte von Doppelwerten dar, die aus einem repräsentativen Experiment stammen (n=3). Die Stimulation mit anti-CD3 Ak und Isotyp induzierte keine IL-4 Sekretion.

Auch durch Kostimulation via CD28 läßt sich die Sekretion von IL-4 induzieren. Die gemessenen Werte sind nach 48 h etwa zwei bis zweieinhalbfach so hoch, wie die Werte, die durch eine Kostimulation via ICOS entstehen. Die Stärke der kostimulatorischen Wirkung von CD28 ist also unter den dargestellten Bedingungen beträchtlich größer. Auch sie ist kulturdauerabhängig, wobei hier die Ursache wohl eher in der Akkumulation des Zytokins zu sehen ist, da die Expression des CD28 Moleküls


36

durch anti-CD3 Stimulation nicht neu induziert wird.

5.2.2.2.3 Auswirkungen auf die IL-5 Sekretion

Die Sekretion von IL-5 nach 24 Stunden ließ sich weder durch Stimulation via anti-CD3 Ak noch durch zusätzliche Kostimulation via mAk F44 induzieren (Abb. 11). Lediglich durch Kostimulation via CD28 ließ sich eine meßbare Menge IL-5 nachweisen. Dieses Bild änderte sich jedoch durch eine längere Kulturperiode. Nach 48 Stunden ließ sich durch Stimulation mit anti-CD3 Ak eine Sekretion von 142 pg/ml induzieren. Durch zusätzlich Kostimulation via ICOS wird diese Menge ungefähr um das Fünffache gesteigert (672 pg/ml), die Kostimulation via CD28 führt zu einer Steigerung um das etwa Zehnfache (1510 pg/ml).

Möglicherweise wird für die Induktion der IL-5 Sekretion eine höhere ICOS Expression benötigt, als für die Induktion der IL-4 Sekretion. Auffällig ist außerdem, daß die längere Inkubation in den mit CD28 kostimulierten Kulturen zu einer Steigerung der IL-5 Menge um den Faktor 10 führt, so daß konstatiert werden kann, daß die Sekretion von IL-5, stärker als die von IL-4, abhängig von der in der Kultur erfolgten Kumulation zu sein scheint.

Abb. 11 Auswirkungen der Kostimulation via ICOS und CD28 auf die IL-5 Sekretion.

100 000 CD4+-Zellen wurden in 96-Loch Platten mit immobilisierten anti-CD3 Ak und mAk F44 oder mAk 9.3 oder einer Isotypkontrolle stimuliert. Die Überstände wurden zu den angegebenen Zeiten abgenommen und mit einem IL-5 spezifischen ELISA analysiert. Die Werte stellen Mittelwerte von Doppelwerten dar, die aus einem repräsentativen Experiment stammen (n=3). Die Stimulation via anti-CD3 Ak und Isotypkontrolle oder mAk F44 induzierte nach 24h keine IL-5 Sekretion.

5.2.2.2.4 Auswirkungen auf die IFN-gamma Sekretion

Bezüglich der IFN-gamma Sekretion ist zu bemerken, daß IFN-gamma bereits durch Stimulation über den anti-CD3 Ak induziert werden konnte und unter diesen Bedingungen die Menge des sezernierten IFN-gamma durch längere Inkubation gesteigert wurde (Abb. 12). Eine zusätzliche Kostimulation über den mAk F44


37

steigert die derart erzielten Konzentrationen jedoch noch einmal deutlich. Betrug die Sekretion von IFN-gamma im dargestellten Experiment durch Stimulation mit anti-CD3 Ak (und Isotypkontrolle) 288 pg/ml nach 24 h und 1283 pg/ml nach 48 h, so ließ sie sich durch Kostimulation via ICOS auf das Drei bis Vierfache steigern (24 h: 923 pg/ml, 48 h: 5052 pg/ml). Die kostimulatorische Wirkung des ICOS Moleküls ist also erneut abhängig von der Inkubationsdauer. Das gleiche gilt für die Kostimulation via anti-CD3 Ak und Isotypkontrolle, wie auch via anti-CD3 und anti-CD28 Ak, wenn auch die erzielte Steigerung hier nicht so stark ist (Steigerung ungefähr um das Zweieinhalbfache für die Kostimulation via CD28). Möglicherweise ist die Erhöhung, die durch Kumulation erreichbar ist, in diesem Fall wiederum geringer als die gesteigerte Sekretion, die durch verstärkte Expression und Kreuzvernetzung des ICOS Moleküls entsteht. Bezüglich des ICOS/CD28 Vergleichs zeigt sich für IFN-gamma, daß die Kostimulation via CD28 nach 24 Stunden zu etwa dreifach höheren Mengen von sezerniertem Zytokin führt, als durch Kostimulation mit ICOS (2477 pg/ml IFN-gamma Sekretion via anti-CD28 Ak zu 923 pg/ml IFN-gamma Sekretion via anti-ICOS Ak). Werden die Zellen jedoch länger stimuliert, ist dieser Faktor nur noch marginal (6151 pg/ml IFN-gamma via CD28 Ak im Vergleich zu 5052 pg/ml via anti-ICOS Ak). Dies spricht dafür, daß die kostimulatorische Wirkung von ICOS auf die IFN-gamma Sekretion genauso stark ist wie die Wirkung von CD28; die nach 24 Stunden noch deutlich geringere Sekretion kann auf die zu diesem Zeitpunkt noch schwache Expression von ICOS zurückgeführt werden.

Abb. 12 Auswirkungen der Kostimulation via ICOS und CD28 auf die IFN-gamma Sekretion.

100 000 CD4+-Zellen wurden in 96-Loch Platten mit immobilisierten anti-CD3 Ak und mAk F44 oder mAk 9.3 oder einer Isotypkontrolle stimuliert. Die Überstände wurden zu den angegebenen Zeiten abgenommen und mit einem IFN-gamma spezifischen ELISA analysiert. Die Werte stellen Mittelwerte von Doppelwerten dar, die aus einem repräsentativen Experiment stammen (n=3).

5.2.2.2.5 Auswirkungen auf die ATAC Sekretion

Das ATAC Molekül stellt ein Molekül aus der Familie der Chemokine dar, das hauptsächlich von


38

CD8+-Zellen sezerniert wird. [Müller, S. et al., 1995] Das ICOS Molekül wird auch auf CD8+-Zellen durch Aktivierung induziert, wenn auch mit langsamerer Kinetik als bei CD4+-Zellen (nicht gezeigt). Es bestand also die interessante Möglichkeit mit ähnlich angelegten Versuchen, wie den bereits dargestellten, zu untersuchen, ob die Kostimulation über das ICOS Molekül auch bei CD8+-Zellen die Zytokinsekretion verstärkt und somit zu ähnlichen Ergebnissen führt, wie bei den CD4+-Zellen. Im Unterschied zu den Versuchen, die in 5.2.2.1 bis 5.2.2.4 beschrieben wurden, wurde hier über einen aufgereinigten anti-CD3 Ak (OKT3) stimuliert, dessen Konzentration die maximal auf den Zellkulturplatten immobilisierbare Menge betrug. Die Abnahme der Überstände erfolgte zu drei Zeitpunkten (27, 51 und 75 h), da unklar war, inwiefern sich die langsamere Kinetik der Induktion des ICOS Moleküls auf CD8+-Zellen auf dessen kostimulatorische Wirkung auswirken würde. Auch hier wurde ein Vergleich zu CD28 gezogen.

Abb. 13 Auswirkungen der Kostimulation via ICOS und CD28 auf die ATAC Sekretion.

100 000 CD8+-Zellen wurden in 96-Loch Platten mit immobilisierten anti-CD3 Ak und mAk F44 oder mAk 9.3 oder einer Isotypkontrolle stimuliert. Die Überstände wurden zu den angegebenen Zeiten abgenommen und mit einem ATAC spezifischen ELISA analysiert. Die Werte stellen Mittelwerte von Doppelwerten dar, die aus einem repräsentativen Experiment stammen (n=2).

In Abb. 13 ist das Ergebnis eines Experiments zu sehen (es wurden zwei Experimente durchgeführt). Dargestellt sind die Ergebnisse des 51 und des 75 h Wertes. Die nach 27 h sezernierte Menge war unter allen Stimulationsbedingungen zu gering, um sie zu analysieren. Auffällig ist, daß die Wirkung des ICOS Moleküls hier durchaus auch quantitativ mit der Wirkung des CD28 Moleküls zu vergleichen ist. Der Faktor der Verstärkung der ATAC Sekretion, der durch die Kostimulation erzielt wurde, beträgt 3 bzw. 2 für die Kostimulation via ICOS bzw. CD28 zum 75 h Zeitpunkt. Zum 51 h Zeitpunkt ist die durch die Kostimulation erzielte Verstärkung der Sekretion höher (Faktor 7 b.z.w. 8 für Kostimulation via ICOS b.z.w. CD28) allerdings ist das Maximum der Kostimulation durch ICOS zu diesem früheren Zeitpunkt noch nicht erreicht (51 h: 80 ng/ml, 75 h: 87 ng/ml) und es ist nicht ausgeschlossen,


39

daß eine noch längere Stimulation, den durch ICOS Kostimulation erzielbaren Absolutwert noch steigen läßt. Dies ist v.a. deshalb erwähnenswert, weil zu diesem Zeitpunkt die maximale ICOS Expression der CD8+-Zellen bei weitem noch nicht erreicht ist.

Insgesamt ist also die kostimulatorische Wirkung des ICOS Moleküls auf die Sekretion der verschiedenen Zytokine sehr heterogen. Sie reicht von der Unfähigkeit, eine signifikante Menge zu induzieren (IL-2) über die deutlich verzögerte Wirkung im Vergleich zur Kostimulation via CD28 (IL-5) bis hin zu Werten, die kaum (IFN-gamma) bzw. sogar geringfügig höher (ATAC) sind als die Werte, die durch CD28 Kostimulation erzielt werden. Als weiterer wichtiger Befund ist herauszustellen, daß das durch das ICOS Molekül induzierte Zytokinmuster nicht dem durch CD28 gleicht, hier also deutliche Unterschiede bezüglich der kostimulatorischen Effekte der beiden Moleküle bestehen.

