Drabner, Birgit: Charakterisierung und Identifizierung von immundominanten Bereichen der L3-Chitinase von Onchocerca volvulus

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Kapitel 1. Einleitung

Die Ordnung der Filariida besteht aus fadenförmigen, ovoviviparen, getrenntgeschlechtlichen, gewebe-oder körperhöhlenbewohnenden Würmern mit indirekter Entwicklung. Wichtige Erreger von Parasitosen des Menschen gehören in diese Gruppe: Wuchereria bancrofti und Brugia malayi (Erreger der Elephantiasis), Loa loa (Erreger der Kamerunbeule) und Onchocerca volvulus (Erreger der Flußblindheit oder Onchozerkose). Weltweit sind 18 Million Menschen in den Ländern West- und Ostafrikas, in Mittelamerika und Jemen an Onchozerkose erkrankt. Dabei verläuft die Krankheit nicht tödlich, sondern führt durch den chronischen Verlauf zu degenerativen Veränderungen und zu Blindheit. Dies hat große sozio-ökonomische Folgen für die betroffenen Regionen.

1.1. Die Immunantwort bei Filariosen

Die Bewohner in Endemiegebieten entwickeln trotz ähnlicher Exposition gegenüber den Vektoren sehr unterschiedliche Infektionsverläufe und Krankheitsbilder. King und Nutman (1991) teilten die Bevölkerung gemäß ihrer Pathologie und ihres Immunstatus in verschiedene Gruppen ein.
Die meisten Menschen in afrikanischen Endemiegebieten leiden an einer generalisierten Onchozerkose. Die Patienten zeigen eine abgeschwächte oder kaum sichtbare Pathologie, obwohl sich Mikrofilarien in ihrer Haut nachweisen lassen. Untersucht man ihre peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC), so zeigen sie eine deutlich verminderte parasitenspezifische Zellproliferation, verbunden mit einer abgeschwächten IL-2- und INF--Produktion (Greene et al. 1985, Gallin et al. 1988, Ward et al. 1988). Auch die Proliferation auf Bakterienantigene ist eingeschränkt. Bartlett et al. (1978) konnte beobachten, daß die Überempfindlichkeit vom verzögerten Typ (DTH) in vivo abgeschwächt ist oder völlig fehlt. Alle diese Anzeichen lassen auf eine generalisierte Immunsuppression schließen. Dem gegenüber stehen Patienten, bei denen man keine oder nur sehr wenig Mikrofilarien in der Haut nachweisen kann. Sie zeigen aber eine sehr starke zelluläre und humorale Reaktivität auf parasitenspezifische Antigene (Greene et al. 1983, