Dittrich, Anna-Maria: Induktionsbedingungen und kostimulatorische Effekte von ICOS - einem neuen T-Zellspezifischen Oberflächenantigen

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Kapitel 6. Diskussion

6.1 Die Expression des ICOS Moleküls ist abhängig von zwei Signalen

Die in 5.1 dargestellten Versuche zeigen deutlich, daß die Expression des ICOS Moleküls zweisignalabhängig ist. Die geringe Expressionsstärke, die sich durch alleinige Stimulation mit PMA oder Ionomycin erzielen ließ, stieg auch durch eine längere Stimulation (gezeigt bis 24 h) nicht auf das Niveau der Expression an, das sich nach Stimulation durch PMA und Ionomycin einstellte. Es muß also davon ausgegangen werden, daß eines der Signale nicht zur vollständigen Aktivierung des intrazellulären Signalwegs ausreicht, durch den die ICOS Expression gesteuert wird. Die Hypothese der Zweisignalabhängigkeit der ICOS Expression wird durch die Befunde der Stimulation via anti-CD3 Ak und PHA P unterstützt, da diese Stimulationsbedingungen eher der Stimulation durch ein einziges Signal entsprechen. Auch die hier nicht gezeigten Befunde, daß eine maximale ICOS Expression durch Kostimulation via CD28 und anti-CD3 Stimulation erreicht wird, sprechen für diese Interpretation.

Aufgrund dieser Befunde läßt sich außerdem postulieren, daß für die Induktion des ICOS Moleküls ein intrazellulärer Signaltransduktionsweg notwendig ist, der einerseits die Proteinkinase C aktiviert und zusätzlich vom Anstieg des intrazellulären Ca2+ abhängig ist. Untermauert wird dies durch die Ergebnisse, daß die Induktion des ICOS Moleküls CsA sensitiv ist. Ohne die Funktion des Calcineurin Moleküls, die vom Anstieg des intrazellulären Kalziums abhängig ist, ist die ICOS Expression drastisch eingeschränkt (Abb. 3). Weitere Versuche mit Inhibitoren, die selektiv bestimmte intrazelluläre Prozesse der T-Zellaktivierung hemmen, werden notwendig sein, um detaillierter zu analysieren, welche Prozesse zur Expression des ICOS Moleküls führen. Es ist jedoch deutlich geworden, daß die Expression des ICOS Moleküls eng reguliert ist, enger als die Expression derjenigen Moleküle, deren Expression bereits durch ein Signal induziert werden kann. Bezogen auf die in vivo Situation deutet diese Tatsache an, daß es sich bei dem ICOS Molekül um ein Molekül handelt, dessen Funktion sehr spezifisch begrenzt werden muß, um zu verhindern, daß eine Funktionsausübung unter inadäquaten Bedingungen zur Fehlfunktion des Immunsystems führt.

Auch die frühzeitige Expression des ICOS Moleküls, die durch die Expressionsstudien bestätigt und präzisiert werden konnte, weist indirekt darauf hin, daß das ICOS Molekül in der Lage ist, entscheidenden Einfluß auf die Funktionen des Immunsystems zu nehmen. Denn die Moleküle, die früh während einer Immunantwort induziert werden, sind in der Lage, entscheidende Weichen für die in dieser Immunantwort stattfindenden Prozesse zu stellen.

6.2 Das ICOS Molekül hat kostimulatorische Wirkungen auf viele Parameter und induziert durch Kostimulation ein ICOS spezifisches Muster an Effekten

Durch die in 5.2 beschriebenen Ergebnisse konnte der Befund, daß das ICOS Molekül ein kostimulatorisches Molekül darstellt, um eine Reihe von Informationen zu dieser kostimulatorischen Wirkung und den Funktionen auf die sie sich auswirkt, erweitert werden. Zunächst konnte in 5.2.1 gezeigt werden, daß die kostimulatorische Wirkung des anti-ICOS Antikörpers konzentrationsabhängig ist. Die Konzentrationsabhängkeit kann im Umkehrschluß als Indiz für die bereits geäußerte Vermutung gewertet werden, daß die Stärke der kostimulatorischen Wirkung proportional der ICOS Expressionsdichte ist. Eine geringe Menge des anti-ICOS Ak kann u.U. nicht alle exprimierten ICOS Moleküle ligieren, so daß eine geringere Expressionsdichte simuliert wird als tatsächlich vorhanden ist. Ande


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rerseits besteht auch die Möglichkeit, daß die Ligation des ICOS Moleküls seine eigene Expression und damit die über ICOS vermittelten Effekte hochreguliert. Eine geringere Menge des anti-ICOS Ak würde dann zu einer geringeren ICOS Expression führen, über die nur geringere kostimulatorische Effekte erzeugt werden könnten. Diese möglichen Wirkungsmechanismen müssen noch genauer analysiert werden.

Neben dem klassischen Kostimulationsparameter Proliferation konnte durch die vorliegende Arbeit gezeigt werden, daß eine Reihe weiterer Parameter der T-Zellaktivierung und -funktion durch Kostimulation via ICOS beeinflußt werden. Der dabei z.T. erfolgte Vergleich mit den Ergebnissen, die durch Kostimulation via CD28 zu erzielen sind, ermöglicht einerseits eine Einschätzung der Potenz der Kostimulation durch ICOS. Andererseits zeigen diese Befunde, daß das ICOS Molekül spezifische Wirkungen bei der Kostimulation initiiert, die sich von den Wirkungen durch CD28 Kostimulation deutlich unterscheiden. Sie erlauben daher davon auszugehen, daß das ICOS Molekül eine spezifische Rolle im Immunsystem inne hat, die über eine bloße Redundanz hinausgeht.

Generell gilt dabei für die Versuche, daß sie mit anti-CD3 Antikörpern als erstem Stimulus durchgeführt wurden. Diese wurden z.T. suboptimal eingesetzt (Oberflächenmolekülexpression, Proliferation, Immunglobulinsynthese), z.T. in optimaler Konzentration verwandt (Zytokinsekretion und Langzeitstimulation/Induktion von Anergie). Dabei entspricht die suboptimale Konzentration des anti-CD3 Ak am ehesten der in vivo Situation, in der die Menge des Antigens gering ist. Die Versuche, in denen eine Verstärkung der gemessenen Parameter auch bei optimalen anti-CD3 Ak Konzentrationen meßbar war, unterstreichen die Potenz der kostimulatorischen Effekte des ICOS Moleküls, welches anscheinend in der Lage ist, selbst unter dieser maximalen Stimulation noch zusätzliche intrazelluläre Effekte zu induzieren.

Außerdem konnte gezeigt werden, daß die kostimulatorische Fähigkeit des ICOS Moleküls nicht davon abhängig ist, daß der 1. Stimulus durch anti-CD3 Ak erfolgt. Analog zu Versuchen für CD27 [Kobata, T. et al., 1994], CD28 [Baroja, M.L. et al., 1989, Thompson, C.B. et al., 1989] und LFA-3 [Sansom, C.M. et al., 1993] ließ sich darstellen, daß das ICOS Molekül auch mit löslichem 1. Stimulus (PHA P) in der Lage ist, kostimulatorisch zu wirken. Der Verstärkungsfaktor, der gemessen werden konnte, ist sowohl für ICOS, wie auch für CD28, deutlich geringer als bei einer Initialstimulation mit anti-CD3 Ak. Dies ist jedoch u.U. auf den in Liu, Y. and Janeway, 1992 vorgestellten Befund zurückzuführen, daß eine optimale Kostimulation die Koexpression des ersten und des kostimulatorischen Signals auf den APC voraussetzt. Diese Koexpression entspricht vielleicht eher der Koimmobilisierung von anti-CD3 Ak und anti-kostimulatorischem Molekül Ak auf einer Platte, als der Wirkung des ersten Signals über ein lösliches Molekül, wie PHA P und der Kostimulation über den immobilisierten Ak. Daneben trifft für das ICOS Molekül außerdem zu, daß seine Expression durch anti-CD3 Ak besser als durch PHA P zu induzieren ist (Abb. 4 und 5). Der geringere kostimulatorische Effekt könnte also auch darauf zurückzuführen sein, daß durch die Stimulation via PHA P zu wenig ICOS Moleküle induziert werden, um einen stärkeren kostimulatorischen Effekt zu initiieren. Dies ist jedoch im Hinblick auf die ähnlichen Ergebnisse für das CD28 Molekül unwahrscheinlich. Eher scheint es möglich, daß die Wirkungsweise von PHA P, das Glykoproteine kreuzvernetzt, die Ursache dieses Effekts darstellt. Die unspezifische Kreuzvernetzung durch PHA P, führt u.U. bereits zur Kreuzvernetzung einiger