5.2.2.3 Wirkung der Kostimulation durch das ICOS Molekül auf die durch T-Zellen induzierte Immunglobulin Sekretion von B-Zellen

Immunhistochemische Untersuchungen von primär (Thymus) und sekundär lymphatischem Gewebe haben gezeigt, daß die Expression des ICOS Moleküls relativ streng auf die Helle Zone des Keimzentrums des Lymphfollikels im sekundär lymphatischen Gewebe beschränkt ist. Die B-Zellen in diesem Bereich sind durch vorherige klonale Expansion in der dunklen Zone des Keimzentrums stark expandiert worden. Außerdem hat eine somatische Hypermutation der hypervariablen Bereiche der Immunglobuline stattgefunden. In der hellen Zone finden dann folgende Prozesse statt: a) Selektion der B Zellen, deren Ak die höchste Affinität für das, die Immunantwort auslösende, Antigen zeigen und b) möglicherweise der Immunglobulinklassenwechsel. Auch wird angenommen, daß in der hellen Zone ein Signal gegeben wird, daß die Differenzierungsrichtung der B-Zelle in Richtung Plasmazelle oder B-Gedächtniszelle reguliert [Liu, Y.-J. and Arpin, C., 1997 MacLennan, I.C.M. et al., 1994].

Es wurde ein Kokultursystem etabliert, um zu untersuchen inwiefern sich die Kostimulation via ICOS, auf die Fähigkeit der T-Zellen B-Zellhilfe zu leisten, auswirkt. In diesem System werden T-Zellen über immobilisierte anti-CD3 Ak stimuliert, wobei sich durch zusätzliche Immobilisierung von kostimulatorischen Antikörpern bzw. unspezifischen Isotypkontrollen, die Funktion dieser kostimulatorischen Ak untersuchen läßt. Diese stimulierten T-Zellen sind in der Lage, B-Zellen zur Immunglobulinsekretion anzuregen [Lipsky, P.E., 1990], deren Menge durch ELISAs bestimmt werden kann. Die Wirkung von CD28 als kostimulatorisches Molekül ist in diesem System umfangreich untersucht worden [De Boer, M. et al., 1993, Klaus, S.J. et al., 1994, Kwekkeboom, J. et al., 1994], weshalb es sich anbot, die kostimulatorische Wirkung von CD28 mit der von ICOS zu vergleichen.

In Abb. 14a und b wurden CD4+-Zellen mit tonsillären B-Zellen koinkubiert und die Überstände nach 8 Tagen Kultur abgenommen, bei -80° C gefroren, gelagert und dann durch einen für IgG bzw. IgM spezifischen ELISA untersucht.

Es zeigt sich deutlich, daß für die Induktion der Sekretion von IgM, wie auch IgG unter den angegebenen anti-CD3 Ak Konzentrationen die zusätzliche Kreuzvernetzung eines kostimulatorischen Moleküls, wie ICOS oder CD28, notwendig ist. Die Stimulation über den anti-CD3 Ak mit der Isotypkontrolle ermöglichte kaum eine Immunglobulinsekretion, die gemessenen Werte lagen regelmäßig unterhalb


40

oder knapp oberhalb der Nachweisgrenze des ELISAs. Weiterhin wurde deutlich, daß auch hier eine ausreichende ICOS Expression (wie in 5.2.2.1) Voraussetzung für eine kostimulatorische Wirkung des ICOS Antigens ist.: Analog zu den Experimenten, die durch Abb. 7 und 8 dargestellt werden, nahm auch bei diesen Experimenten bei niedrigeren Verdünnungen des anti-CD3 Antikörpers die kostimulatorische Wirkung durch ICOS ab. Die kostimulatorische Wirkung des CD28 Moleküls, welches konstitutiv auch auf ruhenden T-Zellen exprimiert wird, wurde dagegen durch niedrigere anti-CD3 Ak Konzentrationen wenig bis gar nicht beeinflußt (exemplarisch in Abb. 14 dargestellt für die 1/10 000 Verdünnung des anti-CD3 Antikörpers im Vergleich zur 1/5000 Verdünnung). Im Unterschied zur Beeinflussung der Expression der Moleküle CD25 und CD40L wurde die Immunglobulinsekretion im Bereich höherer anti-CD3 Ak Konzentrationen durch kostimulatorische Wirkungen von ICOS oder CD28 nicht verstärkt (nicht gezeigt).

Abb. 14a Auswirkungen auf die IgM Sekretion


41

Abb. 14b Auswirkungen auf die IgG Sekretion

Abb. 14a und b Kostimulatorische Wirkung des ICOS Moleküls auf die Immunglobulinsekretion. Jeweils 50 000 CD4+-Zellen und 25 000 B-Zellen pro Loch wurden zusammen in 96-Loch Platten kultiviert. Die Platten waren zuvor mit anti-CD 3 Ak und mAk F44 oder mAk 9.3 oder einer Isotypkontrolle beschichtet worden. Die Überstände der Kulturen wurden nach 8 Tagen abgenommen und mittels eines IgM bzw. IgG spezifischen ELISAs analysiert. Die Werte stellen Mittelwerte von Versuchsvierfachwerten eines repräsentativen Experiments dar (n=5). Die nur mit anti-CD3 Ak und Isotypkontrolle stimulierten Zellen regten keine Immunglobulinsekretion an.

Ähnlich wie für 5.2.2.1 ist zu konstatieren, daß die Signifikanz dieser Beobachtungen wohl v.a. in der möglichen Rolle in vivo zu sehen ist. In vivo, wo geringe Ag Konzentrationen vorliegen, könnte die T-Zellinduzierte Immunglobulinsekretion durch B-Zellen vollständig von der Wirkung kostimulatorischer

Moleküle abhängig sein, so daß ohne ICOS (oder CD28) keine Immunglobulinsynthese stattfinden könnte.

