3 Material und Methodik

↓12

Die im folgenden dargestellte mikrochirurgische Präperation und die Erzeugung der fokalen kortikalen Kontusion anhand des Cortical Impact Injury Traumamodells (CCII) wurde im Labor für Experimentelle Neurochirurgie (unter der Leitung von Professor Dr. Unterberg) an der Charité (Campus Virchow, Humboldt Universität zu Berlin) durchgeführt. Die magnetresonanztomographischen Untersuchungen erfolgten in der Abteilung für Kernspintomographie des Institutes für radiologische Diagnostik (unter der Leitung von Professor Dr. Wolf) des Universtätsklinikums Benjamin Franklin der Freien Universität Berlin.

3.1  Versuchstiere und Versuchsgruppen

Die Versuche wurden im Rahmen des von der Senatsverwaltung für Gesundheit und Soziales des Landes Berlin genehmigten Tierversuchsvorhabens G 0150/98 durchgeführt.

Als Versuchstiere wurden ausschließlich männliche Spraque-Dawley-Ratten (Charles River, Deutschland) verwendet. Die Ratten hatten vor CCII ein durchschnittliches Körpergewicht von 328 ± 8 g und wurden 24 Stunden vor Studienbeginn an die Laborumgebung gewöhnt. Die Tiere wurden in natürlichem Tages- und Nachtrhythmus in Makrolonkäfigen zu jeweils 5 Tieren gehalten, die mit Holzspäne (Fa. Altromin, Deutschland) gefüllt waren und hatten in den Käfigen freien Zugang zu Futter (Altromin®, Fa. Altromin, Deutschland) und Wasser.

↓13

Die Zuordnung der Tiere zur Kontrollgruppe bzw. zu den Therapiegruppen erfolgte randomisiert. Bei allen Versuchsgruppen wurde dafür Sorge getragen, daß das Verhältnis zwischen Kontrollgruppe und der Therapiegruppen pro Versuchstag ausgeglichen war. Insgesamt wurden 79 Ratten untersucht.

Die longitudinale Charakterisierung der postraumatischen Ödementwicklung bis 7 Tage nach Trauma durch bildgebende MRT-Methoden erfolgte anhand von 9 nicht-therapierten Tieren. Das dynamische Profil wurde durch Messungen zu den folgenden Zeitpunkte erstellt (s. Abb. 1):

Abb. 3.1: MRT-Meßzeitpunkte der hemisphäralen Schwellung über 7 Tage

↓14

Für die Untersuchung der antiödematösen Wirkung des spezifischen Bradykinin-B2-Rezeptorantagonisten LF 16.0687 Ms (Laboratoires Fournier, Daix, Frankreich) wurden insgesamt 60 Tiere verwendet, von denen 21 als Kontrolltiere 1 ml physiologische Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) durch subkutane Injektion erhielten.

Der Bradykinin-B2-Rezeptorantagonist LF 16.0687 Ms wurde in zwei Dosierungen verabreicht: 3 mg/kg KG (n=22) und 30 mg/kg KG (n=17).

Alle Tiere wurden nach dem gleichen Schema traumatisiert, therapiert und getötet. 24 Stunden nach CCII wurde in allen Tieren der Schwellungswert, der Wassergehalt und der Trennfehler gravimetrisch bestimmt.

↓15

In einer weiterführenden Untersuchung erhielten jeweils 5 Tiere NaCl oder den Bradykinin-B2-Rezeptorantagonisten LF 16.0687 Ms (3 mg/kg KG), um magnetresonanz-tomographisch die protektive Wirkung dieses Antagonisten anhand der Veränderungen der hemisphäralen Schwellung und der Bluthirnschrankenstörung zu den Zeitpunkten 6 und 24 Stunden nach Trauma zu bestimmen. Nach der letzten MRT-Messung wurden die Hirne zur gravimetrischen Bestimmung des Hirnödems entnommen, was einen direkten Vergleich der magnetresonanztomographischen und der gravimetrischen Bestimmung des Hirnödems zuließ.

3.2 Versuchsdurchführung

3.2.1  Narkose

Alle im folgenden beschriebenen, an den Tieren durchgeführte Eingriffe (Kraniektomie, Traumatisierung, Blutabnahme, Entblutung, Hirnentnahme) und MRT-Messungen wurden am narkotisierten Tier vorgenommen. Die Narkosegaseinheiten und Maskenvorrichtungen waren sowohl im mikrochirurgischen Labor als auch im MRT-Raum in gleicher Ausführung vorhanden.

Zur Einleitung der Narkose wurden die Tiere in einem luftdicht abschließenden Narkose-Topf, der über eine Narkosegas-Zufuhr und -Absaugung verfügte, über 3 Minuten narkotisiert. Das hierzu verwendete Gas-Gemisch setzte sich aus Isofluran (5 Vol.%, Forene®, Abbott GmbH) sowie N2O (1 l/min) und O2 (0,5 l/min) zusammen und stammte aus einer Narkosegas-Verdampfer-Einheit (Sulla 808, Fa. Dräger Werk AG, Lübeck).

