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3  METHODIK

3.1 Extrakorporale Therapieformen – Allgemeines

Die Immunadsorption gehört zur Gruppe der extrakorporalen Therapieverfahren, zu der außerdem Plasmapherese, Leukapherese und Photopherese gerechnet werden können.

Diese Verfahren basieren auf einem pathophysiologisch-kausalen Therapieprinzip und haben das Ziel, potenziell pathogene Substanzen aus dem Blutkreislauf zu entfernen. Obwohl die ersten Anwendungen bereits vor über 30 Jahren beschrieben wurden, sind Fragen zu Indikationen und Effektivität für viele Erkrankungen immer noch nicht eindeutig beantwortet.

Bei sehr vielen Autoimmunerkrankungen, sowie anderen Erkrankungen, die mit erhöhten pathologischen Antikörpern assoziiert sind und auch bei Abstoßungsreaktionen nach Organtransplantationen, wurden – zumindest versuchsweise – extrakorporale Therapieverfahren angewendet.

Als gesicherte Indikationen können heutzutage die idiopathisch-thrombozytopenische Purpura, die thrombotisch-thrombozytopenische Purpura, die Kryoglobulinämie, das Goodpasture-Syndrom, das akute Guillain-Barré-Syndrom und die Myasthenia gravis angesehen werden. Bei vielen rheumatologischen Erkrankungen - insbesondere dem systemischen Lupus erythematodes, den systemischen Vaskulitiden und dem Raynaud-Syndrom, mit Einschränkungen auch bei der rheumatoider Arthritis, der progressiven Systemsklerose oder der Dermato-Polymyositis - werden sie zumindest als ergänzende Therapiemaßnahme eingesetzt [144].

3.1.1 Immunadsorptionsbehandlung

Die Immunadsorption wird bisher bei rheumatologischen, sowie anderen Autoimmunerkrankungen, meistens als Alternative zu anderen Plasmaphereseverfahren, oder an kleineren Patientenkollektiven im Rahmen von Studien angewendet.

Sehr große Erfahrungen existieren bereits mit der Lipidapherese. Dieses Immunadsorptionsverfahren wird seit vielen Jahren sehr erfolgreich bei [Seite 27↓]familiärer Hypercholesterin­ämie eingesetzt [145]. Weitere Indikationen sind der familiäre Apo-B-100-Defekt und eine Lipoprotein(a)-Erhöhung.

Ein großer Vorteil der Immunadsorption gegenüber den anderen Plasmapheresever­fahren ist in der selektiven Elimination pathogener Substanzen zu sehen. Da bei vielen immunologischen Erkrankungen diese nicht bekannt sind, können sie mit dieser Methode jedoch nicht immer in ausreichendem Maße entfernt werden. Als günstig ist auch die geringe Nebenwirkungsrate einzuschätzen, die den hohen Kosten gegenüber zu stellen ist.

Entsprechend der zu eliminierenden Substanz kommen als Liganden Anti-IgG-Antikörper, Protein A , Phenylalanin/Tryptohan, C1q, humanes IgG, DNA oder Dextransulfate zur Anwendung.

Tabelle 1: Anwendungsgebiete der Immunglobulin-G-Immunadsorption

Hämatologie

  • Erworbene Inhibitoren gegen Gerinnungsfaktoren (Faktor VIII, V, XIII)
  • Inhibitoren bei Hämophilie A und B
  • ITP (Immunogene Thrombozytopenische Purpura)
  • TTP (Thrombotische Thrombozytopenische Purpura)
  • Autoimmunhämolytische Anämie
  • Knochenmarktransplantation (ABO-Inkompatibilität)

Rheumatologie

  • SLE (systemischer Lupus erythematodes), Anti-Phospholipid-Syndrom, Lupus-Antikoagulans
  • Rheumatoide Arthritis
  • Mischkollagenosen, Sklerodermie, Dermatomyositis
  • Sjögren-Syndrom
  • · Vaskulitiden, Wegenersche Granulomatose, u.a.

Neurologie

  • Myasthenia gravis
  • Guillain-Barré-Syndrom
  • CIDP (Chronisch inflammatorische demyelinisierende Polyneuropathie)
  • Dysproteinämische Polyneuropathien
  • Multiple Sklerose
  • Paraneoplastische Syndrome (Lambert-Eaton-Syndrom, Optikusneuropathie, cere-belläre Degeneration, Myoklonus, anti-Hu-Antikörper u.a.)

