Dittrich, Anna-Maria: Induktionsbedingungen und kostimulatorische Effekte von ICOS - einem neuen T-Zellspezifischen Oberflächenantigen

Aus dem Robert-Koch-Institut
Molekulare Immunologie


Dissertation
Induktionsbedingungen und kostimulatorische Effekte von ICOS - einem neuen T-Zellspezifischen Oberflächenantigen

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Anna-Maria Dittrich ,
aus Göttingen

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
Prof. Dr. R.A. Kroczek
Prof. Dr. A. Radbruch
Prof. Dr. A. Ziegler

Datum der Promotion: 15.01.01

Zusammenfassung

Das Ergebnis einer T-Zellmediierten Immunantwort ist von der Signalvermittlung durch kostimulatorische Moleküle abhängig. Diese kostimulatorischen Moleküle sind - neben dem spezifischen Antigen - notwendig für eine vollständige T-Zellaktivierung, die es der T-Zelle erlaubt zu proliferieren, neue Oberflächenantigene zu exprimieren und Zytokine zu sezernieren. Ohne das kostimulatorische Signal wird die T-Zelle anerg oder sogar apoptotisch, eine effektive Immunantwort ist dann nicht möglich. Die vorliegende Dissertationsschrift enthält die initiale Beschreibung eines neuen kostimulatorischen Moleküls, eine umfangreiche Charakterisierung seiner Expression in vitro, sowie seiner Funktion. Das Molekül "ICOS" (ICOS steht für inducible costimulator) ist ein T-Zellspezifisches Molekül und weist eine große Homologie zu dem Prototyp eines kostimulatorischen Moleküls, dem CD28 Molekül auf.

Die Experimente, die zur Charakterisierung der Induktionsbedingungen des ICOS Moleküls durchgeführt wurden, zeigen, daß die Expression des ICOS Moleküls sehr schnell nach T-Zellaktivierung induziert wird, die Expressionsstärke innerhalb von Stunden stark heraufreguliert wird und die Expression lange (mindestens 96h) auf der T-Zelloberfläche zu detektieren ist. Ein Vergleich mit anderen aktivierungsabhängigen T-Zelloberflächenmolekülen zeigt eine ICOS-spezifische Zeitkinetik der Expression, die durch verschiedene T-Zellstimuli zu induzieren ist. Eine optimale Expression des Moleküls ist zwei-signalabhängig und durch Cyclosporin A blockierbar.

Bezüglich der Funktion von ICOS wurde die Wirkung der Kostimulation via ICOS auf eine Reihe von kritischen Parametern der T-Zellaktivierung analysiert. Durch die Kostimulation mit einem ICOS-spezifischen Antikörper wird konzentrationsabhängig die T-Zellproliferation induziert, unabhängig davon, ob das ersten Signal via CD3 oder via einen löslichen Stimulus, wie PHA erfolgte. Die ICOS Kostimulation bewirkt die Hochregulation von typischen T-Zellaktivierungsantigenen und sie induziert oder verstärkt die Sekretion zahlreicher Lymphokine. Die verstärkende Wirkung auf alle diese Parameter der T-Zellaktivierung führt schließlich dazu, daß die über ICOS kostimulierten Zellen in der Lage sind T-Zellhilfe für B-Zellen zu leisten, so daß diese Immunglobuline sezernieren.

Wurde versucht, die direkte Interaktion des ICOS Moleküls mit seinem potentiellen Liganden bei der T-Zellinduzierten Immunglobulinsekretion durch den mAk F44 zu blockieren, so zeigte sich kein Effekt.

Bei Langzeitkostimulation via ICOS zeigte sich allerdings, daß die Kostimulation durch das ICOS Molekül auch in der Lage ist, die T-Zellaktivierung negativ zu beeinflussen: Die Langzeitstimulation via ICOS erzeugt eine deutliche Proliferationsdepression und einen Viabilitätsverlust der T-Zellen.

Insgesamt lassen diese Ergebnisse den vorsichtigen Schluß zu, daß das ICOS Molekül eine wichtige Rolle an der Schnittstelle zwischen Expansion und Effektorfunktion einerseits und Depression der T-Zellen andererseits spielt.

Schlagwörter:
T-Zelle, ICOS, Kostimulation, T-Zellaktivierung

Abstract

The outcome of T-cell resonses after T-cell encounter with specific antigens is modulated by co-stimulatory signals, which are required for both lymphocyte activation and development of adaptive immunity. Here I report the initial characterization of a novel co-stimulatory molecule which enhances all basic T-cell functions and displays a unique induction and expression pattern. ICOS (for inducible co-stimulator) is a T-cellspecific activation antigen with high homology to CD28, the prototype of a co-stimulatory molecule.

Analysis of induction requirements for ICOS expression revealed a two-signal dependency and cyclosporine A sensitivity. ICOS' expression kinetics are unique when compared with other early T-cell activation antigens. ICOS is induced very quickly on the T-cell surface and is rapidly upregulated following T-cell activation. The surface expression of ICOS is surprisingly prolonged - lasting at least 96 hours - considering its rapid induction kinetics.

Stimulation via an ICOS-specific monoclonal antibody enhances all basic T-cell functions such as proliferation, upregulation of molecules that medicate cell-cell interaction, secretion of lymphokines and effective help for antibody secreting B-cells. Costimulation via ICOS is effective regardless of the route of action of the first signal (immobilized or soluble).

Blockade of the ICOS interaction with its presumed ligand on B-cells does not inhibit immunoglobulin production by these B-cells, though.

Finally long-term stimulation experiments reveal a possible negative role for ICOS in regulating T-cell responses.

These results indicate that ICOS is a major regulator of the adaptive immune system determining the healthy balance of negative and positive signaling during T-cell activation and differentiation.