↓16

Danach wurde die Narkose mit einer doppellumigen Narkose-Maske fortgeführt, deren inneres Lumen über eine Narkosegas-Zuführung und deren äußeres Lumen über die Narkosegas-Absaugung verfügte. Das Narkosegas-Gemisch konnte zur Aufrechterhaltung der Narkose während der Kraniektomie bzw. der Traumatisierung, der Entblutung und während der MRT-Messungen vermindert werden (N2O 0,5 l/min, O20,3 l/min, Isofluran von 2,0 Vol. %). Die spontan atmenden Tiere waren so vollständig narkotisiert, relaxiert und analgesiert.

Um ein Austrocknen der Kornea der geöffneten Augen zu verhindern, wurde Panthenol-Augensalbe (Dexapanthenol, Jenapharm, Deutschland) verwendet.

Zur Ausleitung der Narkose wurden die Tiere bis zum völligen Erwachen mit 0,8 l/min O2 (100 %) nachventiliert, um die durch die rasche Rückflutung des N2O entstehende Diffusionshypoxie zu minimieren.

3.2.2 Kraniektomie

↓17

Die Tiere wurden möglichst reizarm von den Tierstallungen in das Versuchslaboratorium gebracht und dort zu jeweils fünf Ratten pro Käfig gehalten. Nach der Narkoseeinleitung wurde das Gewicht der Tiere protokolliert. Die rektal gemessene Temperatur wurde mittels einer selbstregulierenden Heizmatte (Temperature Control Unit HB 101/2, Fa. Letica Scientific Instruments, Spanien) während der Kraniektomie, der Traumatisierung sowie vor der abschließenden Entnahme des Gehirnes zwischen 37 °C und 38 °C konstant gehalten und im 10 Minuten-Abstand protokolliert.

Zur Kraniektomie wurden die Tiere in einem stereotaktischen Rahmen (stereotaktische Sockeleinheit, Fa. David Kopf Instruments, Tujunga, California / USA) fixiert. Nach Rasur des oberen Kopfes erfolgte eine Hautinzision in der Mittellinie von einer die Augen verbindenden, ca. 3 cm messenden Linie bis in den Nacken und die Mobilisierung der Haut über der linken Seite der Kalotte bis zum Arcus zygomaticus. Die entstandene Wunde wurde durch Anzügelung der Hautlappen mittels Standard-Nahtmaterial gespreizt. Zur Freilegung des Operationsfeldes wurden die Sutura coronalis, Sutura sagittalis sowie die Sutura lambdalis dargestellt, der linke M. temporalis mit einer Bipolar-Pinzette vom Ursprung gelöst und bis zum Arcus zygomaticus abgesetzt. Darauf wurde die Kraniektomie mittels eines stufenlos regelbaren Bohrers (Bohr- und Fräsgerät: Minimot 40 E) mit Diamantbohrkopf (Kugelbohrkopf ∅= 1,8 mm, Fa. Proxxon, Deutschland) bei ca. 2000 U/min möglichst erschütterungsarm vorgenommen. Dabei wurde sowohl zur Lambda-Naht als auch zur Sagittal-Naht ein Sicherheitabstand gehalten, um die darunter gelegenen venösen Sinus zu schonen, während direkt auf der Koronar-Naht gefräst werden konnte. Die untere Fräslinie wurde zwischen mittlerem und unterem Drittel der Strecke zwischen der Knochenleiste des M. temporalis und dem Arcus zygomaticus angesetzt (s. Abb.2). Bei der Fräsung durch den Knochen wie auch bei der Entnahme des rechteckigen Knochendeckels (ca. 7 mm x 5 mm) wurde dafür Sorge getragen, daß die Dura mater intakt blieb und eine zusätzliche Schädigung vermieden wurde. Die erstellte Kraniektomie maß ca. 7 mm x 10 mm. Das Arbeitsfeld wurde während der Kraniektomie permanent mit isotoner NaCl-Lösung (0,9 %) gespült, was sowohl der Kühlung des Bohrkopfes als auch der Entfernung der entstehenden Knochenspäne diente. Die Spülflüssigkeit wurde kontinuierlich abgesaugt.

Nach erfolgreicher Kraniektomie und Entnahme des Knochendeckels wurde die intakte Dura mit einem NaCl-getränkten Tupfer bedeckt, die Narkose fortgeführt und das Tier während der Umlagerung auf die Trauma-Einheit auf der Wärmematte belassen.

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Abb. 3.2: Darstellung der Kraniektomie [modifiziert nach: [Pellegrino, 79]]

3.2.3 Die Controlled Cortical Impact Injury (CCII) -Trauma-Einheit

Unter Verwendung des Controlled Cortical Impact Injury-Gerätes wurde eine fokale kortikale Kontusion erzeugt.

Hierbei übte ein auf der Kolbenstange eines pneumatisch, in beide Richtungen kontrolliert bewegbaren Zylinders und über ein tiefenverstellbares Gewinde befestigter Bolzen den Kontusionsstoß aus. Sowohl für die Hinbewegung als auch für die Rückholung wurde der Kolben innerhalb des Zylinders über ein separates, durch einen regelbaren N2-Druckluftanschluß gespeistes Modul beschleunigt. Die zwischen diesen beiden Bewegungen liegende Kontaktzeit ließ sich über einen Verzögerungsregler variieren.