Kardiologie

  • Dilatative Kardiomyopathie

Nephrologie

  • Goodpasture-Syndrom
  • Rezidivierendes nephrotisches Syndrom bei fokal-sklerosierender Glomerulosklerose
  • Lupus Nephritis

Gastroentero-logie

  • Primär biliäre Zirrhose
  • Zöliakie
  • Perniziöse Anämie

Transplantation

  • Akute Abstoßungsreaktionen
  • Leber- oder Nierentransplantationen unter hohem Spiegel zytotoxischer Antikörper

Sonstiges

  • Kryoglobulinämie
  • Maligner Exophtalmus
  • IDDM (Insulin-dependent Diabetes mellitus)
  • Pemphigus, Allergien, Urtikaria


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3.1.2  Ig-TheraSorb® - Prinzip

Kernstück der in der vorliegenden Studie verwendeten Ig-TheraSorb 100 ® -Immunadsorber (PlasmaSelect/Teterow, Baxter/München) ist die Adsorptionssäule, deren Matrix aus 100 ml feuchter CL-4-B-Sepharose besteht, welche in 0,9 %-iger NaCl-Lösung suspensiert ist. An diese sind je ml Sepharose 10 mg gegen humanes Immunglobulin gerichtete polyklonale Schafantikörper kovalent gebunden. Die maximale Bindungskapazität je Säule beträgt 12 mg humanes Immunglobulin. Die Säulen sind regenerierbar, so dass durch mehrfache Beladung höhere Adsorptionsraten erzielt werden können [146].

Abbildung 4: Aufbau der Immunadsorptionssäule

Durch die polyklonalen Schafantikörper werden Immunglobuline (IgG, IgM, IgA, IgE, IgD), zirkulierende Immunkomplexe, Rheumafaktoren und Fragmente von Immunglobulinen spezifisch gebunden.

Als besonders günstig ist die gleichmäßige Senkung aller IgG-Subklassen, hervorzuheben, die durch eine Affinität zu schweren und leichten Ketten der Immunglobuline ermöglicht wird. Bisher wurden keine relevanten Adsorptionsraten anderer Plasmaproteine beobachtet [147,148]. Allerdings scheint es zu einer geringen Senkung von Komplementfaktoren durch Aktivierung des Komplementsystems zu kommen, was bei[Seite 29↓] Immunkomplex-assoziierten Erkrankungen mit ohnehin bestehendem Komplementmangel ungünstig ist. Außerdem besteht aufgrund der Invasivität ein erhöhtes Infektionsrisiko. Säulen-spezifische Nebenwirkungen (zum Beispiel Bildung von Anti-Schaf-Antikörpern) sind bisher nicht beobachtet worden [148].

3.1.2.1 Behandlungsablauf

Die Immunadsorption wurde mit Hilfe eines Adsorptions-Desorptions-Automaten (Mirosorb Dialyse Technik, Ettlingen/Deutschland) durchgeführt. Für jeden Patienten wurden zwei Adsorptionssäulen benötigt, die durch Regeneration beliebig oft benutzt und insgesamt bis zu drei Jahre lang wiederverwendet werden können. Über einen kubitalen Zugang – beziehungsweise über einen Dialysekatheter - wurde mit einer Flussrate zwischen 50 und 90 ml pro Minute venöses Blut entnommen, welches durch Filtration (Blutzellseparator Hemaplex-BT 900/B, Dideco, Mirandola/Italien) in Plasma und zelluläre Bestandteile getrennt wurde. Das Plasma wurde mit einer geringeren Flussrate von 20 bis 25 ml pro Minute über die Adsorptionssäule ( Abbildung 4 ; Seite 26 ) geleitet. Beim Durchdringen der Sepharosematrix werden die Immunglobuline durch die Anti-Human-Ig-Antikörper gebunden. Dabei ist die Eliminationsrate von der Flussrate und dem gereinigten Plasmavolumen abhängig. Das gereinigte Plasma wurde anschließend über die zweite Säule geleitet, so dass die erste regeneriert werden konnte. Hierzu wurden Pufferlösungen verwendet, wobei zuerst eine Spülung mit einer 0,2 M-Glycinlösung (pH 2,8), dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) und abschließend mit physiologischer Kochsalzlösung erfolgte. Das gereinigte Plasma wurde dem Patienten unterdessen zusammen mit den zellulären Blutbestandteilen über einen zweiten venösen Zugang am anderen Arm – beziehungsweise ein anderes Lumen des Dialysekatheters - zurückgeführt.