Keywords:
T-cell, T-cell activation, ICOS, Co-stimulatory molecule


Seiten: [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [79]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteInduktionsbedingungen und kostimulatorische Effekte von ICOS - einem neuen T-Zellspezifischen Oberflächenantigen
Danksagung
1 Verwendete Begriffe und Abkürzungen
2 Einleitung
3 Aufgabenstellung
4 Material und Methoden
4.1 Materialien und Reagenzien
4.1.1 Reagenzien für ELISAs
4.1.1.1Antikörper
4.1.1.2Standards
4.1.2 Antikörper und Sekundärreagenzien für die Durchflußzytometrie
4.1.2.1 Antikörper
4.1.2.2 Sekundärreagenzien und -antikörper:
4.2 Zellpräparation
4.2.1 Zellzählung
4.2.2 Präparation von „Nylon-T-Zellen“
4.2.3 Aufreinigung von CD4+,CD8- bzw. CD8+ T-Zellen
4.2.4 Mitomycin-Behandlung
4.2.5 Präparation von tonsillären B-Zellen
4.2.5.1 Aufreinigung von tonsillären B-Zellen
4.2.5.2 Präparation einer Schafserythrozytensuspension für die Depletion von T-Zellen
4.3 Stimulation von Zellen
4.3.1 Stimulation von T-Zellen
4.3.1.1 Stimulation mit PMA und/oder Ionomycin
4.3.1.2 Stimulation mit PHA P
4.3.1.3 Stimulation durch immobilisierte Antikörper
4.3.2 Stimulation von B-Zellen
4.4 Proliferationsassay
4.5 Enzymimmunoassays (ELISA) zur Bestimmung von löslichen Proteinen im Zellkulturüberstand
4.5.1 Standardprotokoll eines Sandwich-ELISA
4.5.2 Abweichungen vom Standardprotokoll bei den anderen ELISAs
4.6 Durchflußzytometrie
4.6.1 Anfärbung der Zellen
4.6.2 Analyse der angefärbten Zellen
4.7 Herstellung und Analyse von F(ab)2 Fragmenten
5 Ergebnisse
5.1Untersuchung der Induktionsbedingungen des ICOS Moleküls auf T-Lymphozyten
5.2Kostimulatorische Effekte des ICOS Moleküls
5.2.1Konzentrationsabhängigkeit der kostimulatorischen Wirkung auf die Proliferation
5.2.2Wirkung der Kostimulation durch das ICOS Molekül auf andere T-Zellaktivierungsparameter
5.2.2.1Wirkung auf die Expression anderer Oberflächenaktivierungsantigene am Beispiel von CD25 und CD40L
5.2.2.2Wirkung der Kostimulation durch das ICOS Molekül auf die Zytokinsekretion
5.2.2.2.1Auswirkungen auf die IL-2 Sekretion
5.2.2.2.2Auswirkungen auf die IL-4 Sekretion
5.2.2.2.3Auswirkungen auf die IL-5 Sekretion
5.2.2.2.4Auswirkungen auf die IFN-gamma Sekretion
5.2.2.2.5Auswirkungen auf die ATAC Sekretion
5.2.2.3Wirkung der Kostimulation durch das ICOS Molekül auf die durch T-Zellen induzierte Immunglobulin Sekretion von B-Zellen
5.2.2.4Blockade der Interaktion des ICOS Moleküls mit seinem potentiellen Liganden
5.2.3Kostimulation durch das ICOS Molekül bei Initialstimulation über lösliche Stimuli
5.3Langzeitstimulation über das ICOS Molekül
5.3.1Differentielle Stimulation in der zweiten Phase-Restimulation über das ICOS Molekül
5.3.2Differentielle Kostimuli in der ersten Stimulationsphase - Langzeitstimulation über das ICOS Molekül
5.3.3Differentielle Kostimulation in der ersten und in der zweiten Stimulationsphase
6 Diskussion
6.1 Die Expression des ICOS Moleküls ist abhängig von zwei Signalen
6.2 Das ICOS Molekül hat kostimulatorische Wirkungen auf viele Parameter und induziert durch Kostimulation ein ICOS spezifisches Muster an Effekten
6.3 Die Blockade des ICOS Moleküls mit dem ICOS spezifischen monoklonalen Antikörper hat keinen Effekt auf die T-Zellinduzierte Immunglobulinsynthese
6.4 Die Langzeitstimulation über das ICOS Molekül führt zu einer drastisch reduzierten T-Zellantwort bei Restimulation
7 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Der Wachstumsfaktor steht für die Vervielfachung der ursprünglich eingesetzten Zellzahl, wobei die toten Zellen nicht einberechnet wurden (Ausschluß via Trypanblaufärbung). 200 000 CD4+-Zellen wurden pro Loch in einer 24-Loch Platte stimuliert. Der anti-CD3 Ak, anti-ICOS Ak und anti-CD28 Ak wurden auf den Platten immobilisiert, die löslichen Stimuli zu Beginn der Kultur hinzugefügt. (Konzentration IL-2: 20 U/ml, PMA: 5 ng/ml). An d 5, 6 und 7 wurde die Hälfte des Kulturmediums gegen frisches ausgetauscht, wobei die Konzentration der löslichen Stimuli durch Hinzufügen neuer Reagenzien beibehalten wurde. Dargestellt ist die Zählung der Zellen nach sieben Tagen Stimulation im Rahmen eines repräsentativen Experiments (n=6).