5.2.2.4 Blockade der Interaktion des ICOS Moleküls mit seinem potentiellen Liganden

Die oben dargestellten Befunde zeigen deutlich, daß das ICOS Molekül mindestens eine indirekte Rolle bei der T-Zellvermittelten Immunglobulinsekretion durch B-Zellen spielt. Es erschien allerdings auch möglich, daß die direkte Interaktion von ICOS mit seinem potentiellen Liganden auf B-Zellen zur Immunglobulinsekretion durch B-Zellen beiträgt. Daher wurde untersucht, ob eine Blockade dieser Interaktion ebenfalls Effekte zeigt. Dabei wurde die Immunglobulinsynthese der tonsillären B-Zellen durch NTZ des peripheren Bluts initiiert, die ihrerseits durch PHA P aktiviert worden waren. Dieses Modell entspricht dem von Lagresle, C. et al., 1995 verwendeten.


42

Abb. 15 Blockade der Interaktion des ICOS Moleküls mit seinem potentiellen Liganden durch F(ab)2 Fragmente. Die Kultur erfolgte in 96-Loch Platten, wobei sich in jedem Loch 50 000 CD4+-Zellen und 50 000 B-Zellen befanden. Die Zellen wurden unmittelbar vor Beginn der Kultur zusammengefügt und das PHA P zugesetzt. (Konzentration in Vorexperimenten austitriert). Die Überstände dieser Kulturen wurden nach 12 Tagen mit einem IgG bzw. IgM spezifischen ELISA analysiert. Unstimulierte B-Zellen produzierten keine Immunglobuline. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment (n=3).

Zur Blockade der ICOS Interaktion wurden F(ab)2 Fragmente des mAk F44 verwendet, da es sich gezeigt hatte, daß die Immobilisierung der vollständigen F44 Ak über die Fc-Rezeptoren der B-Zellen zu einer Kostimulation der T-Zellen führt. Die Verwendung vollständiger Ak hätte dazu geführt, daß es unmöglich geworden wäre zwischen den über Kostimulation vermittelten Effekten und denen, die durch eine Interaktionsblockade vermittelt wurden, zu unterscheiden. Als positive Kontrolle für die Blockierbarkeit des Systems wurde ein CD40 Ak verwendet (als ganzer Ak, da durch ihn keine kostimulatorische Wirkung verzeichnet werden konnte). Für die Blockade der CD40/CD40L Interaktion ist sowohl in vitro wie auch in vivo gezeigt worden, daß sie zu einer reduzierten Immunglobulinsekretion und einem reduzierten Immunglobulinklassenwechsel führt [Kwekkeboom, J. et al., 1994, Nishioka, Y. et al., 1994, Oxenius, A. et al., 1996]. Diese Wirkung sollte mit einer potentiell ähnlichen Wirkung des ICOS Moleküls verglichen werden, weshalb die Überstände der Kulturen nach 12 Tagen abgenommen wurden und in IgM und IgG spezifischen ELISAs untersucht wurden.

In Abb. 15 ist deutlich zu sehen, daß die Blockade der CD40/CD40L Interaktion zu einer stark reduzierten IgG und IgM Sekretion führt. Für die Blockade der ICOS Interaktion traf dies allerdings nicht zu. In keinem der durchgeführten Experimente konnte eine Veränderung der sezernierten Immunglobulinmenge (weder IgG noch IgM) durch Blockade der Interaktion von ICOS und einem potentiellen Liganden auf B-Zellen nachgewiesen werden.


43

5.2.3 Kostimulation durch das ICOS Molekül bei Initialstimulation über lösliche Stimuli

Im folgend beschriebenen Experiment wurde der Wirkungsmechanismus der Kostimulation via ICOS näher untersucht. Die in 5.2.1 und 5.2.2.1 bis 5.2.2.3 dargestellten Ergebnisse beziehen sich alle auf eine Kostimulation via den mAk F44 mit einer Kreuzvernetzung des CD3 Moleküls als erstem Stimulus. Dabei bestehen grundsätzlich verschiedene Wirkungsmöglichkeiten eines derart definierten kostimulatorischen Moleküls [Schwartz, R.H., 1990]: Entweder werden die Zellen über das ICOS Molekül in einen verstärkten Kontakt mit dem anti-CD3 Ak gebracht, so daß dessen Wirkung verstärkt wird. Oder die kostimulatorische Wirkung von ICOS funktioniert unabhängig vom verwendeten 1.Stimulus, so daß angenommen werden kann, daß die Kreuzvernetzung des Moleküls einen spezifischen, intrinsischen Signaltransduktionsprozeß initiiert, bzw. in den intrazellulären Signaltransduktionsweg eingreift, der durch Ligation den 1. Stimulus induziert wurde.

Auch bezüglich dieser Fragestellung wurde ein Vergleich mit CD28 als kostimulatorischem Molekül durchgeführt, da dessen Wirkung in diesem System bereits beschrieben ist und somit einen guten Vergleich bezüglich der erzielbaren Ergebnisse darstellt [Baroja, M.L. et al., 1989, Thompson, C.B. et al., 1989].

Um dieser Fragestellung nachzugehen, wurden NTZ mit löslichen Faktoren stimuliert, so daß der sogenannte „tethering“ (engl.=anbinden) Effekt, der auf der Verstärkung des 1. Signals über verstärkte Anhaftung an die auslösenden Antikörper beruht, ausgeschlossen werden konnte. Verwandt wurden die Reagentien PMA und PHA P. Zusätzlich erfolgte eine Immobilisierung der anti-ICOS Ak, anti-CD28 Ak und einer unspezifischen Isotypkontrolle.