Die Antikoagulation innerhalb des Systems wurde mit Heparin durchgeführt. Auf eine Kombination mit Zitrat wurde bewusst verzichtet, um eine Beeinflussung der Kardio­myozytenkontraktilität durch Veränderungen der Kalziumkonzentration auszuschließen.


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Die Aufbewahrung der Adsorptionssäulen erfolgte zwischen den Behandlungen mit physiologischer Kochsalzlösung und 0,01 %-igem Natriumazid bei 4°C. Vor jeder Behandlung wurde das Konservierungsmittel mit einer Pumpgeschwindigkeit von 90 bis 100 ml pro Minute mit zwei bis drei Litern steriler physiologischer Kochsalzlösung entfernt.

Abbildung 5: Behandlungsschema der Immunadsorption mit Ig-Therasorb®


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3.2  Patientengut

3.2.1 Einschlusskriterien

Es mussten folgende Kriterien erfüllt sein:

3.2.2 Ausschlusskriterien

Nicht eingeschlossen wurden Patienten, bei denen


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3.2.3  Begleitende Medikation

Für die begleitende medikamentöse Therapie wurden durch das Studienprotokoll keine Einschränkungen festgelegt. Jeder Patient wurde individuell auf die für ihn optimale Medikation eingestellt, wobei auf zur Zeit allgemein anerkannte Herzinsuffizienztherapeutika zurückgegriffen werden konnte. Die orale Medikation bestand bei allen Patienten seit mindestens drei Monaten vor Studienbeginn und durfte während des Studienzeitraumes nicht verändert werden.


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3.3  Studienaufbau

3.3.1 Studiendesign

Die Untersuchungen erfolgten im Rahmen einer offenen, randomisierten, prospektiven und kontrollierten Phase-III-Studie. Für jeden Patienten wurde vor Beginn der Studie die Randomisierung durch einen Koordinator nach dem Latin Square Index vorgenommen. Dabei ergab sich die Zuordnung zur Immunadsorptionsgruppe (Behandlungsgruppe, Verumgruppe) oder zur Kontrollgruppe.

3.3.2 Studienablauf

Die Therapiephasen wurden auf einer kardiologischen Intensivstation eines Universitätsklinikums durchgeführt. Der Randomisierung entsprechend, wurde bei der Hälfte der Patienten zusätzlich zur bestehenden medikamentösen Therapie eine Immun­adsorptionsbehandlung in vier Behandlungsabschnitten in monatlichen Abstän­den durchgeführt. Die Adsorptionen wurden an drei aufeinanderfolgenden Behand­lungstagen – beziehungsweise während des zweiten bis vierten Behandlungsab­schnittes an zwei Tagen - bis zu einem Plasmavolumen von jeweils fünf Litern durchgeführt. Es konnte jeweils eine Reduktion der Immunglobulin-G-Konzentration von mindestens 60 % erreicht werden.

Von verschiedenen Plasmaphereseverfahren weiß man, dass es in der Folge zu einem Wiederanstieg der Immunglobulinkonzentrationen im Sinne eines „Rebound-Effekts“ kommt. Dieser erklärt sich zu einem wesentlichen Anteil aus einer Antikörperneusynthese, die für die pathogenethisch bedeutenden Autoantikörper nicht erwünscht ist. Eine weitere Ursache könnten eine Rückdiffusion aus dem Gewebe, ein vermehrter Proteinabstrom aus dem Lymphsystem oder ein verminderter Immunglobulinkatabolismus sein [149]. Um einen solchen „reaktiven“ Konzentrationsanstieg - vor allem spezifischer Immunglobuline (Autoantikörper) - zu verhindern, erfolgte nach Abschluss jedes Behandlungsabschnittes die intravenöse Substitution von 0,5 g pro kg Körpergewicht eines polyklonalem Immunglobulin-G-Präparates (Venimmun ® ) über sechs Stunden. [Seite 34↓]Durch Bindung an die Fc-Rezeptoren der B-Zellen kann so die reaktive Antikörperproduktion vermindert beziehungsweise verhindert werden [150].

Während des ersten und vierten Behandlungsabschnittes erhielten alle Patienten einen Swan-Ganz-Rechtsherzkatheter. Während der intensiv-stationären Aufenthalte wurde die Herzfrequenz permanent und der arterieller Blutdruck in stündlichen Intervallen dokumentiert. Die Registrierung eines 12-Kanal-Elektrokardiogramms erfolgte einmal täglich. Vor jedem stationären Aufenthalt wurde eine detaillierte Anamneseerhebung mit Beurteilung des Verlaufes der Beschwerdesymptomatik inklusive einer Einstufung nach der NYHA-Klassifikation, sowie eine ausführliche körperliche Untersuchung durchgeführt.