↓19

Die Fixierung des Tieres in der CCII-Trauma-Einheit erfolgte in einer stereotaktischen Vorrichtung, die auf einem in der Einheit verschieblichen Schlitten montiert war. Der Schlitten bot die Möglichkeit der optimalen Ausrichtung des Kraniektomieareales in allen drei Ebenen des Raumes in bezug zum Bolzen. Auf diese Weise konnte der Schlitten so zum Bolzen ausgerichtet werden, daß dieser immer in demselben Winkel in der horizontalen (0°) und vertikalen Ebene (30°) auf die Konvexität des Gehirns traf.

Der maximal ausgefahrene Bolzen konnte über ein Gewinde so eingestellt werden, daß er gerade die Dura mater berührte. Dann wurde er zurückgefahren und die Impressionstiefe des Bolzens um 2 mm vergrößert, wobei eine Umdrehung des Bolzens einer Eindringtiefe von 1 mm entsprach. Die Sicherung des Bolzens auf dem Gewinde erfolgte über eine Kontermutter.

Der an der Spitze abgerundete Bolzen hatte zwar einen absoluten Durchmesser von 8 mm, da die Eindringtiefe von 2 mm allerdings die Länge der abgerundeten Spitze (3 mm) unterschritt, drang dieser nur mit einem maximalen Durchmesser von 6 mm ein (s. Abb. 3).

↓20

Abb. 3.3: Schemazeichnung der Bolzen-Positionierung

Die Geschwindigkeit des Bolzens von ca. 7 m/s wurde durch einen Impaktationsdruck von 100 psi (100 lbs/in² // entspricht ca. 7 bar) erreicht. Der Rückholdruck wurde exakt auf 13 psi, entsprechend ca. 0,9 bar, eingestellt. Die Kontaktzeit betrug ca. 300 ms.

Das CCII-Traumamodell ermöglichte die Kontrolle dieser Parameter über einen linear variablen Differentialtransformer (LVDT). Dieser bestand aus zwei um die bewegliche Bolzenstange angebrachten Spulen. Das Signal der durch die Bolzenbeschleunigung hervorgerufenen Induktionsänderung wurde via eines Interfaces (ATC – 101 Analog Transducer Controller, Fa. Lucas Schaevitz) und einer ISA-Lab-View PC-Karte an einen PC (CPU: 486 Arbeitsspeicher 8 MB) übertragen. Dieser setzte die Daten mit einer speziellen Software (Lab View Graphical Programming for Instrumentation Ver. 3.1.1. ©1995, Fa. National Instruments) graphisch um.

↓21

Nach Applikation des Traumas wurde insbesondere auf die Atmung und den mittleren arteriellen Blutdruck des Tieres geachtet. Die Kraniektomie wurde nur bei den Tieren, die zusätzlich im MRT-Messungen unterzogen werden sollten, nach ungefähr 10 Minuten mit dünnschichtig aufgtragenem Zahnzement (Zinkphosphatzement, Fa. Richter & Hoffmann Harvard Dental GmbH, Berlin) verschlossen, um bei den später folgenden MRT-Messungen einen besseren Kontrast des Traumaareales zu den umgebenden Weichteilen zu gewährleisten. Auf die Zementanlage folgte der einschichtige Verschluß der Wunde (Prolene monofil 4/0, Fa. Ethicon, Norderstedt).

3.2.4 Magnetresonanztomographische (MRT) -Anlage und Software

Für die magnetresonanztomographischen Untersuchungen stand in der Abteilung für Kernspintomographie (Institut für radiologische Diagnostik, Universtätsklinikum Benjamin Franklin, Freie Universität Berlin) ein 100 MHz Tomograph (Bruker Biospec 24/40) mit einem supraleitenden, 40 cm weiten Horizontal-Magneten (NbTi-Spulen der Fa. Bruker, Karlsruhe) einer Magnetfeldstärke von 2,35 Tesla zur Verfügung. Der Tomograph verfügte außerdem über ein aktiv abgeschirmtes Gradienten-Spulen-Rohr mit einer Gradientenstärke von 50mT/m (Maximalwert).

Die Steuerung des Tomographen sowie die Signalakquisition wurde über eine Silicon Graphics IRIS-4D30 Personal Workstation (128 Mbyte / IRIX 4.0.5F Unix-Betriebsystem) vorgenommen, die den Empfänger und den Synthesizer über einen Aspect-3000-Rechner ansteuert. Als Steuerungs- und Bildakquisitionssoftware wurde Xwin-NMR mit einem Paravision TM-Modul verwendet.

↓22

Für die Signalakquisition wurde eine 1H-Oberflächenspule (50 mm Durchmesser) eingesetzt, die in Zusammenarbeit mit Professor Vollmann, Technische Fachhochschule Berlin, entwickelt wurde. Diese wurde über dem Traumabezirk bzw. dem Schädel positioniert.