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ICOS oder CD28 Moleküle, so daß die zusätzliche Kreuzvernetzung über die mAk keine starke Steigerung mehr induzieren kann. Möglicherweise liegt diesem Phänomen auch zugrunde, daß die Signaltransduktion über ein kostimulatorisches Molekül über Eingriffe in die vom ersten Signal ausgelösten Signaltransduktionsprozesse wirkt und dadurch die gemessenen Parameter verändert. Die Expressionsstärke der Parameter, die als Maß für den kostimulatorischen Effekt herangezogen werden, ist also immer auch davon abhängig, inwieweit durch das untersuchte kostimulatorische Molekül in die Signaltransduktionswege eingreifen werden kann, die vom ersten Signal ausgelöst wurden. Dies ist u.U. bei den durch PHA P ausgelösten Signalwegen schlechter möglich, wofür auch spricht, daß auch die kostimulatorische Wirkung von CD28 unter diesen Bedingungen schwächer ist als bei Experimenten, in denen das erste Signal über anti-CD3 Ak vermittelt wird. Weitere Untersuchungen, v.a. bezüglich der intrazellulären Signalwege müßten erfolgen, um diese Hypothesen genauer zu untersuchen.

Der Versuch, das Ergebnis der Kostimulation mit einem weiteren löslichen Stimulus, nämlich PMA zu reproduzieren, wie dies für CD5 oder CD28 möglich ist [Alberola-Ila, J. et al., 1992, Thompson, C.B. et al., 1989], scheiterte jedoch. Da die Konzentration von PMA (und auch PHA P) in Vorexperimenten über einen weiten Bereich austitriert worden war, um den Bereich zu finden, in dem die kostimulatorische Wirkung des ICOS Moleküls optimal darzustellen war, konnte eine Konzentrationsabhängigkeit nicht Ursache dieser ausbleibenden Wirkung sein. Wahrscheinlich ist dieser Befund für ICOS darauf zurückzuführen, daß die Expression des ICOS Moleküls durch PMA nur schlecht zu induzieren ist, während dies für CD28 als konstitutiv exprimiertem Molekül nicht notwendig ist (siehe hierzu 5.1, Abb. 1). Anscheinend reicht die Ligation der wenigen ICOS Moleküle, die durch Stimulation mit PMA induziert werden, nicht aus, um den intrazellulären Ca2+-Spiegel auf das Niveau zu erhöhen, das für die Proliferation der T-Zellen notwendig ist. Möglich scheint aber auch, daß das ICOS Molekül nicht in der Lage ist, das intrazelluläre Ca2+ zu erhöhen, unabhängig von seiner Expressionsstärke. Der Anstieg des intrazellulären Ca2+, der für die Aktivierung der T-Zelle essentiell ist, müßte also durch das erste Signal vermittelt werden, wenn eine Kostimulation via ICOS zu einer Aktivierung der T-Zelle führen soll. Das verwendete PMA erhöht jedoch kein Ca2+. Für diese Überlegung sprechen auch Befunde, daß die Transkription des IL-2 Gens neben der Aktivierung der Proteinkinase C vom Anstieg des intrazellulären Ca2+ abhängig ist [Ho, N. et. al., 1996, Schwartz, R.H., 1990], und diese Transkription durch Kostimulation via ICOS nicht zu induzieren ist (siehe hierzu 5.2.2.2, Abb. 10 und unten). Diese Annahme müßte jedoch durch zusätzliche Versuche überprüft werden, die gezielt die Ca2+-Mobilisation und dabei involvierte Moleküle nach ICOS Ligation untersuchen.

Entscheidend sind diese Befunde trotz der noch bestehenden Unklarheiten, da sie zeigen, daß das ICOS Molekül seine kostimulatorische Wirkung nicht über eine verstärkte Bindung der Zellen an die CD3 Ak vermittelt, also nicht nur ein sogenanntes „tethering“ ausübt. Es scheint vielmehr durch die Ligation des ICOS Moleküls ein Prozeß initiiert zu werden, der spezifisch in Signalwege eingreift, die durch das 1. Signal ausgelöst werden. Die Vorstellung, daß durch die Kostimulation via ICOS ein spezifischer Signalweg entsteht, wird durch die Befunde bezüglich der Zytokinsekretion und der Induktion der Anergie gestützt. Bezogen auf diese Parameter, entstehen durch die Kostimulation via ICOS charakteristische Ergebnisse, die die Kostimulation durch dieses Molekül von kostimulatorischen Effekten durch andere Moleküle unterscheidet.


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Die T-Zellproliferation stellt einen notwendigen Vorgang bei der Initiation der Immunantwort dar, da die Anzahl der Ag spezifischen T-Zellen viel zu klein ist, um eine adäquate T-Zellhilfe zu leisten [Schwartz, R.H., 1990]. Voraussetzung und Vorboten der T-Zellproliferation sind eine Reihe ganz charakteristischer Veränderungen von Phänotyp und Funktion der T-Zelle. Die Untersuchung der Auswirkung der Kostimulation durch das ICOS Molekül auf die Expression der Oberflächenmoleküle CD25 und CD40L, zweier Moleküle, die charakteristischerweise früh nach der T-Zellaktivierung induziert bzw. hochreguliert werden, stellt einen ersten Anhaltspunkt für die Funktion und Wirkungsweise des ICOS Moleküls dar.

Die Hochregulation von CD25 ist für die T-Zelle notwendig, um auf den auto- und parakrin wirkenden Wachstumsfaktor IL-2 mit einer Proliferation zu antworten [Schwartz, R.H., 1990]. Die Kostimulation via ICOS scheint der Zelle dieses zu ermöglichen, da eine beträchtliche Hochregulation des IL-2 Rezeptors induziert wird. Die Hochregulation des Oberflächenmoleküls CD25 ermöglicht es also, vorsichtige Rückschlüsse auf die Grundlagen der Proliferation zu ziehen, die durch das ICOS Molekül induziert wird. Die Implikationen und Schwierigkeiten, die diese Hypothese im Hinblick auf die Ergebnisse bezüglich der Induktion der IL-2 Sekretion darstellt, werden im Rahmen der Diskussion der Zytokinsekretion analysiert werden.

Durch die Untersuchung des Phänotyps, der durch die ICOS Kostimulation induziert wird, konnte erstmalig auch auf Funktionen des ICOS Moleküls geschlossen werden, die das Molekül für das Zusammenspiel der Immunzellen bei der in vivo Immunantwort hat. Verschiedenste Arbeiten der letzten Jahre haben zeigen können, daß die T-Zellhilfe für die B-Zelle von der Interaktion des CD40-CD40L Ligandenpaares abhängig ist, und daß sogar eine direkte Korrelation zwischen CD40L Expression der T-Zelle und der erreichten B-Zellhilfe besteht [De Boer, M. et al., 1993, Klaus, S.J. et al., 1994, Kwekkeboom, J. et al., 1994]. Die durch das ICOS Molekül induzierbare CD40L Expression könnte hierbei u.U. die gleiche Funktion haben, wie dies für das CD28 Molekül gezeigt werden konnte: Erst die Kostimulation via CD28 kann demnach eine adäquate CD40L Expression induzieren, die wiederum die Grundlage der T-Zellhilfe für die B-Zellen ist.

Reziproke, sequentielle Interaktionen bei der Aktivierung von T- und B-Zellen sind aufgrund der vielfältigen Befunde zur Interaktion der beiden Aktivierungswege in den letzten Jahren oft vorgeschlagen worden [Clark, E.A. and Lane, P.J., 1991, Clark, E.A. and Ledbetter, J.A., 1994, Lenschow, D.J. et al., 1996, Van Gool, E.A. et al., 1996]. Im Rahmen der hier gezeigten Befunde könnte das ICOS Molekül ein Bindeglied in dieser reziproken B-Zell-T-Zellaktivierungskaskade darstellen: Die frühe Induktion und folgende Stimulation über das ICOS Molekül könnte zur Hochregulation von CD40L auf den T-Zellen führen, die wiederum für die CD40-CD40L Interaktion notwendig ist, welche schließlich zur Hochregulation von CD80/CD86 führt und die Adhäsion über LFA-1 (Leucocyte funktion-associated antigen-1) verstärkt [Lenschow, D.J. et al., 1996, Splawski, J. et al., 1993, Van Gool, E.A. et al., 1996]. Über die CD28/B7, ICAM-1 (Intercellular adhesion molecule-1)/LFA-1 und CD40/CD40L Interaktion könnte dann die T-Helferfunktion so gesteigert werden, daß letztlich die Induktion der Immunglobulinsekretion resultiert [Damle, N.K. et al., 1991, Jenkins, M.K. et al., 1994, Kwekkeboom, J. et al., 1994 und Splawski, J. et al., 1993]. Für diese These spricht auch die Tatsache, daß das ICOS Molekül sehr früh im Rahmen der T-Zellaktivierung exprimiert wird. Einige Studien zur CD28/B7 Interaktion zeigen,


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daß die frühe T-Zellaktivierung auch ohne CD28/B7 Interaktion zur T-Zellaktivierung führt, bzw. daß die Kostimulation durch CD28 wohl v.a. zu einem späteren Zeitpunkt der T-Zellaktivierung relevant ist [Van Gool, E.A. et al., 1996, Zhang, Y.-Q., 1997]. Somit scheint es durchaus möglich, daß die Kostimulation via ICOS zu einem früheren Zeitpunkt als das CD28 Molekül die T-Zelle aktiviert und in eine bestimmte Differenzierungsrichtung lenkt.

Letztlich wird diese Annahme auch durch die Ergebnisse bezüglich der Immunglobulinsekretion gestützt. Die Ergebnisse in 5.2.2.3 zeigen, daß das ICOS Molekül potentiell in der Lage ist, eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung einer humoralen Immunantwort zu spielen. In den in 5.2.2.3 gezeigten Versuchen wird deutlich dargestellt, daß unter den dort herrschenden Bedingungen allein die Kostimulation via ICOS (oder CD28) in der Lage ist, eine Immunglobulinsekretion zu induzieren, daß diese also vollkommen abhängig von dieser Kostimulation ist. Dieser kostimulatorische Effekt wurde bisher nur für die Moleküle CD28 und OX40 [Stüber, E. and Strober, W., 1996] gezeigt, scheint aber kein Parameter zu sein, der durch alle kostimulatorischen Moleküle beeinflußt wird, wie z.B. die Proliferation. Unterstützt wird die Hypothese, daß die Kostimulation via ICOS entscheidend an der Induktion der humoralen Immunantwort beteiligt ist, auch durch die histologischen Untersuchungen der Expression in vivo. Die starke Expression des ICOS Moleküls im Keimzentrum der sekundären lymphatischen Gewebe, wo eben diese B-Zellhilfe durch die CD40-CD40L-Interaktionen geleistet wird, stellt einen Anhaltspunkt dafür dar, daß diese ICOS Funktion auch in vivo ausgeübt werden könnte.

Zusätzlich deuten auch die Ergebnisse der durch Kostimulation erzielten Zytokinsekretion an, daß die Kostimulation via ICOS einen entscheidenden Schritt bei der Induktion der humoralen Immunantwort darstellt. Das ICOS Molekül induziert eine signifikante Menge von IL-4 und steigert die Sekretion von IL-5 (wenn auch erst nach 48 h) um den Faktor 5. Beide Moleküle wurden ursprünglich als BCGFs (B cell growth factors) bzw. BCSFs (B cell stimulating factors) bezeichnet [Sideras, P. et al., 1988], stellen also Zytokine dar, deren Wirkung zur Induktion der Immunglobulinsekretion führen kann. Wenn auch einige Studien zeigen, daß die Induktion von IL-2 eine Voraussetzung für die B-Zellproliferation und Differenzierung darstellt (andere verneinen diese Notwendigkeit allerdings auch) [Bich-Thuy, L.T., 1990, Jelinek, D.F. et al., 1986] und dieses Zytokin durch Kostimulation durch ICOS nicht induziert werden konnte (s. 5.2.2.2 und unten), so ist unter den Bedingungen der Kokultur von T- und B-Zellen nicht ausgeschlossen, daß es zur IL-2 Sekretion kommt: Schließlich ermöglicht diese Situation die Interaktion zwischen CD28 auf den T-Zellen und CD80/CD86 auf den B-Zellen, die in der Lage ist, die IL-2 Sekretion zu induzieren [Thompson, C.B. et al., 1989]. Demnach stellt die Kostimulation via das ICOS Molekül in der T/B Kokultur eine Situation dar, in der sowohl die membranständigen, wie auch die löslichen Moleküle optimal induziert werden können, die für die Differenzierung der B-Zelle notwendig sind, was sich letztlich in der in Abb. 14 gezeigten Induktion der Immunglobulinsekretion darstellt.

Aber auch das Expressionsmuster der anderen Zytokine, die untersucht wurden, d.h. das Muster der Expression von IL-2, IFN-gamma und ATAC, deutet interessante Effekte der Kostimulation durch ICOS an. Daß die Kostimulation via ICOS keine meßbare IL-2 Sekretion induziert, stellt ein zunächst überraschendes Ergebnis dar, wenn man die Effekte der Kostimulation auf die Proliferation betrachtet und davon ausgeht, daß IL-2 den wichtigsten T-Zellwachstumsfaktor darstellt. Da auch nach einer zusätz


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lichen Inkubationszeit von weiteren 24 h keine Veränderung der nach den ersten 24 h gemessenen Werte beobachtet wurde, erscheint es unwahrscheinlich, daß dieses Ergebnis darauf zurückzuführen ist, daß das ICOS Molekül, als induzierbares Molekül später wirkt als z.B. das CD28 Molekül. Weiterhin spricht dagegen, daß die verwendete anti-CD3 Ak Konzentration maximal war und somit einer Konzentration entsprach, die nach 12 h bereits eine deutliche ICOS Expression induzieren konnte (Abb. 5). Die ICOS Expression konnte also keinen limitierenden Faktor darstellen. Drittens ist das ICOS Molekül in der Lage bereits nach 12 h die Expression von CD40L oder CD25 deutlich zu beeinflussen und reguliert die Sekretion von IL-4 und IFN-gamma nach 24 h herauf, so daß nicht davon ausgegangen werden kann, daß die Wirkung der Kostimulation des ICOS Moleküls generell erst zu einem späteren Zeitpunkt zu detektieren ist. Schließlich ist zu konstatieren, daß dieser Umstand wohl für IL-5 zutrifft, das erst nach 48 h deutlich durch die ICOS Kostimulation beeinflußt wird; ein Effekt, der für IL-2 nach 48 h allerdings nicht zu beobachten ist. Eine noch spätere Hochregulation (etwa nach 72 h), erscheint unwahrscheinlich, bzw. zumindest als Grundlage für die gemessene T-Zellproliferation eher irrelevant zu sein, da diese durch den Einbau von 3[H] Thymidin zwischen 58 und 72 Stunden Kulturdauer gemessen wurde. Die Diskrepanz zwischen geringer IL-2 Sekretion einerseits und starker Proliferation andererseits zeigt sich auch in Experimenten mit anderen kostimulatorischen Molekülen [Sunder-Plassman, R. et al., 1995, Van Seventer, G. et al., 1990]. Es bieten sich hierfür unterschiedliche Erklärungen an: Es wäre möglich, daß die induzierte Proliferation durch andere Zytokine oder ein Gemisch anderer Zytokine induziert (z.B. IL-4, -7, -12) wird. Da das ICOS Molekül in der Lage ist, eine Reihe von Zytokinen zu induzieren oder hochzuregulieren, wäre diese Funktionsweise durchaus denkbar. Andererseits wäre es auch möglich, daß das ICOS Molekül eine sehr geringe Menge von IL-2 induziert, die durch den verwendeten IL-2 ELISA nicht bestimmt werden konnte, zumal das sezernierte IL-2 möglicherweise sofort von den Zellen konsumiert wird. Diese Menge könnte aber ausreichend sein, um eine IL-2 abhängige Proliferation zu induzieren, vielleicht unterstützt dadurch, daß durch das ICOS Molekül die IL-2 Rezeptordichte stark heraufreguliert wird, so daß die Wirkung der geringen IL-2 Mengen sehr effizient ist. Die Abhängigkeit der kostimulatorischen Wirkung einiger Moleküle von der Heraufregulation des IL-2 Rezeptors wird auch von Damle, N.K. and Aruffo, A., 1990 und Van Seventer, G. et al., 1990 gezeigt. Diese Hypothesen wären durch eine gezielte Blockade des IL-2 oder des IL-2 Rezeptors relativ einfach zu untersuchen, so daß aufgeklärt werden könnte, über welche Faktoren das ICOS Molekül die Proliferation der T-Zellen beeinflußt.

Während das ICOS Molekül die Sekretion von IL-2 wohl nicht beeinflußt, ist sein Einfluß auf die Sekretion von IFN-gamma und ATAC überaus stark. Die Verstärkung der Sekretion dieser beiden Moleküle ist quantitativ durchaus mit der Wirkung des CD28 Moleküls gleichzusetzen. Nach 48 bzw. 51 h liegen die sezernierten Mengen beider Moleküle in einem ähnlichen Bereich, unabhängig davon, ob die Kostimulation über das ICOS Molekül oder über das CD28 Molekül erfolgte. Die nach 24 h noch schwächere Verstärkung durch das ICOS Molekül kann darauf zurückgeführt werden, daß die zu diesem Zeitpunkt exprimierte Menge der ICOS Moleküle noch zu gering ist, um einen maximalen Effekt zu erzielen. Durch diese Versuche konnte gezeigt werden, daß auch das auf CD8+-Zellen exprimierte ICOS kostimulatorische Funktion besitzt. Außerdem zeigen diese Ergebnisse, daß die Kostimulation über das ICOS Molekül auch Signale induziert, die die zelluläre Immunabwehr steuern.


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Die analysierten Ergebnisse bezüglich der Zytokinsekretion unterscheiden das ICOS Molekül deutlich von anderen kostimulatorischen Molekülen, wie z.B. CD28 [Thompson, C.B. et al., 1990], CD5 [Alberola-Ila, et al., 1992], CD26 [Dang, N.H. et al., 1990], ICAM oder VCAM (Vascular cell adhesion molecule) [Damle, N.K. et al., 1992b], die ein anderes Zytokinmuster induzieren. Vergleichende Studien von ICAM und einerseits und B7 und LFA-3 andererseits haben allerdings gezeigt, daß deren kostimulatorische Wirkung vom Aktivierungs- und Differenzierungsstatus der T-Zellen abhängig ist. ICAM und VCAM induzieren IL-2 Sekretion von ruhenden T-Zellen während B7 und LFA-3 bevorzugt Ag sensibilisierte T-Zellen stimulieren [Damle, N.K. et al., 1992b]. Auch für CD27 konnte die bevorzugte Stimulation einer Subpopulation von T-Zellen gezeigt werden [Kobata, T. et al., 1994]. Diese Möglichkeit ist für das ICOS Molekül bis jetzt noch nicht untersucht worden. Sie stellt eine interessante Erklärungsmöglichkeit für die Redundanz der kostimulatorischen Moleküle dar. Über die Vielfalt der kostimulatorischen Moleküle könnte somit eine differentielle Stimulation erfolgen, durch die je nach Aktivierungs- und Differenzierungsstatus und möglicherweise nur innerhalb einer ganz bestimmten Mikroumgebung bestimmte T-Zellsubpopulationen stimuliert würden. Diese Hypothese wird bereits in einigen Reviews und Arbeiten diskutiert [Kuiper, H.M. et al., 1995, Liu, Y. and Linsley, P.S., 1992, Palmer, E.M. and van Seventer, G.A., 1997]. Andererseits ähneln bestimmte Aspekte des ICOS Zytokinmusters auch den Effekten, die durch andere kostimulatorische Moleküle erzielt werden. So bewirkt das CD27 Molekül z.B. keine IL-2 Sekretion, aber eine starke IFN-gamma Sekretion [Kobata, T. et al., 1994, Sunder-Plassman, R. et al., 1995]. Eine ähnlich starke Wirkung auf die IFN-gamma Sekretion hat auch das SLAM Molekül (Signaling Lymphocytic Activation Molecule) [Aversa, G. et al.,1997, Cocks, B.G. et al., 1995].

Es ist durch diese Untersuchungen außerdem deutlich geworden, daß die Kostimulation durch das ICOS Molekül die T-Zellen nicht in eine bestimmte Differenzierungsrichtung lenkt. Die Kostimulation via ICOS induziert kein Zytokinmuster das typisch wäre für eine zellvermittelte Immunantwort im Sinne einer T-Helfer Typ 1 Antwort (Th1 Antwort) oder einer verstärkt humoral/antiparasitisch ausgerichteten Reaktion im Sinne einer T-Helfer Typ 2 Antwort (Th2 Antwort). Dies wird von einigen Molekülen, in einigen Studien berichtet [Del Prete, G. et al., 1995, Freeman, G.J. et al., 1995, King, C.L. et al., 1995, Palmer, E.M. and van Seventer, G.A., 1997, Shanafelt, M.C. et al., 1995]. Diese Befunde werden jedoch auch kontrovers diskutiert [Corry, D.B. et al., 1994, Levine, B.L. et al., 1995, Tivol, E.A. et al., 1996]. Einerseits ist es nicht ausgeschlossen, daß solche Effekte auch für das ICOS Molekül beobachtet werden könnten, wenn die Stimulationsbedingungen ähnlich gewählt würden, wie in den zitierten Arbeiten. Andererseits ist es auch möglich, daß das ICOS Molekül eher Zellen stimuliert, die noch nicht den Th1 oder Th2 Pfad beschritten haben, bzw. vielleicht auch gar nicht weiter differenzieren können, da ihnen das dafür notwendige IL-2 fehlt. Oder aber die Stimulation durch das ICOS Molekül stimuliert zwei Subpopulationen von Zellen, von denen die eine IFN-gamma sezerniert, die andere IL-4 und IL-5. Diese Hypothesen, die einander nicht vollkommen ausschließen, werden in Zukunft durch spezifischere Experimente, die die Zytokinsekretion beleuchten, möglicherweise auch auf Einzelzellniveau, untersucht werden müssen, um die Funktion des ICOS Moleküls bei der Immunantwort in vivo besser verstehen zu können.

Die oben angeführten Befunde einer präferentiellen Stimulation von Th1 oder Th2 Zellen, bzw. der


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Induktion des einen oder anderen Entwicklungswegs werden in vielen Arbeiten als Erklärung angeführt, warum eine Vielzahl von kostimulatorischen Molekülen exprimiert wird [Liu, Y. and Linsley, P.S., 1992]. Ausgehend von den bis jetzt erzielten Ergebnissen bezüglich der Kostimulation durch das ICOS Molekül kann dieser Befund nicht herangezogen werden, um die Notwendigkeit für Existenz des ICOS Moleküls zu erklären. Es zeigte sich, daß bezüglich der Proliferation, der Heraufregulation von CD25 und CD40L und der Immunglobulinsekretion (s. 5.2.2.1 bis 3) höchstens quantitative Unterschiede bezüglich der kostimulatorischen Wirkung von CD28 und ICOS bestehen. Beide Moleküle induzieren Proliferation, regulieren CD25 und CD40L herauf (für CD28 hier nicht gezeigt) und induzieren die Immunglobulinsynthese durch B-Zellen, wirken also qualitativ gesehen gleich. In den Bereichen geringerer anti-CD3 Ak Konzentration war die Wirkung des ICOS Moleküls zwar immer deutlich schwächer als die des CD28 Moleküls, was sich jedoch durch die, unter diesen Stimulationsbedingungen, geringe Expression des ICOS Moleküls selber erklären läßt.

Wie bereits angesprochen ist auch das induzierte Zytokinmuster nicht ICOS spezifisch; auch andere kostimulatorische Moleküle können ein solches Muster induzieren. Keiner der Befunde bezüglich der Kostimulation konnte also zeigen, daß an einem Punkt des Signalnetzwerks des Immunsystems nur die Stimulation über ICOS zu einem bestimmten Ergebnis führt. Somit zeigen diese Versuche wiederum eine Redundanz in der Funktion kostimulatorischer Moleküle. Sie können daher nicht dazu dienen zu erklären, warum gerade die Expression des ICOS Moleküls für den Organismus notwendig ist.