Zusätzlich wurden in beiden Gruppen die weiter unten aufgeführten echokardiographischen und laborchemischen Parameter entsprechend dem in Abbildung 6 dargestellten Zeitablauf erfasst.

Abbildung 6: Studienablauf: (IA1 bis IA4 entsprechen dem ersten bis vierten Behandlungsabschnitt)


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3.4  Parameter

3.4.1  Hämodynamik

Das hämodynamische Monitoring wurde unter intensivstationären Bedingungen mit Hilfe einer Rechtsherzkatheterisierung (Swan-Ganz-Thermodilutions-Katheter) durchgeführt. Als Zugangsweg wurde, je nach anatomischen Verhältnissen, die Vena jugularis interna beziehungsweise Vena subclavia ausgewählt. In mindestens drei-stündlichen Abständen wurden viermal täglich die folgenden hämodynamischen Parameter bestimmt:

  1. Direkt gemessene Parameter:

Mit hohem Druck wird (manuell oder maschinell) eine definierte Menge (hier 10 ml) eiskalter physiologischer Kochsalzlösung (0 - 4°Celsius) durch den Katheter in den rechten Vorhof injiziert. Ein angeschlossener Hämodynamik-Computer erfasst dabei den Verlauf der Temperaturänderung (Abbildung 7) und berechnet mit Hilfe des Integrals unter der Temperaturkurve unter Berücksichtigung der Katheterkonstanten das HZV nach folgender Formel:


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Abbildung 7: Schematische Darstellung der Thermodilutionsmessung

Die Thermodilutionsmethode ist anderen Bestimmungsverfahren, wie der Berechnung nach dem Fick´schen Prinzip, dem Farbstoffinjektionsverfahren, der elektromagnetischen Flussmessung oder der (kontinuierlichen) Berechnung aus der arteriellen Pulskurve vorzuziehen [127,151,152]. Dabei gewährleistet die Verwendung einer Injektionsmenge von 10 ml die beste Reproduzierbarkeit, beziehungsweise die geringste Variabilität der Messergebnisse im Vergleich zu anderen Flüssigkeitsvolumina [127,151]. Die Genauigkeit dieser Methode kann - wie in unserer Studie geschehen - durch Verwendung eiskalter Injektionslösung (0 - 4° Celsius) zusätzlich verbessert werden [153]. Pro HZV-Messung wurden zwischen drei und fünf Injektionen durchgeführt und der Mittelwert gebildet, wodurch die Fehlerquote deutlich verringert werden kann [151,154].


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  1. Errechnete Parameter:

Aus den direkt gemessenen Parametern wurden mit Hilfe eines Hämodynamik-Computers die folgenden Werte berechnet:

  • Herzindex (HI, CI)

=

  • Schlagvolumen (SV)

=

  • Schlagvolumenindex (SVI)

=

  • Pulmonalvaskulärer Widerstand (PVR)

=

  • Systemvaskulärer Widerstand (SVR)

=


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3.4.2  Echokardiographie

Alle Untersuchungen wurden „blind“, das heißt ohne Kenntnis der Gruppenzugehörigkeit durchgeführt. Die Messungen erfolgten in Linksseitenlage, sowie in Atemmittellage, um atemabhängige Veränderungen des Signals zu vermeiden. Es wurde ein Hewlett-Packard-Ultraschallgerät (HP SONOS 5500) mit einer 2,5-MHz-Ultraschallsonde verwendet. Die dopplerechokardiographischen Untersuchungen erfolgten in konventioneller und farbkodierter Technik. Alle Untersuchungen wurden mit einem SVHS-Videorekorders aufgezeichnet. Gleichzeitig wurde jeweils ein bipolares Elektrokardiogramm abgeleitet. Folgende Parameter wurden bestimmt:

Tabelle 2: Übersicht der echokardiographischen Parameter

M – MODE (parasternale Längsachse)

  • Diastolische Wanddicke des interventrikulären Septums und der linksventrikulären Hinterwand ( IVS-EDD/ LV-PW-EDD ) [mm]

  • Maximaler diastolischer und kleinster systolischer Durchmesser des linken Ventrikels ( LV-EDD / LV-ESD ) [mm]
>

  • Maximaler Durchmesser des linken Vorhofs ( LA-maxD ) [mm]

  • Maximaler Durchmesser des Aortenklappenringes ( AR-maxD ) [mm]

B – MODE (Vierkammerblick)