3.2.5 MRT-Messreihe

Unter kontinuierlicher Isofluranzufuhr (0,5 l/min N2O, 0,3 l/min O2, 2,0 Vol. % Isofluran) wurden die Tiere auf einer eigens für diesen Zweck angefertigten und auf die Bohrung der MRT-Anlage angepassten Positionierungs-Halterung fixiert, auf der sich ein - vergleichbar mit dem zur Trepanation verwendeten - stereotaktischer Halter befand. Über die konisch zulaufenden und in beide meati acustici externi eingeführten Halterungen wurde der Rattenschädel in der koronaren und transversalen Ebene fixiert. Die Fixierung in der sagittalen Ebene erfolgte über einen im Bereich der Schnauze des Tieres positionierten, longitudinal spannbaren Bügel, in dessen Öffnung die Schneidezähne des Tieres einhakten. Zusätzlich wurde die Schnauze des Tieres über einen den Nasenrücken umschlingenden Gummizügel nach unten in dieser Position gehalten. So wurde der Schädel in allen Ebenen fixiert und die durch Atmungexkursionen entstehenden Bewegungsartefakte auf ein Minimum reduziert.

Das Tier konnte durch den stereotaktischen Halter und die Positionierungs-Halterung innerhalb der Bohrung des Tomographen im Zentrum des Magneten millimetergenau gelagert werden, so daß die Schichtpositionen der verschiedenen Meßzeitpunkte und auch der Tiere untereinander (eine geringe interindividuelle anatomische Varianz berücksichtigt) identisch waren.

↓23

Der Körper des Tieres lag gepolstert in einem Teflon-Halbrohr. Dieses ließ durch eine ca. 3 cm x 8 cm messende ovale Öffnung die Positionierung eines modifizierten Urinauffangbeutels an der Unterseite des Tieres zu. Dieser war zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur des Tieres über einen Zu- und Abfluß mit einer über die rektale Temperatursonde rückgekoppelten Hydrowärmeeinheit verbunden. Auch hier wurde die Körpertemperatur zwischen 36,5 °C und 37,5 °C gehalten. Zur zusätzlichen Kontrolle wurde ein weiteres elektronisches Thermometer verwendet, das ebenfalls rektal maß und dessen Anzeige auch im Kontrollraum zu sehen war.

Auf dem oben erwähnten Bügel zur Fixierung der Schneidezähne war eine Narkose-Zuführung und –Absaugung in ähnlicher Weise montiert wie sie bei der Kraniektomie verwendet wurde.

3.2.6 Die T2- und T1-gewichteten Sequenzen

Die Messreihen setzten sich aus T2- und T1-gewichteten Sequenzen zusammen. Am Anfang wurde immer eine T2-gewichtete Scout-Übersichtsaufnahme (s. Abb. 4) in transversaler Schichtführung akquiriert, an der die folgenden Sequenzen geometrisch angepasst wurden, so daß die Bezugspunkte bei allen Tieren gleich und auch über die verschiedenen Messreihen hin konstant blieben.

↓24

Abb .3.4: Transversale Scout-Aufnahmen zur Schichtpositionierung

Dabei lag Schicht Nr. 5 im Zentrum der Läsion, die Schichten Nr. 3-4 okzipital und Nr. 6-7 frontal. Die T2-gewichtete Bildgebung wurde anhand einer RARE-Sequenz vorgenommen (Parameter s. Tab. 1).

Zur Auswertung der verschieden gewichteten MRT-Bilder erfolgten die Einstellungen der Matrixgröße (Auflösung), der Schichtdicke und -position sowie des abgebildeten Areals (Field of View) bei allen Sequenzen immer gleich.

↓25

Tab.3.1: PARAVISION-Parameter der T2-gewichteten Sequenz

T2-gewichtete RARE-Sequenz

Nucleus

1H

Repetitionszeit

3300 ms

Echozeit

11 ms

Effektive Echozeit

88 ms

Rare-Faktor

16

Anzahl der Mittelungen

4

Gesamtmeßzeit

1 min 50 s

Matrixgröße

128 x 128 Pixel

Schichtdicke

2 mm

Schichtabstand

0 mm

Anzahl der Schichten

9

Field of View

42,5 mm

Schicht-Schema

sequentiell

Puls-Form

Hermite

Verstärkung

π/2-Attenuation

20 dB

π-Attenuation

13 dB

Receiver Gain

120 dB

Der venöse Zugang für die Kontrastmittelapplikation im Rahmen der T1-gewichteten Bildgebung wurde vor der Positionierung des Tieres im Magnetfeld durch Punktion einer lateralen Schwanzvene mit einer Venenverweilkanüle (Neoflon® 24G / 19 mm; Helsingborg, Schweden) gelegt. Nach einer T1-Nativaufnahme wurde der Katheter zuerst mit 0,9 % physiologischer NaCl-Lösung angespült, daraufhin das Kontrastmittel Magnevist® (Gadopentensäure, Dimeglumin-Salz; Fa. Schering) in einer Dosierung von 0,1 mg/kg KG appliziert und mit 0,4 ml 0,9 % NaCl-Lösung nachgespült.

Zur Erfassung der Verteilung des Kontrastmittels wurden 30 Sekunden nach der Kontrastmittelapplikation weitere T1-Aufnahmen im 5 Minuten-Intervall gestartet (Parameter s. Tab. 2).