Es zeigte sich, daß in keinem der drei Experimente eine kostimulatorische Wirkung des ICOS Moleküls beobachtet werden konnte, wenn die Initialstimulation mit PMA erfolgte, während dies für CD28 deutlich zu zeigen war (Abb. 16a). Dagegen ist in Abb.16b dargestellt, daß das ICOS Molekül bei Initialstimulation mit PHA P eine deutliche kostimulatorische Wirkung auf die Proliferation ausübt. Die Steigerung der Proliferation um den Faktor zwei ist zwar sehr viel geringer als die Steigerung, die bei einer Initialstimulation mit anti-CD3 Antikörpern erzielt werden konnte (in diesen Versuchen wurde durch anti-CD3 Ak alleine keine Proliferation erzielt, die Proliferation also durch das ICOS Molekül initiiert, s. 5.2.1), war aber gleichmäßig in allen Experimenten zu verzeichnen und sollte somit spezifisch sein. Die vergleichsweise geringe Steigerung der Proliferation zeigte sich auch für die Kostimulation via CD28. Die geringere ICOS Expression, die sich durch PHA P erzielen läßt (s. 5.1., Abb. 4 und 5) scheint diesem Effekt also eher nicht zugrunde zu liegen, da die Kostimulation via CD28 von ähnlichen Effekten betroffen ist und die Expression von CD28 nicht aktivierungsabhängig ist.

Festzuhalten ist jedenfalls, daß die durch das ICOS Molekül initiierten Signaltransduktionsprozesse, die in den gemessenen kostimulatorischen Effekten resultieren, nicht nur bei einer Stimulation mit anti-CD3 Ak als erstem Signal auftreten. Die Wirkung des ICOS Moleküls stellt somit eine Form der Kostimulation dar, die unabhängig vom „tethering“ Effekt funktioniert.


44

Abb. 16a Kostimulation via ICOS mit PMA als erstem Signal. NTZ wurden in 96-Loch Platten mit PMA stimuliert (100 000 Zellen/Loch). Die Konzentration des PMA betrug 0,625 ng/ml. Nach 4 Tagen wurde den Zellen 1 µCi 3[H] Thymidin zugefügt und die Kultur weitere 16 h fortgeführt. Dann erfolgte die Analyse der Proliferation im Szintillationszähler. Dargestellt sind Mittelwerte von Versuchsvierfachwerten eines unabhängigen, repräsentativen Experiments (n=3).

Abb. 16b Kostimulation via ICOS mit PHA P als erstem Signal. Zelldichte, Kulturbedingungen Analyse erfolgten analog zu Abb. 16b. Die Konzentration von PHA P war in Vorexperimenten austitriert worden. 3[H] Thymidin wurde nach 4 d zugefügt. Dargestellt sind Mittelwerte von Versuchsvierfachwerten eines unabhängigen, repräsentativen Experiments (n=3).


45

5.3 Langzeitstimulation über das ICOS Molekül

In den nachfolgend beschriebenen Experimenten wurden die Effekte unterschiedlicher Kostimuli in einem System untersucht, in dem die Zellen zunächst über einen definierten Stimulus sieben Tage lang stimuliert wurden, was als erste Phase der Stimulation bezeichnet wird. Nach einer Ruheperiode von 24 h wurde die Zellpopulation dann drei Tage lang restimuliert, was im folgenden als zweite Phase der Stimulation bezeichnet wird. Die Immobilisierung der Ak erfolgte gemäß 4.3.1.3. Die Konzentration der löslichen Stimuli betrug: IL-2: 20 U/ml, PMA: 5 ng/ml.

5.3.1 Differentielle Stimulation in der zweiten Phase-Restimulation über das ICOS Molekül

Um zu untersuchen inwiefern die Kostimulation über das ICOS Molekül weiteren Befunden bezüglich der Kostimulation über CD28 gleicht, bzw. davon abweicht, wurde analysiert, welche Effekte die Kostimulation über das ICOS Molekül bei einer Restimulation bewirkt, die im Anschluß an eine Langzeitvorstimulation über das CD3 Molekül erfolgte. Ein wichtiger Befund bezüglich der Kostimulation über das CD28 Molekül ist, daß eine Kostimulation über CD28, die durch eine Vorstimulation ausgelöste Anergie und Apoptose verhindert [Boussiotis, V.A. et al., 1995, Noel, P.J. et al., 1996a].

Abb. 17 Restimulation von CD4+-Zellen durch das ICOS Molekül und andere kostimulatorische Moleküle. 200 000 CD4+-Zellen wurden in 24-Loch Platten stimuliert, die mit anti-CD3 Ak beschichtet worden waren. An d 4, 5, und 6 wurde die Hälfte des Kulturmediums gegen frisches Kulturmedium ausgetauscht. Nach d 7 wurden die Zellen für 24 h ohne Stimulus inkubiert, dann mit Trypanblau gezählt und jeweils 100 000 vitale Zellen in Löcher einer 96-Loch Platte gegeben. Dort erfolgte eine zweitägige differentielle Stimulation mit den in der Abb. dargestellten Stimuli. Die Proliferation der Zellen wurde durch Zugabe von 1 µCi 3[H] Thymidin für 16 h und eine anschließende Analyse im Szintillationszähler gemessen. Die Werte stellen Mittelwerte von Vierfachwerten eines repräsentativen Experiments dar (n=6).

Um zu untersuchen, ob dieser Befund auch für eine Kostimulation via ICOS zutrifft, wurden CD4+-Zellen, analog zu Wolf, H. et al., 1994, 7 Tage lang mit einer maximalen Konzentration von anti-CD3


46

Ak stimuliert, wobei den Zellen an Tag vier, fünf und sechs neues Medium hinzugefügt wurde. Am Tag sieben wurden die Zellen vorsichtig abzentrifugiert, in frischem Medium aufgenommen und für 24 h ohne Stimulation in R10F+ inkubiert. Durch eine Trypanblaufärbung wurde die Zellviabilität und der Vermehrungsfaktor der Population untersucht. Die Anzahl der toten Zellen betrug regelmäßig ca. 20 %, der Vermehrungsfaktor schwankte stark in den fünf durchgeführten Experimenten, ist für die Fragestellung jedoch auch zu vernachlässigen, da mögliche Unterschiede zwischen dem ICOS Molekül und anderen Kostimuli untersucht werden sollten. Nach der Ruheperiode wurden die Zellen intensiv gewaschen und mit verschiedenen Kostimuli (anti-ICOS Ak, anti-CD28 Ak, IL-2 und PMA) restimuliert. Die dadurch induzierte Proliferation wurde nach drei Tagen bestimmt.

In Abb. 17 ist das Ergebnis eines solchen Proliferationsassays zu sehen. Es zeigte sich, daß die Restimulation nur über anti-CD3 Ak in dieser vorstimulierten Zellpopulation nicht mehr in der Lage ist, die maximal mögliche Proliferation zu induzieren, obwohl die eingesetzte anti-CD3 Ak Konzentration dies ermöglichte, sofern die Zellen nicht vorstimuliert worden waren. Der in Abb. 17 gemessene 3[H] Thymidin Einbau ist um etwa 50% kleiner, als wenn die Zellen unter den gleichen Bedingungen ohne Vorstimulation stimuliert wurden. Die Ansprechbarkeit der Zellen auf diesen Stimulus wurde also durch die Vorstimulation deutlich eingeschränkt (siehe für ähnliche Befunde auch Wolf, H. et al., 1994). Durch die Kostimulation (unabhängig vom verwendeten Kostimulus) ist allerdings eine Verstärkung der Proliferation erreichbar. Die absoluten Werte und ihr Verhältnis untereinander sind dabei nur als ein Beispiel von fünf durchgeführten Experimenten anzusehen und nicht als absolute Reihenfolge. Die Potenz der einzelnen Kostimuli und die daraus resultierende Reihenfolge der Stärke der induzierten Proliferation schwankte in den fünf Experimenten.

Festzuhalten ist, daß die Kostimulation den Status der verminderten Ansprechbarkeit der Zellen aufhebt. Wie oben erläutert wurde dieser Effekt für CD28 bereits untersucht [Boussiotis, V.A. et al., 1995, Noel, P.J. et al., 1996b]. Für das CD28 Molekül wird dieses Phänomen als Verhinderung der durch Stimulation über das CD3 Molekül induzierten Anergie oder als Verhinderung des durch Aktivierung induzierten Zelltod ("activation induced cell death" = AICD) interpretiert.

5.3.2 Differentielle Kostimuli in der ersten Stimulationsphase - Langzeitstimulation über das ICOS Molekül

Parallel zu dem in 5.3.1 vorgestellten Ansatz wurde untersucht, wie sich eine Langzeitvorstimulation über das ICOS Molekül und eine daran angeschlossene Restimulation über das CD3 Molekül ohne Kostimulus auswirkt und ob sich auch hier Gemeinsamkeiten mit den Befunden, die durch andere Kostimuli erzielt wurden, ergeben.

Dabei wurden die Zellen wie in 5.3.1 stimuliert und gefüttert mit dem Unterschied, daß hier zusätzlich zur Maximalkonzentration an anti-CD3 Ak in der ersten Stimulationsphase, die Kostimuli (anti-ICOS Ak, anti-CD28 Ak, IL-2 oder PMA) hinzugefügt wurden, während in der zweiten Stimulationsphase eine Stimulation über das CD3 Molekül ohne Kostimuli erfolgte. Die Messung der Proliferation erfolgte nach drei Tagen Restimulation. Die löslichen Stimuli wurden bei den Fütterungen in der oben beschriebenen Konzentration hinzugefügt.


47

Tabelle 1: Der Wachstumsfaktor steht für die Vervielfachung der ursprünglich eingesetzten Zellzahl, wobei die toten Zellen nicht einberechnet wurden (Ausschluß via Trypanblaufärbung). 200 000 CD4+-Zellen wurden pro Loch in einer 24-Loch Platte stimuliert. Der anti-CD3 Ak, anti-ICOS Ak und anti-CD28 Ak wurden auf den Platten immobilisiert, die löslichen Stimuli zu Beginn der Kultur hinzugefügt. (Konzentration IL-2: 20 U/ml, PMA: 5 ng/ml). An d 5, 6 und 7 wurde die Hälfte des Kulturmediums gegen frisches ausgetauscht, wobei die Konzentration der löslichen Stimuli durch Hinzufügen neuer Reagenzien beibehalten wurde. Dargestellt ist die Zählung der Zellen nach sieben Tagen Stimulation im Rahmen eines repräsentativen Experiments (n=6).