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 Zweisignalabhängigkeit des ICOS Moleküls. Die Zellen wurden mit PMA (33ng/ml), Ionomycin (200ng/ml) oder PMA und Ionomycin in 24-Loch Flachbodenplatten stimuliert, zu den angegebenen Zeiten wurde die Oberflächenexpression von ICOS in der Durchflußzytometrie untersucht. Dargestellt ist die relative Fluoreszenzintensität des ICOS Moleküls (offene Linie) im Vergleich zu einer Isotypkontrolle (schwarz). Auf der X-Achse ist die Fluoreszenzintensität dargestellt, auf der Y-Achse die Zellzahl.
Abb. 2a Stimulation mit PMA und Ionomycin
Abb. 2b Stimulation mit PMA
Abb. 2c Stimulation mit Ionomycin
Abb. 3 Cyclosporin A Sensitivität der ICOS Expression. Die Bezeichnung "8F4" ist der ursprüngliche Name des ICOS Moleküls. Die Zellen wurden mit PMA (33 ng/ml) und Ionomycin (200 ng/ml) (links), bzw. PMA und Ionomycin und CsA (1 µg/ml) (rechts) stimuliert. Die ICOS Expression wurde nach 8 h in der Durchflußzytometrie untersucht. Dargestellt ist die relative Fluoreszenzintensität des ICOS Moleküls (offene Linie) im Vergleich zu einer Isotypkontrolle (schwarz). Auf der X-Achse ist die Fluoreszenzintensität dargestellt, auf der Y-Achse die Zellzahl.
Abb. 4 Expression des ICOS Moleküls im Vergleich mit anderen T-Zellaktivierungsantigenen nach Stimulation mit PHA P. Das PHA P wurde den Zellen unmittelbar zu Beinn der Kultur zugesetzt. Die erforderliche Konzentration war in Vorexperimenten austitriert worden. Zu den angegebenen Zeiten wurden die Zellen angefärbt und die Expression der Oberflächenantigene mittels Durchflußzytometrie untersucht.
Abb. 5 Expression des ICOS Moleküls im Vergleich mit anderen T-Zellaktivierungsantigenen nach Stimulation mit anti-CD3 Ak. Die Stimulation erfolgte in 96-Loch Platten, die mit anti-Maus IgG und nachfolgend mit anti-CD3 Ak beschichtet worden waren. Die Konzentration der Antikörper wurden austitriert. In jedes Loch wurden 100 000 Zellen eingebracht. Zu den angegebenen Zeiten wurden die Zellen angefärbt und die Expression der Oberflächenantigene mittels Durchflußzytometrie untersucht.
Abb. 6 Konzentrationsabhängigkeit der kostimulatorischen Wirkung des ICOS Moleküls. CD4+-Zellen wurden durch immobilisierte anti-CD3 Ak und den mAk F44 in 96-Loch Platten stimuliert. In jedem Loch befanden sich 100 000 Zellen. An d 2 wurde den Zellen 1 µCi 3[H]-Thymidin zugesetzt. Nach einer 16 h Inkubation wurde die Proliferation der Zellen im Szintillationszähler gemessen. Die Werte stellen Vierfachwerte eines repräsentativen Experiments dar (n=3).
Abb. 7 Kostimulatorischer Effekt des ICOS Moleküls auf die Expression von CD25.
Abb. 8 Kostimulatorischer Effekt des ICOS Moleküls auf die Expression von CD40L.
Abb. 9 Auswirkungen der Kostimulation via ICOS und CD28 auf die IL-2 Sekretion.
Abb. 10 Auswirkungen der Kostimulation via ICOS und CD28 auf die IL-4 Sekretion.
Abb. 11 Auswirkungen der Kostimulation via ICOS und CD28 auf die IL-5 Sekretion.
Abb. 12 Auswirkungen der Kostimulation via ICOS und CD28 auf die IFN-gamma Sekretion.
Abb. 13 Auswirkungen der Kostimulation via ICOS und CD28 auf die ATAC Sekretion.
Abb. 14a Auswirkungen auf die IgM Sekretion
Abb. 14b Auswirkungen auf die IgG Sekretion
Abb. 15 Blockade der Interaktion des ICOS Moleküls mit seinem potentiellen Liganden durch F(ab)2 Fragmente. Die Kultur erfolgte in 96-Loch Platten, wobei sich in jedem Loch 50 000 CD4+-Zellen und 50 000 B-Zellen befanden. Die Zellen wurden unmittelbar vor Beginn der Kultur zusammengefügt und das PHA P zugesetzt. (Konzentration in Vorexperimenten austitriert). Die Überstände dieser Kulturen wurden nach 12 Tagen mit einem IgG bzw. IgM spezifischen ELISA analysiert. Unstimulierte B-Zellen produzierten keine Immunglobuline. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment (n=3).
Abb. 16a Kostimulation via ICOS mit PMA als erstem Signal. NTZ wurden in 96-Loch Platten mit PMA stimuliert (100 000 Zellen/Loch). Die Konzentration des PMA betrug 0,625 ng/ml. Nach 4 Tagen wurde den Zellen 1 µCi 3[H] Thymidin zugefügt und die Kultur weitere 16 h fortgeführt. Dann erfolgte die Analyse der Proliferation im Szintillationszähler. Dargestellt sind Mittelwerte von Versuchsvierfachwerten eines unabhängigen, repräsentativen Experiments (n=3).
Abb. 16b Kostimulation via ICOS mit PHA P als erstem Signal. Zelldichte, Kulturbedingungen Analyse erfolgten analog zu Abb. 16b. Die Konzentration von PHA P war in Vorexperimenten austitriert worden. 3[H] Thymidin wurde nach 4 d zugefügt. Dargestellt sind Mittelwerte von Versuchsvierfachwerten eines unabhängigen, repräsentativen Experiments (n=3).
Abb. 17 Restimulation von CD4+-Zellen durch das ICOS Molekül und andere kostimulatorische Moleküle. 200 000 CD4+-Zellen wurden in 24-Loch Platten stimuliert, die mit anti-CD3 Ak beschichtet worden waren. An d 4, 5, und 6 wurde die Hälfte des Kulturmediums gegen frisches Kulturmedium ausgetauscht. Nach d 7 wurden die Zellen für 24 h ohne Stimulus inkubiert, dann mit Trypanblau gezählt und jeweils 100 000 vitale Zellen in Löcher einer 96-Loch Platte gegeben. Dort erfolgte eine zweitägige differentielle Stimulation mit den in der Abb. dargestellten Stimuli. Die Proliferation der Zellen wurde durch Zugabe von 1 µCi 3[H] Thymidin für 16 h und eine anschließende Analyse im Szintillationszähler gemessen. Die Werte stellen Mittelwerte von Vierfachwerten eines repräsentativen Experiments dar (n=6).
Abb. 18 Proliferation durch Restimulation über anti-CD3 Ak nach unterschiedlichen Vorstimulationen. 200 000 CD4+-Zellen pro Loch wurden in den Löchern einer 24-Loch Platte mit den in der Abb. angegebenen Stimuli (Ak immobilisiert) sieben Tage lang stimuliert. An d 5, 6 und 7 wurde die Hälfte des Kulturmediums durch frisches Medium ersetzt, wobei die Konzentration der löslichen Stimuli (IL-2: 20 U/ml, PMA: 5 ng/ml) beibehalten wurde. Am d 7 wurden die Zellen abzentrifugiert und für 24 h auf Platten ohne Stimuli überführt. Danach erfolgte ein Transfer von jeweils 100 000 Zellen in die Löcher einer 96-Loch Platte, die mit anti-CD3 Ak beschichtet worden war. Die Zellen wurden zwei weitere Tage stimuliert, dann wurde ihnen 1 µCi 3[H] Thymidin hinzugefügt und die Proliferation nach 16 h 3[H] Thymidin Einbau durch Messung in einem Szintillationsgerät analysiert. Die Werte stellen Mittelwerte aus Vierfachwerten eines unabhängigen, repräsentativen Experiments dar (n=6).
Abb. 19 Differentielle Vorstimulation und Restimulation durch ICOS und andere kostimulatorische Moleküle. 200 000 CD4+-Zellen pro Loch wurden in den Löchern einer 24-Loch Platte mit den in der Abb. angegebenen 1. Stimuli (Ak immobilisiert) sieben Tage lang stimuliert. An d 5, 6 und 7 wurde die Hälfte des Kulturmediums durch frisches Medium ersetzt, wobei die Konzentration der löslichen Stimuli (IL-2: 20 U/ml, PMA: 5 ng/ml) beibehalten wurde. Am d 7 wurden die Zellen abzentrifugiert und für 24 h auf Platten ohne Stimuli überführt. Danach erfolgte ein Transfer von jeweils 100 000 Zellen in die Löcher einer 96-Loch Platte, die mit anti-CD3 Ak und den in der Legende aufgeführten Kostimuli versehen war (=2. Stimulus) (alle Ak immobilisiert). Die Zellen wurden zwei weitere Tage stimuliert, dann wurde ihnen 1 µCi 3[H] Thymidin hinzugefügt und die Proliferation nach 16 h 3[H] Thymidin Einbau durch Messung in einem Szintillationsgerät analysiert. Die Werte stellen Mittelwerte aus Vierfachwerten eines unabhängigen, repräsentativen Experiments dar (n=3).

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Fri Mar 16 20:17:39 2001