↓26

Tab.3.2: PARAVISION-Parameter der T1-gewichteten Sequenz

T1-gewichtete MSSE-Sequenz

Nucleus

1H

Repetitionszeit

500 ms

Echozeit

11 ms

Anzahl der Mittelungen

8

Gesamtmeßzeit

4 min 20 s

Matrixgröße

128 x 128 Pixel

Schichtdicke

2 mm

Schichtabstand

0 mm

Anzahl der Schichten

9

Field of View

42,5 mm

Schicht-Schema

sequentiell

Puls-Form

Hermite

Verstärkung

π/2-Attenuation

19 dB

π-Attenuation

13 dB

Receiver Gain

250 dB

Nach Beendigung der Messreihe wurde das Tier aus der Fixierung gelöst, die Narkosezufuhr beendet und mit 0,8 l O2 / min ventiliert. Der venöse Zugang konnte zwischen der 90-Minuten- und der 6 Stunden-Messung in situ belassen werden, mußte danach aber entfernt werden.

Zwischen den Messungen 24-, 48- und 168-Stunden nach Trauma hatten die Ratten in ihren Käfigen freien Zugang zu Futter und Wasser.

↓27

Die Gehirnentnahme erfolgte im Anschluß an die letzte Messung, d.h. eine Woche nach Trauma.

3.2.7 Verabreichung des Bradykinin-B2-Rezeptorantagonisten LF 16.0687 Ms

Der spezifische Bradykinin-B2-Rezeptorantagonist LF 16.0687 Ms (Laboratoires Fournier, Daix, Frankreich) in den Dosierungen 3mg/kg KG und 30mg/kg KG bzw. die entsprechende Menge 0,9 % NaCl-Lösung wurde fünf Minuten nach der Kontusionierung subkutan in den linken unteren Quadranten des Abdomens injiziert. Bei allen Tieren zeichnete sich dort eine deutliche Quaddel ab. Während der Applikation, 1 Minute danach und im 5-Minuten-Abstand bis 20 Minuten nach Injektion wurde zur Erfassung einer eventuellen vasoaktiven Wirkung der Substanz der Blutdruck protokolliert.

Im Rahmen der magnetresonanztomographischen Unterschuchungen wurde nach dem gleichen Schema vorgegangen. Aus technischen Gründen erfolgte keine Erfassung des Blutdruckes. Ausgehend von den Ergebnissen der ersten Studie wurde der B2-Rezeptor-Antagonist nur in der niedrigen Dosierung verabreicht. Die bereits oben erwähnten MRT-Messreihen wurden zu den Zeitpunkten 6 und 24 Stunden durchgeführt und das Gehirn direkt im Anschluß an die letzte Messung entnommen. Daran anschließend wurde der Schwellungswert sowie der Wassergehalt der einzelnen Hemisphären gravimetrisch bestimmt.

3.2.8 Überwachung des mittleren arteriellen Blutdruckes (MABP)

↓28

Zur Messung des arteriellen Blutdruckes (MABP) wurde die rechte Femoralarterie kanüliert. Nach der Rasur und Inzision der Leistenregion wurde die nach oben verlaufende A.femoralis superficialis mittels einer Bipolarpinzette(Koagulationsgerät Typ T100, Fa. Aesculap-Werke AG, Tuttlingen) koaguliert. Die A. femoralis wurde aus ihrem bindegewebigen Bett von der parallel verlaufenden V. femoralis und dem N. femoralis bis zum Lig.inguinale gelöst, danach distal ligiert und proximal angezügelt (Ligatur: Seide geflochten 0,5 metr. 7/0, Fa. Ethicon, Norderstedt). Nach der Inzision mit einer Mikroschere wurde die Arterie mit einem Kunstoffkatheter (Polythene Tubing, Innendurchmesser = 0,28 mm, Außendurchmesser = 0,61 mm, Fa. Portex, England) katheterisiert. An dessen Ende wurde eine modifizierte Kanüle (Luer 24G x 1“, 0,55 x 25, Fa. Braun, Melsungen) aufgesteckt, um den Katheter mit dem Druckaufnehmer (Einmaltransducer zur invasiven Blutdruckmessung, Fa. Abbott, Wiesbaden) zu verbinden. Der Katheter wurde sowohl durch direktes Anknoten als auch durch eine Sicherheitsschlaufe gesichert und die Wunde einschichtig mit Prolene® (Prolene monofil 4/0, Fa. Ethicon, Norderstedt) verschlossen. Der Verlegung des Katheters durch Thrombenbildung wurde bei Abflachung der Blutdruckkurve durch kurzes Anspülen mit isotoner 0,9 % NaCl-Lösung vorgebeugt. So wurde hier der Einsatz von Heparin vermieden.

Nach Beendigung der Blutdruckmessung wurde das proximale Ende des arteriellen Katheters ligiert. Es folgte der einschichtige Verschluß des Hautschnittes und die Narkoseausleitung.

3.2.9 Blutentnahmen

Zur arteriellen Blutgasanalyse (BGA) (Gerät: Spectrometer Kopenhagen ABL 520, Fa. Spectrometer Kopenhagen, Willich) wurden ca. 0,2 ml Blut mit einer heparinisierten 1ml Spritze (Omnifix - F 1ml, Fa. Braun, Melsungen) abgenommen (vorher wurde der Katheterinhalt mit einer NaCl-gefüllten Spritze zur Säuberung des Katheters aspiriert). Hierbei wurden die Parameter: pH, pO2, pCO2, Standardbicarbonat, Basenüberschuß und der Hämoglobingehalt bestimmt.

↓29

Diese Blutentnahmen fanden vor Trauma, 25 Minuten und 5 Stunden nach CCII sowie kurz vor der Hirnentnahme (24h nach CCII, nach erneuter Kanülierung des schon zuvor verwendenten Gefäßes) unter kontrollierter Narkose der Tiere statt. Nach der Blutentnahme 5 Stunden nach Trauma wurde der Katheter vollständig entfernt, die Femoralarterie ligiert und die Wunde einschichtig verschlossen.

3.2.10 ICP-Messung

24 Stunden nach Traumatisierung erfolgte eine erneute Katheterisierung der rechten A. femoralis in Narkose. Zur Positionierung der ICP-Sonde wurden die Ratten in den stereotaktischen Rahmen eingespannt. Zur Messung des intrakraniellen Druckes (ICP) wurde auf der kontralateralen Seite der Kalotte ein Bohrloch gesetzt, das 3 mm von der Sutura sagittalis und ungefähr auf Höhe des Traumaareals positioniert wurde.

Die ICP-Sonde (Microsensor ICP Transducer, Fa. Codmann & Shartleff Inc., Randolph USA) wurde über ein Interface (Interface control unit 82-6605, Fa. Codmann & Shartleff Inc., Randolph USA) mit dem ICP/Blutdruck/Temperatur-Monitor (Hellige Servomed) verbunden. Über einen am stereotaktischen Rahmen befestigten und feinjustierbaren Arm (Mikromanipulator) wurde die Sonde dann 6 mm in das Parenchym der kontralateralen Hemisphäre vorgeschoben und der ICP über 10 Minuten gemessen. Die ICP-Messung wurde aufgrund der Invasivität und der damit verbundenen möglichen Beeinflussung der Schwellungswerte insbesondere der nicht-traumatisierten Hemisphäre nur einmalig, kurz vor der Hirnentnahme vorgenommen.

3.2.11 Entblutung des Tieres und Hirnentnahme

↓30

Nach der ICP-Messung wurde das Tier entblutet. Dazu wurde ungefähr in Höhe der Injektionsstelle die Haut eingeschnitten, wobei der subkutan gelegene Injektionsbereich auf eventuelle lokale Reaktionen untersucht werden konnte. Anschließend wurde zur Entblutung der Tiere die Bauchhöhle eröffnet und die linke V. renalis durchtrennt. Sobald die daraus resultierende Blutung an Stärke abnahm, wurde die A. renalis und abschließend die Aorta abdominalis durchtrennt. Diese Vorgehensweise entleerte die venösen zerebralen Sinus vollständig.

Die Gehirne wurden durch Entfernung des Schädelknochens in situ freipräpariert. Zuerst wurde der Hirnstamm mit einem Schnitt durch die Vierhügelplatte genau zwischen den Colliculi superiores und den Colliculi inferiores getrennt und darauf das Großhirn vom Rhinencephalon durch einen Schnitt zwischen den frontalen Polen und den Bulbi olfactorii abgesetzt.

Ohne Unterbrechung folgte darauf die Trennung der Hemishären unter Zuhilfenahme eines Operationsmikroskops (Zeiss OPMI6-SFC, Zeiss Germany). Um die Hemisphären exakt in der Mitte trennen zu können, mußten bei größeren Schwellungswerten die Hemisphären mit einer Pinzette auseinandergedrängt und die angenommene Mittellinienverlagerung ausgeglichen werden. Der Trennungsfehler, d.h. die Abweichung von der „idealen Mittellinie“ konnte auf diese Weise so gering wie möglich gehalten werden. Auf die Bedeutung des Trennungsfehlers wird in Abschnitt 3.3.2.2 (S. 27) näher eingegangen.

3.3 Auswertungsmethoden

3.3.1  Auswertung der MRT-Bilddaten

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Die durch die Steuerungs- und Bildakquisitionssoftware Xwin-NMR mit einem Paravision TM-Modul gewonnenen 32-bit Bilddaten wurden anhand einer Konvertierungsroutine zu TIFF (Tagged Image File Format), US (Unsigned Short) und long-Bildformaten konvertiert. Diese Routine wurde durch die Abteilung für Medizinische Informatik (Professor Tolxdorff) entwickelt und ermöglichte eine Kompatibilität zu der DOS bzw. Windows-basierten Bildbearbeitungssoftware NIH- bzw. Scion-Image (Fa. Scion Corporation, USA).

3.3.1.1  Bestimmung des Ödemvolumens

Die Bestimmung des Ödemvolumens zu den verschiedenen Meßzeitpunkten wurde anhand der in der T2-gewichteten Bildgebung gewonnenen Bilddaten vorgenommen. Hierzu wurden die Daten jeder einzelnen akquirierten Schicht im Unsigned Short-Format (.us) analysiert.