6.3 Die Blockade des ICOS Moleküls mit dem ICOS spezifischen monoklonalen Antikörper hat keinen Effekt auf die T-Zellinduzierte Immunglobulinsynthese

Viele Untersuchungen der letzten Jahre haben die essentielle Funktion der CD40-CD40L Interaktion für die Induktion der Immunglobulinsynthese und den Immunglobulinklassenwechsel zeigen können [Lederman, S. et al., 1992, Splawski, J. et al., 1993]. Einige der diesbezüglich gemachten Untersuchungen zeigen allerdings auch, daß noch andere Moleküle an dieser Regulation beteiligt sein müssen [Kwekkeboom, J. et al., 1994, MacLennan, I.C.M. et al., 1997, Nishioka, Y. and Lipsky, P.E., 1994]. Die Befunde der knock-out Mäuse und der Hyper-IgM Patienten zeigen außerdem, daß wenn die CD40/CD40L Interaktionen ausfallen, diese nicht von der Interaktion des CD28 Moleküls übernommen werden können, obwohl dieses ebenfalls eine wichtige Rolle im Keimzentrum spielt [Banchereau, J. et al., 1994, Kosco-Vilbois, M.H. et al., 1997]. Aufgrund der daraus entstehenden Notwendigkeit, andere Moleküle zu finden, deren Funktion diese Umstände erklärt und der überaus markanten, umschriebenen ICOS Expression in vivo, wurde untersucht, ob eines dieser anderen Moleküle das ICOS Molekül ist.

Obwohl die Interaktion zwischen T- und B-Zellen in dem benutzten System zweifelsohne zu blockieren war, da die Immunglobulinsynthese durch den anti-CD40 Ak stark unterdrückbar war, lösten die benutzten F(ab)2-Fragmente des anti-ICOS Antikörpers keinen Effekt aus. Da in Vorversuchen bestätigt wurde, daß die hergestellten F(ab)2-Fragmente spezifisch binden konnten, ist es eher unwahrscheinlich, daß der fehlende Effekt in der fehlenden Bindung des F(ab)2 Fragments an das ICOS Molekül begründet liegt. Möglich ist jedoch, daß der ICOS Ak zwar das ICOS Molekül bindet, jedoch an einem Epitop angreift, dessen Bindung die Interaktion zwischen dem ICOS Molekül und seinem natürlichen


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Liganden nicht blockiert. Eine andere mögliche Erklärung für diese Ergebnisse könnte darin liegen, daß die Interaktion des ICOS Moleküls mit seinem Liganden zwar eine wichtige Funktion im Rahmen der Induktion der Immunglobulinsynthese ausübt, daß aber in dem verwendeten System der Ligand des ICOS Moleküls nicht oder nicht ausreichend induziert wird. Dann wäre die Interaktion zwischen den beiden Molekülen nicht entscheidend an der in diesen Experimenten induzierten Immunglobulinsynthese beteiligt. Möglich ist auch, daß die Funktion des ICOS Moleküls in dem benutzten experimentellen System durch CD28 oder ein anderes Molekül kompensiert werden kann.

Schließlich darf nicht außer acht gelassen werden, daß die ICOS-ICOSL Interaktion möglicherweise keine Rolle für die Induktion der Immunglobulinsekretion darstellt. Zwar ist diese Funktion eine der auffälligsten, die in dem Kompartiment induziert wird, in dem eine starke ICOS Expression zu finden ist, dennoch besteht die Möglichkeit, daß die physiologische Funktion des ICOS Moleküls in anderen Bereichen liegt. Die Helle Zone des Keimzentrums ist zum Beispiel auch dadurch gekennzeichnet, daß hier ein relativ dichtes Netz von FDC vorhanden ist, die wichtige Signale sowohl für T- wie auch für B-Zellen liefern [Grouard, G. et al., 1995, , Koopman, G. et al., 1994, Kosco-Vilbois, M.H. et al., 1997, Liu, Y. and Arpin, C., 1997, McLennan, I.C.M., 1994]. Vielleicht exprimieren diese den ICOS Liganden und das ICOS/ICOSL Paar ähnelt somit dem erst kürzlich entdeckten TRANCE/TRANCEL (TNF-related activation-induced cytokine) bzw. RANK/RANKL Paar (Receptor Activator of NF-_B), die wesentlich an der Interaktion von dendritischen Zellen und T-Zellen beteiligt sind [Anderson, D.M. et al., 1997, Wong, B.R. et al., 1997]. Diese Möglichkeiten werden in Zukunft durch anders konzipierte Experimente überprüft werden müssen. Neben der genauen Ursache für die Nichtblockierbarkeit werden diese Experimente dann hoffentlich dazu beitragen die Auswirkungen der ICOS ICOSL Interaktion zu klären.

6.4 Die Langzeitstimulation über das ICOS Molekül führt zu einer drastisch reduzierten T-Zellantwort bei Restimulation

Eine Reihe von Arbeiten der letzten Jahre haben gezeigt, daß eine Erklärung für die Vielfalt der kostimulatorischen Moleküle darin liegen könnte, daß einige dieser Moleküle die Ansprechbarkeit der Zellen auf eine Restimulation positiv oder negativ verändern können [Damle, N.K. et al., 1992a, Fischer, H. et al., 1992, Wolf, H. et al., 1994]. Somit könnte durch aufeinanderfolgende Kostimulation durch unterschiedliche Moleküle, die T-Zellaktivierung und -funktion an verschiedenen Stationen ihrer Aktivierung und Differenzierung kontrolliert und gelenkt werden (z.B. in Kuiper, H.M. et al., 1995 diskutiert). Zudem scheint eine weitere wichtige Funktion der Kostimulation durch das CD28 Molekül zu sein, daß diese Kostimulation die Anergie verhindern kann, die durch Stimulation via den TZR in Abwesenheit von CD28 vermittelter Kostimulation eintritt. Neben CD28 scheint nur das HSA Molekül (Heat-stable Antigen) von allen bis jetzt bekannten kostimulatorischen Molekülen diesen Effekt vermitteln zu können [Liu, Y. and Linsley, P.S., 1992]. Es war somit interessant zu untersuchen, wie sich eine Prästimulation oder Restimulation mit ICOS Kostimulation auswirkt; ob diese den einen oder anderen der oben angesprochenen Effekte ebenfalls auslösen kann.

Es zeigten sich jedoch eher gegenteilige Effekte: Die Ansprechbarkeit der Zellen auf eine Kostimulation mit CD28, wie dies in Damle, N.K. et al., 1992a für andere kostimulatorische Moleküle gezeigt werden konnte, wurde durch eine Prästimulation mit ICOS nicht verbessert. Auch bezüglich der Ver


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hinderung von Anergie zeigte sich ein eher entgegengesetzter Effekt: Wurden die Zellen länger durch das ICOS Molekül stimuliert als die üblicherweise für die Proliferationsmessung veranschlagten drei Tage, so war ihre Antwort auf eine Restimulation via CD3 Molekül deutlich supprimiert. Diese Befunde entsprechen auf den ersten Blick gesehen einer Reihe von Arbeiten, die zeigen, daß die Induktion von Anergie nach einer initialen Stimulation der T-Zellen durch einen Mangel an IL-2 zustande kommt und daß sie durch IL-2 aufgehoben werden kann [Wolf, H. et al., 1994]. Die in Wolf, H. et al., 1994 vorliegenden Bedingungen und Ergebnisse stimmen mit den Experimenten zur Langzeitstimulation über das ICOS Molekül überein. Das ICOS Molekül scheint nicht in der Lage zu sein, signifikante Mengen von IL-2 zu induzieren (5.2.2.2.1), so daß durch Kostimulation via ICOS ein Milieu entsteht, in dem die Induktion von Anergie eintritt. Die Analyse der Zellviabilität vor der Restimulation zeigte jedoch eine andere mögliche Ursachen dieser Depression. Die Viabilität der mit ICOS kostimulierten Zellen lag signifikant niedriger als derjenigen Zellen, die nur mit CD3 Ak oder mit anderen Kostimuli stimuliert worden waren (s. Tabelle in 5.3.2). Durchaus ähnliche Befunde liegen auch für ICAM und VCAM vor, deren Kostimulation bei primären Zellen nach sechs Tagen ebenfalls zu einer Abnahme der Proliferation führt [Damle, N.K. et al., 1992b]. Die Kostimulation von Ag sensibilisierten Zellen über ICAM oder VCAM führt, analog zu den Ergebnissen für ICOS (allerdings nicht mit Ag sensibilisierten Zellen), zu einer starken Abnahme der Viabilität [Damle, N.K. et al., 1993]. Die in Abb. 18 gezeigte Depression der Zellproliferation scheint also nicht auf einen anergen Zustand zurückzuführen sein, sondern dadurch zu entstehen, daß die durch das ICOS Molekül stimulierten Zellen vermehrt absterben. Schließlich deutet darauf schon der Befund hin, daß die mit dem mAk F44 vorstimulierten Zellen bei einer Restimulation über das CD3 Molekül noch weniger Proliferation zeigen, als die durch zweimalige anti-CD3 Stimulation in ihrer Proliferation deutlich eingeschränkten Zellen (Abb. 18). Die in Abb. 18 und 19 gezeigten Befunde entsprechen letztlich den in Moskophidis, D. et al., 1993, Radvanyi, L.G. et al., 1993 und Wesselborg, S. et al.,1993 gezeigten Bedingungen und Befunden, daß nach einer initialen Proliferation Apoptose induziert werden kann. Auffällig ist jedoch der Unterschied, daß das ICOS Molekül, was sich bezüglich aller anderen bis jetzt untersuchten Parameter (Proliferation, Heraufregulation von Aktivierungsantigenen, Zytokinsekretion und T-Zellhilfe) deutlich als kostimulatorisches Molekül darstellte, die in Wolf, H. et al., 1994 dargestellten Befunde, daß kostimulatorische Agenzien Anergie durchbrechen können, nicht bestätigt. Im Gegenteil: durch das ICOS Molekül wird stärker noch als durch die Anergie verhindert, daß die so stimulierten Zellen auf einen zweiten Stimulus antworten, da sie vermehrt absterben.