  • Linksventrikuläres enddistolisches und endsystolisches Volumen ( LV-EDV / LV-ESV ) [mm], sowie linksventrikuläre Ejektionsfraktion ( LV-EF ) [%] [Berechnung nach Simpson]

DOPPLERECHOKARDIOGRAPHIE

  • Dezelerationszeit ( DT ) [ms] auf Mitralklappenebene

  • Quantifizierung von Klappenfehlern

V E = frühdiastolisches Flußgeschwindigkeitsmaximum

V A = spätdiastolisches Flussgeschwindigkeitsmaximum

AT = Anstiegszeit

DT = Dezelerationszeit

VISUELL

  • Klappenfunktions- und Wandbewegungsanalyse

Die Berechnung der echokardiographischen Parameter erfolgte nach den Konventionen der American Heart Association beziehungsweise der American Society of Echocardiography [155,156].


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Bei Verwendung moderner Echokardiographiegerätetechnik besteht auch bei bereits deutlich eingeschränkter Ventrikelfunktion eine hohe Korrelation im Vergleich mit invasiven Meßmethoden [157].

Aufgrund der einfachen Durchführbarkeit und der fehlenden Invasivität erfolgte deshalb die Verlaufsbeobachtung der linksventrikulären Funktion mit Hilfe der Dopplerechokardiographie.

3.4.3 Laborparameter

Die folgenden Parameter wurden entsprechend dem in Abbildung 6 (Seite 32 ) dargestellten Zeitablauf bestimmt:

CD3, CD4, CD8 (nur Baseline, kein Follow-Up)

Die Bestimmungen der rheologischen Parameter wurden spätestens drei Stunden nach venöser Blutentnahme vorgenommen. Zur Messung der Plasmaviskosität wurde ein Plasmaviskosometer (Fresenius, Bremen) verwendet. Die Bestimmung der Vollblutviskosität erfolgte bei 25 ± 0,2° C mit einer Präzision von ± 2 % mit einem Mikroviskosimeter (Ubbelhode, DIN 51 562, Schott) bei einer Scherrate von 800 l/s, entsprechend den Verhältnissen, wie sie in kleinsten Arterien und Kapillaren herrschen.

Die Bestimmung der löslichen Immunmodulatoren erfolgte mit den folgenden Enzymimmunoassays: Konzentrationen von Tumornekrosefaktor Alpha (TNF-α), Interleukin-6 und löslichem Interleukin-2 Rezeptor (sIL-2R, CD25) wurden mit Hilfe des Immulite ® [Seite 40↓] Immunoassay-Systems (DPC Biermann, Bad Nauheim), löslicher TNF-Rezeptor I (sTNF-R1) und II (sTNF-R2) mittels Quantikine ELISA-Kit (DPC Biermann) gemessen.

Die Bestimmung der β1-Auto-Antikörper erfolgte am Max Delbrück Institut Berlin-Buch nach der von Wallukat et al. beschriebenen Methode [158].

3.4.4  Histologische Untersuchungen

Von jedem Patienten wurden fünf rechtsventrikuläre Biopsien aus dem Bereich des interventrikulären Septums entnommen, in vierprozentiger Formalin-Lösung fixiert und in Paraffin eingebettet. Hiervon wurden 2 μm dicke Schnitte angefertigt. In allen Fällen konnte eine akute Myokarditis entsprechend den Dallaskriterien ausgeschlossen werden [159]. Zusätzlich wurden immunhistologische Untersuchungen durchgeführt. Mittels Streptavidin-Biotin-Methode wurde das Vorliegen aktiver Entzündungszellen ausgeschlossen [160]. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden CD3-, CD4- beziehungsweise CD8-Antikörper verwendet (DAKO, Hamburg; NOVACASTRA, Newcastle upon Tyne).

3.4.5 Statistik

Die erhobenen Daten wurden zunächst mit Hilfe deskriptiver statistischer Verfahren untersucht. Alle Ergebnisse werden in der vorliegenden Arbeit als arithmetische Mittelwerte und Standardfehler (SE;standard error) angegeben.

Als statistische Testverfahren kamen zur Anwendung:


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Den Signifikanzanalysen wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 zugrunde gelegt. Signifikante Unterschiede wurden in Tabellen, Diagrammen und Abbildungen durch einen Stern (*), hohe Signifikanzen (p<0,01) durch zwei Sterne (**) markiert.

Zur Datenauswertung, statistischen Analyse und graphischen Darstellung wurden die Software-Programme SPSS für Windows 9.0, Excel 2000 und Word 2000 verwendet.


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26.10.2004