Die Läsion wurde zuerst in der Schicht mit der größten Ödemausbreitung grob umrandet und dann mittels einer programmeigenen Funktion („density slice“) genau markiert (s. Abb. 5). Dies ermöglichte die segmentierte Betonung eines schmalen Spektrums der Graustufenwerte, das diejenigen Graustufenwerte des Gesamtbildes enthielt, welche Kontusion und Ödem abbildeten. Nachdem dieser Graustufenwert-Bereich auf die übrigen Schichten übertragen wurde, konnte die Fläche der segmentierten Heraushebung der Graustufenwerte vermessen werden. Auf diese Weise wurde das Läsionsareal für jede einzelne Schicht bestimmt.

↓32

Das in Pixeln angegebene Ergebnis mußte nun in das Pixel-Millimeter-Äquivalent (PMÄ) umgerechnet werden. Dazu wurde die Matrix (128 x 128 Pixel) anhand des Field of View (FoV / z.B. 42,5 mm x 42,5 mm) in Quadratmillimeter umgerechnet:

Um das Volumen zu berechnen, wurden die für die einzelnen Schichten erhaltenen Werte mit der Schichtdicke (hier: 2mm) multipliziert und dann addiert.

↓33

Abb. 3.5: Bestimmung des Ödemareals in der T2-gewichteten Bildgebung (Schicht 5)

3.3.1.2 Bestimmung des relativen Anteils des Ödemareales an der Hemisphäre

Zur Bestimmung des relativen Anteiles des Ödemvolumens an der traumatisierten Hemisphäre wurde diese vermessen, wobei die vorhandene Mittellinienverlagerung berücksichtigt wurde. Dabei wurde die Hemisphäre mit einem in die oben angegebene Auswertungssoftware integrierten Umrandungstool an den äußeren Rändern umfahren und die Mittellinie anhand des mittig liegenden III. Ventrikels bzw. Aquaeductus cerebri nachgezogen (s. Abb. 6).

Abb. 3.6: Bestimmung des Volumens der traumatisierten Hemisphäre (Schicht 5)

↓34

Dieser Vorgang wurde für jedes Bild dreimal wiederholt und die so gewonnenen Werte gemittelt. Diese Flächen wurden ebenfalls in das Pixel-Millimeter-Äquivalent (PMÄ) und schließlich zu einem Gesamtvolumen umgerechnet. Zusammen mit den zuvor berechneten Ödemvolumina konnte der prozentuale Anteil des Ödems am Volumen der traumatisierten Hemisphäre berechnet werden:

3.3.1.3 Bestimmung der hemisphäralen Schwellung

↓35

Das Gesamthirn wurde auf die gleiche Weise wie die traumatisierte Hemisphäre dreimal umrandet (s. Abb. 7). Anhand der so gewonnenen Werte wurde durch Subtraktion des Volumens der traumatisierten Hemisphäre vom Hirngesamtvolumen das Volumen der nicht-traumatisierten Hemisphäre ermittelt. So konnte analog zur gravimetrischen Analyse der Anteil der hemisphäralen Schwellung der traumatisierten Hemisphäre an der nicht-traumatisierten Hemisphäre bestimmt werden.

Abb. 3.7: Bestimmung des Gesamthirn-Volumens (Schicht 5)

3.3.1.4 Bestimmung der Kontrastmittelextravasation

Die Bestimmung der Kontrastmittelextravasation bzw. des Kontrastmittelrückhaltes wurde anhand T1-gewichteter Bilder vorgenommen. Vor Kontrastmittelapplikation wurde eine Nativ-T1-Aufnahme und nach Kontrastmittelapplikation vier Postkontrast-T1-Aufnahmen im 5-Minuten-Intervall akquiriert.

↓36

Abb. 3.8: Anflutung des Kontrastmittels in der T1-gewichteten Bildgebung 24 h nach CCII

Um den relativen Zuwachs an Kontrastmittelextravasation zwischen den vier Postkontrast-T1-Aufnahmen zu ermitteln (s. Abb. 8), wurde das Kontrastmittelextravasationsareal in der ersten Aufnahme nach Kontrastmittelgabe mit Hilfe der eingebauten Funktion Density Slice markiert und mit dem Umrandungstool grob umrandet. Die vorgenommene Umrandung konnte anhand einer programmierten Makro-Routine auf die korrespondierenden Schichten der weiteren drei Postkontrast-T1-Aufnahmen übertragen werden. Die programmierte Makro-Routine übernahm ebenfalls die Messung des Läsionsareals nach vorheriger Festlegung des Spektrums der im Läsionsareal vorkommenden Signalintensitäten (Graustufenwerte). Somit konnte ein Zuwachs oder eine Abnahme der Kontrastmittelextravasation zwischen den vier Postkontrast-T1-Aufnahmen festgestellt werden.

Die Zu- oder Abnahme wurde außerdem anhand der Differenz der Signalintensitäten (Graustufen) zwischen der gesamten traumatisierten und nicht-traumatisierten Hemisphäre und anhand spezifischer Meßpunkte innerhalb der beiden Hemisphären bestimmt.

↓37

Dafür wurde zuerst auf der Nativ T1-gewichteten Aufnahme die traumatisierte Hemisphäre mit dem Umrandungstool der Bildauswertungssoftware markiert und anschließend durch eine speziell programmierte Makro-Routine auf die korrespondierenden Schichten der nach der Kontrastmittelapplikation folgenden Aufnahmen kopiert. Die mittleren Signalintensitäten (Graustufenwerte) wurden ebenfalls im Rahmen dieser Routine erfaßt. Danach wurde zur Ermittlung der Signalintensitäten der nicht-traumatisierten Hemisphäre diese Hemisphäre umrandet und in der oben beschriebenen Weise vorgegangen (s. Abb. 9).