Dieses Ereignis tritt allerdings nur bei der Prästimulation mit mAk F44 auf. Wird die Kostimulation durch anti-ICOS Ak bei der Restimulation von Zellen eingesetzt, die über den TZR anergisiert wurden (Abb. 17), so ist das Molekül in der Lage, wie alle anderen eingesetzten kostimulatorischen Agenzien, die Anergie aufzuheben. Ob die beobachtete Proliferationsdepression unter diesen Stimulationsbedingungen tatsächlich durch Anergie entsteht, muß noch durch Experimente geklärt werden, die diese Fragestellung spezifisch untersuchen. Die Langzeitstimulation über anti-CD3 Ak induziert jedenfalls keine signifikant stärkere Abnahme der Viabilität als bei den Zellen zu verzeichnen ist, die durch andere Kostimuli als ICOS kostimuliert wurden (s. Tabelle in 5.3.2). Und das Ergebnis, daß eine Restimulation via ICOS nach einer initialen anti-CD3 Stimulation, die Proliferationsdepression der Zellen rückgängig machen kann (5.3.1.), ist bezüglich der in 5.3.1.verwendeten Kostimuli identisch mit Versuchen


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in Wolf, H. et al., 1994. Dort wird die durch die kostimulatorischen Stimuli aufhebbare Proliferationsdepression als Verhinderung von Anergie interpretiert.

Es ist wahrscheinlich, daß der Effekt der Prästimulation durch ICOS (5.3.2) abhängig von der Zeitdauer der erfolgten Kostimulation ist, was sich auch im mikroskopischen Aussehen der Zellen widerspiegelte, die erst nach drei bis vier Tagen deutlich an Viabilität verloren. Diese Annahme müßte allerdings noch direkt überprüft werden, indem die über ICOS kostimulierten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten mit anti-CD3 Ak restimuliert werden. Ob es sich bei dem beobachteten Viabilitätsverlust tatsächlich um die Induktion von Apoptose handelt, muß detailliert durch die Untersuchung Apoptose spezifischer Parameter, wie DNA-laddering, untersucht werden. Die mikroskopische Untersuchung der mit mAk F44 kostimulierten Zellen zeigte jedoch neben der Abnahme der Viabilität, "membrane-blebbing" und apoptotische Vesikel (nicht dargestellt), so daß diese Befunde diese Annahme eher stützen. Auch erste Untersuchungen des Zellzyklus der durch ICOS vorstimulierten Zellen im Vergleich zu den Zellen, die nur über anti-CD3 Ak stimuliert wurden, zeigen Ergebnisse, die nahezu identisch zu denen in Radvanyi, L.G. et al., 1993 sind, was im Hinblick auf die dort gemachten Aussagen ebenfalls darauf hindeutet, daß durch eine Langzeitstimulation über das ICOS Molekül Apoptose induziert wird. Darüber hinaus sind die Ergebnisse zur Restimulation über ICOS relevant für die von Wolf,H. et al., 1994 aufgestellte Hypothese zur Verhinderung von Anergie. Wolf et al. postulieren, daß ein kostimulatorisches Molekül, das Anergie verhindern kann, dies unabhängig davon erreicht, ob die Stimulation über das kostimulatorische Molekül in der ersten oder der zweiten Phase der Stimulation erfolgt. Die in 5.3 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß diese Hypothese für das ICOS Molekül im Gegensatz zum CD28 Molekül nicht zutrifft. Nur die Restimulation via ICOS hebt die induzierte „Nichtansprechbarkeit“ auf, die Prästimulation via ICOS verstärkt diesen Zustand eher noch.

Zusammengenommen lassen die beiden Ansätze (5.3.1 und 5.3.2) eher den Schluß zu, daß die längere Vorstimulation und die dadurch induzierten Signalwege darüber entscheiden, welche Richtung eine Zellpopulation einschlägt. Solange die Vorstimulation bei allen Zellpopulationen gleich erfolgte, reagieren die Zellen auf eine zweite Stimulation zwar weniger stark, aber eine Kostimulation bewirkt bei ihnen ausnahmslos eine Steigerung der Proliferation. Die Vorstimulation über die verschiedenen kostimulatorischen Moleküle führt jedoch zu sehr unterschiedlichen Effekten. Auch in Lynch, D.H. et al., 1995 wird darauf hingewiesen, daß kostimulatorische Moleküle den durch Fas induzierten Zelltod positiv oder negativ beeinflussen können. Während durch die Langzeitprästimulation via anti-CD3 Ak Anergie ausgelöst wird, die durch das ICOS Molekül aufgehoben werden kann (5.3.1), so scheint eine Langzeitprästimulation durch das ICOS Molekül selber, Apoptose auszulösen (5.3.2). Das ICOS Molekül ist also in der Lage, einander entgegengesetzte Effekte zu induzieren. Dies und die oben beschriebenen Ergebnisse deuten an, daß kostimulatorische Moleküle die Richtung, die eine T-Zelle am Scheideweg zwischen Anergie und Aktivierung einschlägt, unterschiedlich lenken können und zwar abhängig von den gerade herrschenden Bedingungen, bzw. den Bedingungen, die sich nach ihrer Wirkung einstellen.

Die in 5.3.1 und 5.3.2 dargestellten Befunde lassen sich gut mit einer Reihe von Arbeiten vereinbaren, die die Bedingungen der Induktion von Apoptose und Anergie genauer untersucht haben Dabei wird in vielen Arbeiten allerdings nur die meßbare „Nichtansprechbarkeit“ der Zellen analysiert, nicht aber,