Zellstimuli

Anteil an toten Zellen (in %)

Wachstumsfaktor

anti-CD3 Ak

26

5,7

anti-CD3 Ak + anti-ICOS Ak

43

3,4

anti-CD3 Ak + anti-CD28 Ak

14

9,2

anti-CD3 Ak + IL-2

16

14,5

anti-CD3 Ak + PMA

18

5,5

Bereits die Zählung der Zellen und die Überprüfung ihrer Viabilität nach sieben Tagen vor der Restimulation und der eintägigen Ruheperiode ergab ein sehr variables Bild. Stellvertretend für eins von fünf durchgeführten Experimenten steht Tabelle 1.

Auffällig war zunächst v.a. der überproportional hohe Anteil an toten Zellen in der Population, die mit ICOS kostimuliert wurde. Dieses Ergebnis lag bei allen Experimenten um 50% während es für die anderen Zellpopulationen regelmäßig um 20% lag und zwischen den mit CD28, IL-2 oder PMA stimulierten Gruppen keine signifikant voneinander abweichenden Ergebnisse festgestellt werden konnten.

Der Wachstumsfaktor war absolut gesehen weniger konstant als der Anteil an toten Zellen, die relativen Unterschiede innerhalb der verschiedenartig stimulierten Populationen waren jedoch gleichbleibend: Die mit IL-2 kostimulierten Zellen erzielten regelmäßig die höchsten Zuwächse, gefolgt von der Population, die mit CD28 kostimuliert worden war. Signifikant niedrigere Zuwachsraten wurden durchgängig von denjenigen Zellpopulationen erzielt, die mit ICOS kostimuliert worden waren.

Im Anschluß an die 24-stündige Ruhephase wurde die Dichte der CD3 Expression in allen Zellpopulationen in der Durchflußzytometrie überprüft. Da in der ersten und der zweiten Stimulationsphase die Stimulation über einen anti-CD3 Ak erfolgte, hätte eine Herunterregulation des CD3 Moleküls - sofern sie durch die kostimulatorischen Agenzien unterschiedlich beeinflußt worden wäre - zu einer unterschiedlichen Stimulierbarkeit der Zellen in der zweiten Stimulationsperiode führen können. Dies konnte durch den Vergleich der CD3 Expressionsdichte der verschiedenen Zellpopulationen ausgeschlossen werden, die zeigte, daß die Expressionsdichte in allen Populationen nicht signifikant voneinander abwich (nicht gezeigt).

Abb. 18 zeigt die durch die Restimulation mit anti-CD3 Ak ausgelöste Proliferation der Zellen, die durch unterschiedliche Kostimuli vorstimuliert worden waren. Dabei stellen sich deutlich zwei verschiedene Reaktionsmuster der Zellen dar: Wurden die Zellen zuerst mit CD28 oder PMA kostimuliert, dann sind die Zellen in der Lage als Reaktion auf den zweiten Stimulus, der nur über das CD3 Molekül vermittelt wird, zu proliferieren. Es ist v.a. darauf hinzuweisen, daß diese Antwort stärker


48

ausfällt als die Proliferationsantwort, die diejenige Zellpopulation zeigt, die bereits als ersten Stimulus nur über CD3 stimuliert wurde und zwar um den Faktor 4 (1. Stimulation: Kostimulation mit PMA) bzw. Faktor 5 (1. Stimulation: Kostimulation mit CD28). Dies stellt somit ein Ergebnis dar, das den Ergebnissen anderer Untersuchungen entspricht (z.B. Wolf, H. et al., 1994), daß nämlich eine Kostimulation über CD28 das Eintreten von Anergie, das heißt die Nicht-Antwort von Zellen auf einen zweiten Stimulus, verhindert.

Andererseits scheinen bestimmte Formen der Kostimulation, eine entgegengesetzte Reaktion zu induzieren: Wurden die Zellen zuerst mit IL-2 oder anti-ICOS Ak kostimuliert, so reagierten sie deutlich weniger auf den zweiten Stimulus, als wenn sie konsekutiv zweimal über das CD3 Molekül stimuliert wurden. Die derart stimulierten Zellpopulationen zeigen also eher eine Proliferationsdepression. Diese Depression lag im dargestellten Beispiel um den Faktor 6 (1. Stimulation: Kostimulation über ICOS) bzw. 40 fach (1. Stimulation: Kostimulation über IL-2) niedriger als die durch konsekutive Stimulation über anti-CD3 Ak ausgelöste Proliferation (dies ist wieder nicht als absoluter Wert anzusehen).

Abb. 18 Proliferation durch Restimulation über anti-CD3 Ak nach unterschiedlichen Vorstimulationen. 200 000 CD4+-Zellen pro Loch wurden in den Löchern einer 24-Loch Platte mit den in der Abb. angegebenen Stimuli (Ak immobilisiert) sieben Tage lang stimuliert. An d 5, 6 und 7 wurde die Hälfte des Kulturmediums durch frisches Medium ersetzt, wobei die Konzentration der löslichen Stimuli (IL-2: 20 U/ml, PMA: 5 ng/ml) beibehalten wurde. Am d 7 wurden die Zellen abzentrifugiert und für 24 h auf Platten ohne Stimuli überführt. Danach erfolgte ein Transfer von jeweils 100 000 Zellen in die Löcher einer 96-Loch Platte, die mit anti-CD3 Ak beschichtet worden war. Die Zellen wurden zwei weitere Tage stimuliert, dann wurde ihnen 1 µCi 3[H] Thymidin hinzugefügt und die Proliferation nach 16 h 3[H] Thymidin Einbau durch Messung in einem Szintillationsgerät analysiert. Die Werte stellen Mittelwerte aus Vierfachwerten eines unabhängigen, repräsentativen Experiments dar (n=6).