Abb. 3.9: Markierung der traumatisierten Hemisphäre in den T1-gewichteten Bildern

Aus den so gewonnenen Werten konnte nun die Differenz der Signalintensitäten zwischen traumatisierter und nicht-traumatisierter Hemisphäre ermittelt werden. Dazu wurde der Grad der Kontrastverstärkung (Degree of Contrast Enhancement) bestimmt [Holodny, 99]:

↓38

Ähnlich wurde bei der Messung spezifischer, in Richtung des Kontusionsstoßes liegender Meßpunkte (1: Läsionszentrum; 2: Ödemperipherie/Hippocampusregion; 3: Basalganglien-region) innerhalb der Hemisphären vorgegangen (s. Abb. 10).

Abb. 3.10: Spezifische Stoßrichtungs-Messpunkte in der traumatisierten und nicht-traumatisierten Hemisphäre (Schicht 5)

↓39

Außerdem wurden noch Meßpunkte, die nur innerhalb des Kortex lagen (1: Läsionszentrum; 2: Ödemperipherie 1; 3: Ödemperipherie 2; 4: Weiter entfernter Kortex) untersucht (s. Abb. 11). Dies erlaubte den Grad der Kontrastverstärkung zwischen dem Meßpunkt innerhalb traumatisierten Hemisphäre und dem korrespondierenden Punkt der nicht-traumatisierten Hemisphäre zu vergleichen.

Abb. 3.11: Spezifische Kortex-Messpunkte in der traumatisierten und nicht-traumatisierten Hemisphäre (Schicht 5)

3.3.2 Gravimetrische Bestimmung der posttraumatischen Hemisphärenschwellung

Die Hemisphärenschwellung wurde anhand des Feucht- und Trockengewichts gravimetrisch bestimmt. Hierzu wurden spezielle Wäagegläschen, die zuvor 24 Stunden in einem Trockenschrank (Typ T6060, Fa. Heraeus Instruments, Hanau) bei 110°C zur Entfernung der Luftfeuchtigkeit getrocknet wurden mit einer Feinwaage gewogen (Analytic Waage Typ A 210 P-OD1, Fa. Sartorius GmbH, Tuttlingen).

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Die Hemisphären wurden unmittelbar nach ihrer Trennung in die kurz zuvor gewogenen Wäagegläschen gegeben. Das Einzelgewicht der jeweiligen Hemisphäre errechnet sich folglich aus der Differenz des Gesamtgewichtes und des Gewichtes des Wäagegläschens.

Der Schwellungswert der traumatisierten Hemisphäre wurde mit folgender Formel aus den Feuchtgewichten der beiden Hemisphären berechnet [modifiziert nach [Elliot, 49]]:

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Wie aus der Formel ersichtlich, wird die Schwellung durch die nicht exakte Trennung beeinflußt. Bei einem positiven Trennfehler hat man die Hemisphären zu Gunsten der traumatisierten Hemisphäre getrennt. Bei einem negativen Trennfehler hat man zu Gunsten der nicht-traumatisierten Hemisphäre getrennt.

3.3.2.1  Zerebraler Wassergehalt

Nach Bestimmung des Feuchtgewichtes wurden die Hemisphären bei 110°C für 24 Stunden getrocknet. Durch die Ermittlung des Trockengewichtes der jeweiligen Hemisphären wurde nun der zerebrale Wassergehalt der einzelnen Hemisphären wie folgt bestimmt:

3.3.2.2 Bestimmung des Trennfehlers

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Anhand der Trockengewichte der traumatisierten Hemisphäre und der nicht-traumatisierten Hemisphäre wurde der Trennfehler berechnet:

Aufgrund einer nicht auf der idealen Mittellinie verlaufenden Trennung der beiden Hemisphären konnte der Trennfehler zu groß ausfallen. Je nachdem zugunsten welcher Hemisphäre man getrennt hatte, war der berechnete Wert der hemisphäralen Schwellung entsprechend zu groß oder zu klein. Bei Trennfehlern größer als 2,5 % wurde die untenstehende Korrekturformel angewandt [Deisenroth, 90]:

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3.3.3 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung erfolgte anhand des Programms SigmaStat 2.0 (Jandel Scientific, San Rafael, USA, die graphische Darstellung der Ergebnisse mit Hilfe des Programms SigmaPlot 5.0 (Jandel Scientific, San Rafael, USA).

Zur statistischen Auswertung für Veränderungen im zeitlichen Verlauf wurde die Varianzanalyse (ANOVA) vorgenommen, gefolgt von der post-hoc Korrektur (Tukey-Test) für den paarweisen mehrfachen Vergleich. Das Signifikanzniveau wurde bei p<0,05 angenommen. Die Datendarstellung erfolgte als Mittelwert ± Standardfehler. Korrelationen wurden mit dem Spearmanschen Korrelationskoeffzienten beschrieben.


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29.11.2006