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ob dieser ein verstärkter Zelltod zugrunde liegt. Die Differenzierung in „Apoptose“ und „Anergie“ ist also nicht immer vorhanden. Die gemachten Befunde müssen somit z.T. auf beide Phänomene bezogen werden. Zum einen haben diese Arbeiten gezeigt, daß die Induktion der Apoptose, die in den meisten Arbeiten durch Stimulation und Restimulation über den TZR induziert wird, die Aktivierung der Zellen und einen gewissen Zwischenzeitraum voraussetzt, um über die Ligation des CD95 Moleküls (welches konstitutiv exprimiert wird) durch das CD95L Molekül (welches aktivierungsabhängig induziert werden muß) zum sogenannten „AICD“ (einem nur nach Aktivierung der Zellen induzierbaren Zelltod) zu führen [Alderson, M.R. et al., 1995, Dhein, J. et al., 1995, Ju., S.-T., et al., 1995, Klas, C. et al., 1993]. Diese aktivierungsabhängige Zelldepression läßt sich auch in vivo nachweisen, wobei Apoptose oder Anergie nicht in allen Fällen durch Ligation von CD28 verhindert werden [Damle, N.K. et al., 1993, Friccius, H. et al., 1993]. Die Ursachen dafür, daß die Ligation des T-Zellrezeptors in einigen Fällen zu Anergie oder zum programmierten Zelltod führt, in anderen Situationen jedoch zu einer T-Zellproliferation, sind noch relativ unklar [Krammer, P.H., 1994]. Viele Autoren schlagen Modelle vor, die davon ausgehen, daß je nach Stimulation unterschiedliche Stärken der T-Zelldepression induziert werden [Arnold, B. et al., 1993, Schwartz, R.H., 1990]. Diese unterschiedliche "Tiefe" der Depression führt u.U. dazu, daß es unter bestimmten Bedingungen möglich ist, die erzeugte Anergie rückgängig zu machen, unter anderen Bedingungen jedoch nicht. Die Reversibilität der Anergie stellt nämlich ein ebenfalls kontrovers diskutiertes Thema dar über das noch keine einheitliche Meinung existiert [Schwartz, R.H., 1990], weshalb die obige These, daß die Restimulation via ICOS die erzeugte Anergie durchbrechen kann, keine definitive Erklärung der Ergebnisse darstellen kann. Auch die Rolle der Zytokine, insbesondere von IL-2, aber auch von IL-4 und IFN-gamma ist noch nicht abschließend geklärt. Einige Arbeitsgruppen stellen fest, daß Apoptose oder Anergie von bestimmten Zytokinen abhängig ist bzw. nur durch die Zytokine induziert werden können. Andere finden, daß diese Phänomene von Zytokinen unbeeinflußt bleiben. Entsprechend kontrovers wird die Rolle der Zytokine diskutiert [Boise, L.H. et al., 1995, Boussiotis, V.A. et al., 1996, Damle, N.K. et al., 1993, Essery, G. et al., 1988, Fournel, S. et al., 1996, Liu, Y and Janeway, C.A., 1990, Soares, L.R.B. et al., 1997, Wolf, H. et al., 1994]. Deshalb eignen sich die hier gemachten Befunde zur Kostimulation via IL-2 wohl auch nur bedingt zum Vergleich mit den Effekten, die durch Kostimulation via das ICOS Molekül ausgelöst wurden. Hinzu kommen auch noch die in 5.3.2 bereits analysierten Unterschiede innerhalb dieser beiden Zellpopulationen. Wie in Tabelle 1 eindrucksvoll zu sehen ist, verhält sich die Viabilität der durch ICOS bzw. IL-2 vorstimulierten Zellen völlig entgegengestzt. Es ist wahrscheinlich, daß die durch Kostimulation via IL-2 induzierte Proliferationsdepression eine andere Grundlage hat als diejenige, die durch ICOS induziert wird. Die Analyse der Kostimulation via IL-2 stellte jedoch nicht das Ziel der Arbeit dar. Somit kann bezüglich der Rolle der Zytokine hier nur konstatiert werden, daß ihre Anwesenheit nicht alleine festlegen kann, wie sich eine T-Zelle nach ihrer Aktivierung differenziert. Schließlich sollte in der Zellpopulation, die mit CD28 vorstimuliert wurde, IL-2 induziert worden sein. Diese Zellen reagieren auf Restimulation mit anti-CD3 Ak jedoch anders als die Zellen, denen in der Vorstimulationsphase IL-2 hinzugefügt wurde (Abb. 19). Dennoch müßte aufgrund der dargestellten Ergebnisse überprüft werden, ob die Zugabe von IL-2 zu Beginn der Prästimulation über ICOS die Zellviabilität als „extrinsic survival factor“ [Boise, L.H. et al., 1995] verbessern kann oder ob die durch ICOS induzierten Effekte vollkommen unabhängig von Zytokinen induziert werden. Gegen die völlige

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Unabhängigkeit von Zytokinen spricht der Befund, daß eine Restimulation mit IL-2 die Proliferationsdepression, die durch ICOS hervorgerufen wird, aufheben kann. Diese Befunde entsprechen denen in Wolf, H. et al., 1994. Die Reversibilität der Proliferationsdepression durch IL-2 könnte jedoch auch dahingehend interpretiert werden, daß nicht alle Zellen durch ICOS Kostimulation apoptotisch werden und die überlebenden Zellen durch die Stimulation via IL-2 in der zweiten Stimulationsphase vermehrt zur Proliferation angeregt werden.

In vielen der oben zitierten Arbeiten wurde die Anergie oder Apoptose in T-Zellklonen oder in sogenannten „short-term lines“ induziert, denen gemeinsam ist, daß sie eine gewisse Zeit Kontakt mit APCs hatten. In Damle, N.K. et al., 1993 und Radvanyi, L.G. et al., 1993 wird dieses Phänomen gezielt analysiert und der Schluß gezogen, daß für die Induktion der Apoptose der Kontakt der T-Zellen mit APC notwendig ist. Dabei ist die Notwendigkeit dieses T-Zell-APC Kontakts für die Induktion der Apoptose via CD95-CD95L Interaktion nicht gegeben, da dieser Signaltransduktionsweg durch benachbarte T-Zellen ausgelöst werden kann [Dhein, J. et al., 1995]. Andere Zell-Zellkontaktabhängige Mechanismen scheinen für diesen Effekt verantwortlich zu sein [Radvanyi, L.G. et al., 1993]. Aufgrund der beschriebenen Ergebnisse bezüglich des ICOS Moleküls und den oben beschriebenen Charakteristika der Apoptose ist es verlockend davon auszugehen, daß das ICOS Molekül und sein Ligand dieser Kontaktabhängigkeit zugrunde liegen. Dafür sprechen folgende Befunde: Das ICOS Molekül wird nach T-Zellaktivierung induziert. Die, in den hier dargestellten Experimenten, gemachten Befunde zeigen ähnlich wie in Damle, N.K. et al., 1992b und Wesselborg, S. et al., 1993, daß die Zellen nach (ICOS-) Stimulation zunächst proliferieren, dann aber ihre Viabilität verlieren. Trotz möglicher CD28/B7 Interaktion, (über APC oder über B7 Expression der Nachbar T-Zellen [Azuma, M. et al., 1993]) kommt es in einigen der oben zitierten und weiteren Arbeiten (z.B. in Damle, N.K. et al., 1993) nicht zur Verhinderung der Apoptose. Einige Arbeiten zeigen außerdem, daß nur eine maximale Stimulation über den TZR die Apoptose induzieren konnte [Radvanyi, L.G. et al., 1993, Wolf, H. et al., 1994], was sich im Hinblick auf ICOS dadurch erklären ließe, daß nur eine starke T-Zellrezeptorstimulation in der Lage ist, die Expression von ICOS so zu induzieren, daß es seine „Apoptose induzierende“ Funktion ausüben kann.

Analog zu CTLA-4 (Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4) [Boussiotis, V.A. et al., 1996, Perez, V.L., 1997, Waterhouse, P. et al., 1996] und FasL [Krammer, P.H. et al., 1994, Lynch, D.H. et al., 1995] könnte das ICOS Molekül somit ein zweites Molekül darstellen, das in der Lage ist, eine entscheidende Rolle in der Regulation der T-Zellimmunantwort zu spielen. T-Zelltoleranz wird durch verschiedene Mechanismen erzeugt: Deletion im Thymus, Anergie und Apoptose in der Peripherie. Das ICOS Molekül könnte entscheidende Weichen für Anergie oder Apoptose stellen. Folgende Vorgänge könnten dabei entscheidend sein: Eine hohe Dosis von Ag, wie im Falle der Reaktion einer T-Zelle mit Selbst-Ag z.B., könnte unter zur Induktion des ICOS Moleküls führen. Die daran anschließende Ligation des ICOS Moleküls könnte entweder die Dichte der Expression von CD95L induzieren, die für die Apoptoseinduktion notwendig ist (Vorversuche haben gezeigt, daß die Zellen nach einer Prästimulation mit ICOS stark FasL+ werden) oder die T-Zelle für die Interaktion von CD95 mit CD95L empfindlich machen. Oder aber durch das ICOS Molekül wird ein dritter Mechanismus (neben der Fas/FasL Interaktion und dem durch CTLA-4 ausgelösten Signal) induziert, der zum Zelltod führt. Durch diese Interak


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tion könnte dann diese unerwünschte, autoreaktive Immunreaktion terminiert werden. Auf der anderen Seite würde eine geringe Konzentration von Ag, wie dies eher bei exogenem Ag vorzufinden ist, die CD28/B7 Interaktion bevorzugen, so daß es durch die Induktion von extrinsischen und intrinsischen Überlebensfaktoren [Boise, L.H. et al., 1995, Bousiotis, V.A. et al., 1995, Noel, P.J. et al., 1996a] zu einer klonalen Expansion der T-Zellen käme. Für dieses Modell spricht auch, daß IL-2 die Herunterregulation von CD28 verhindern kann [Friccius, H. et al., 1993]. Durch Kostimulation via ICOS entstünde also eine Situation, in der die Herunterregulation von CD28 eher begünstigt wäre, da durch Kostimulation via ICOS kein IL-2 induziert wird. Andererseits lassen die gemachten Befunde auch die Möglichkeit zu, daß unter Bedingungen, durch die die Herunterregulation von CD28 verhindert wird, die via ICOS auf Apoptose programmierten Zellen durch die CD28-B7 Interaktion vor der Apoptose geschützt werden. Die in 5.3.3 dargestellten Versuche zeigen, daß eine Restimulation der Zellen, die mit ICOS vorstimuliert wurden, durch CD28, IL-2 oder PMA die Induktion der Apoptose verhindern kann. Die Kostimulation über zunächst ICOS und dann anschließend CD28 kann also dazu führen, daß die T-Zellen zwei aufeinanderfolgende Expansionsstimuli bekommen. Diese doppelte Expansion ist in vivo u.U. nötig, um die anfänglich sehr kleine Ag spezifische T-Zellpopulation so zu expandieren, daß sie überhaupt in der Lage ist, die entscheidenden Schritte der Immunabwehr zu dirigieren. Das Schicksal der aktivierten T Zellen würde also entscheidend durch eine Reihe von Faktoren bestimmt:

  1. Über die Konzentration an stimulierendem Ag
  2. Über die Expressionsdichte und Affinität der kostimulatorischen Moleküle
  3. Über die Dauer der Kostimulation
  4. Über den durch vorherige Stimulation induzierten Aktivierungsstatus der T-Zelle.