Interessant ist dieses Ergebnis v.a. insofern, als die über ICOS oder IL-2 stimulierten Zellpopulationen sich bezüglich der Zuwachsraten und des Anteils an toten Zellen nach sieben Tagen völlig entgegengesetzt verhielten. Die Zellviabilität der Kulturen, die über das ICOS Molekül stimuliert worden waren,


49

war halb so groß wie die aller anderen Kulturen (s. obige Tabelle). Dieser Befund kann als Erklärung für die geringere Zuwachsrate sowohl in den ersten Kulturen (s. obige Tabelle), wie auch für die soeben vorgestellten Befunde nach Restimulation dienen. Die Kulturen, die mit IL-2 kostimuliert worden waren, zeigten jedoch eine durchschnittliche Absterberate und die größten Zuwächse aller Populationen nach sieben Tagen, diese Parameter deuten also nicht auf eine verminderte Viabilität hin, die sich in einer zweiten Stimulationsphase negativ auswirken würde. Somit stellt sich die Frage, ob sich die Ähnlichkeit bezüglich der Proliferationsdepression der mit ICOS oder IL-2 vorstimulierten Populationen auf einen gemeinsamen Faktor gründet oder ob dieser Befund durch zwei unterschiedliche Effekte zustande kommt.

5.3.3 Differentielle Kostimulation in der ersten und in der zweiten Stimulationsphase

Um die oben dargestellten Fragen und Befunde zu klären, wurde im Anschluß an die Versuchsreihen 5.3.1 und 5.3.2 in dem vorgestellten System untersucht, ob die Kostimulation über ICOS in der ersten Stimulationsphase eine generelle Depression der Zellen bewirkt bzw. ob Kostimuli in der Restimulationsphase diese unterdurchschnittliche Proliferation aufheben können. Gleichzeitig sollte auch in diesen Versuchen wieder der Vergleich mit den anderen Kostimuli (CD28, IL-2 und PMA) angestellt werden. Die Zellen wurden zu diesem Zweck in beiden Phasen mit unterschiedlichen Kostimuli aktiviert, so daß sich das in Abb. 19 zu sehende komplexe Muster von erstem und zweitem Kostimulus ergibt.

Abb. 19 Differentielle Vorstimulation und Restimulation durch ICOS und andere kostimulatorische Moleküle. 200 000 CD4+-Zellen pro Loch wurden in den Löchern einer 24-Loch Platte mit den in der Abb. angegebenen 1. Stimuli (Ak immobilisiert) sieben Tage lang stimuliert. An d 5, 6 und 7 wurde die Hälfte des Kulturmediums durch frisches Medium ersetzt, wobei die Konzentration der löslichen Stimuli (IL-2: 20 U/ml, PMA: 5 ng/ml) beibehalten wurde. Am d 7 wurden die Zellen abzentrifugiert und für 24 h auf Platten ohne Stimuli überführt. Danach erfolgte ein Transfer von jeweils 100 000 Zellen in die Löcher einer 96-Loch Platte, die mit anti-CD3 Ak und den in der Legende aufgeführten Kostimuli versehen war (=2. Stimulus) (alle Ak immobilisiert). Die Zellen wurden zwei weitere Tage stimuliert, dann wurde ihnen 1 µCi 3[H] Thymidin hinzugefügt und die Proliferation nach 16 h 3[H] Thymidin Einbau durch Messung in einem Szintillationsgerät analysiert. Die Werte stellen Mittelwerte aus Vierfachwerten eines unabhängigen, repräsentativen Experiments dar (n=3).


50

In Abb. 19 ist erstens festzustellen, daß die Zellpopulationen, die mit PMA oder CD28 vorstimuliert wurden, unabhängig vom in der zweiten Stimulationsphase verwendeten Stimulus, immer eine ausgeprägte Proliferation zeigen. Zweitens scheint die in 5.3.2 geschilderte verringerte Proliferation der Kulturen, die mit IL-2 vorstimuliert wurden, an den Entzug des IL-2 und den Mangel an anderen Kostimuli gekoppelt zu sein. Wird die Zellpopulation erneut mit IL-2 oder den anderen verwendeten Kostimuli stimuliert, so ist auch diese Zellpopulation in der Lage, auf die Stimulation mit einer deutlichen Proliferation zu reagieren. Drittens ist auffällig, daß diejenigen Zellen, die mit ICOS vorstimuliert wurden, durch eine Kostimulation über CD28, IL-2 oder PMA proliferieren und zwar in vergleichbarer Stärke wie die Zellpopulationen, die durch andere Kostimuli vorstimuliert worden waren. Lediglich die Restimulation über das CD3 Molekül alleine oder in Kombination mit anti-ICOS Ak als Kostimulus führen zu der in 5.3.2 dargelegten Proliferationsdepression.
[Titelseite] [Danksagung] [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [Bibliographie] [Selbständigkeitserklärung]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Fri Mar 16 20:17:39 2001