Die in dieser Diskussion angesprochenen Ergebnisse lassen es möglich erscheinen, daß das ICOS Molekül einerseits zusammen mit CTLA-4 einen Gegenpart zu CD28 übernehmen kann. Andererseits lassen sich einige der Ergebnisse auch dahingehend interpretieren, daß das ICOS Molekül synergistisch mit der CD28 Funktion wirkt. Die genauen Umstände dieser entgegengesetzten Funktionen werden in Zukunft noch determiniert werden müssen.

Die Vielfalt und teilweise Redundanz [Boriello, F. et al., 1997, Boussiotis, V.A. et al., 1996, Lenschow, D.J. et al., 1996] der Interaktionen zwischen den Molekülen in der Ig-Superfamilie läßt es nicht unmöglich erscheinen, daß zusätzlich zu CD28 und CTLA-4 und zu B7-1, -2 und möglicherweise -3 [Azuma, A. et al., 1993, Boriello, F. et al., 1997, Lenschow, D.H. et al. 1996, Linsley, P.S. and Ledbetter, J.A., 1993] ein weiteres Molekül existiert, daß entscheidend an der negativen und der positiven Kontrolle der T-Zellaktivierung beteiligt ist. Dafür sprechen auch die Befunde im Maussystem, die zeigen, daß nicht alle T-Zellfunktionen durch genetische Deletion dieser Faktoren verloren gehen [Ding, L. et al., 1995, Lane, P. et al., 1994, Lucas, P.J. et al., 1995, Ronchese, F. et al., 1994, Shahinian, A. et al., 1993]. Die T-Zellaktivierung, insbesondere die Initiation der Aktivierung, scheint in die


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sen Fällen von anderen kostimulatorischen Molekülen übernommen werden zu können. Die Funktion des CD28 Moleküls scheint v.a. zu einem späteren Zeitpunkt der T-Zellaktivierung essentiell und die frühe T-Zellaktivierung auch ohne CD28 möglich zu sein [Lane, P. et al., 1994, Lucas, P.J. et al., 1995, Mittrücker, H.-W. et al., 1996, Zhang, Y.-Q. et al., 1997]. Auch in einigen in vitro Kultursystemen konnte eine CD28 unabhängige kostimulatorische Aktivität demonstriert werden [Ding, L. and Shevach, E.M., 1996]. Interessant sind diese Befunde v.a. im Hinblick auf das Vorliegen einer Subpopulation von T-Zellen, die kein CD28 exprimieren. Diese Subpopulation ist auch in gesunden Individuen zu finden. Studien mit diesen Zellen deuten an, daß die Aktivierung dieser Zellen über andere, noch nicht bekannte kostimulatorische Moleküle erfolgen muß [Behar, B.S.M. et al., 1995], wobei sich für diese Funktion das ICOS Molekül anbietet. Medizinisch relevant ist dies insbesondere, da bei einigen Autoimmunerkrankungen diese Population von Zellen stark expandiert ist [Nafaguchi, H. et al., 1994, Park, W. et al., 1997]. Dies ist v.a. insofern interessant, da durchflußzytometrische Analysen von Synovialflüssigkeit einiger rheumatoider Arthritispatienten eine ICOS Expression der T-Zellen andeuten, wenn auch weitere Analysen notwendig sein werden, um diese Tatsache befriedigend und statistisch valide zu interpretieren. Auch der starken Expansion von CD28- Zellen in HIV-Patienten und der verstärkten Induktion von AICD bei diesen Patienten [Groux, H. et al., 1992, Meeyard, L. et al., 1992, Saukonnen, J.J. et al., 1993], die bis jetzt durch das Vorliegen unbekannter kostimulatorischer Moleküle erklärt wurde, könnte eine Expansion durch Kostimulation via ICOS zugrunde liegen. Diese Kostimulation würde analog zu den in 5.3.2 gezeigten Befunden aufgrund des Fehlens von CD28 durch alleinige Wirkung des ICOS Moleküls zu einer Proliferation mit anschließender Apoptose führen.

Momentan ist es therapeutisch nur möglich, die Immunantwort unselektiv zu verstärken oder zu drosseln, was eine Reihe von Problemen mit sich bringt, wie z.B. die erhöhte Infektionsgefahr von Patienten, die aufgrund von Transplantationen oder Autoimmunerkrankungen immunsupprimiert werden müssen. Es besteht große Hoffnung, daß es durch die Manipulation der Kostimulation in Zukunft möglich sein wird, die Immunantwort selektiv zu beeinflussen. Dadurch wäre es z.B. möglich eine gezielte Verstärkung der Immunantwort gegenüber Tumoren , bzw. eine spezifische Toleranz gegenüber Transplantaten zu erreichen. Diese Ansätze werden für einige kostimulatorische Moleküle bereits durch in vivo Studien untersucht [Boussiotis, V.A. et al., 1994, Judge, T. et al., 1996, Lane, P., 1995, Melero, I. et al, 1997, Tivol, E.A. et al., 1996]. Träfe die oben vorgestellte These zur Funktion des ICOS Moleküls zu, so wäre mit der Entdeckung des ICOS Moleküls ein weiteres Molekül gefunden, dessen Manipulation potentiell eine große Rolle bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Transplantationen und Neoplasien spielen könnte.

Letztlich darf allerdings auch nicht außer acht gelassen werden, daß die hier gemachten Befunde eine artifizielle in vitro Situation darstellen. Sie lassen nur sehr bedingt Rückschlüsse auf die in vivo ablaufenden Interaktionen zu. Nur gezielte Modulationen der Expression des ICOS Moleküls in in vivo Modellen werden analysieren können, inwiefern die hier gemachten Befunde den Effekten der ICOS Funktion in vivo entsprechen. Dort stellt das ICOS Molekül einen winzigen Teilbestandteil eines komplexen Netzwerks von löslichen und membranständigen Molekülen dar, deren Funktion wesentlich von Interaktionen zwischen den verschiedenen Bestandteilen abhängt, so daß die isolierte Betrachtung des ICOS Moleküls u.U. zu Ergebnissen führt, wie sie in vivo gar nicht entstehen können.


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Auf jeden Fall deuten die in vitro gemachtenBefunde einige grundlegende Funktionen des ICOS Moleküls an: Das ICOS Molekül funktioniert nicht nur als aktivierendes Molekül, sondern scheint auch eine abschaltende Funktion zu besitzen. Jede Immunantwort in vivo muß nach einem gewissen Zeitraum beendet werden, da die permanente Aktivierung des Immunsystems für den Organismus letal ist. Dies konnte eindrucksvoll durch die CTLA-4 knock-out Mäuse gezeigt werden. Bei diesen Mäusen führt der Ausfall des abschaltenden Moleküls CTLA-4 innerhalb weniger Wochen zum Tod der Tiere [Waterhouse, P. et al., 1996]. Auch das ICOS Molekül scheint eine wichtige Abschaltfunktion induzieren zu können. Wenngleich dieser Befund in vitro gemacht wurde, ist davon auszugehen, daß das ICOS Molekül durch diese Eigenschaft ein für das Überleben des Organismus essentielles Molekül darstellt. Weiterführende Untersuchungen zur Aufklärung der exakten Funktion des ICOS Moleküls werden dazu beitragen das Immunsystem noch besser zu verstehen und auf der Basis dieses Verständnisses therapeutische Eingriffe durchführen zu können.
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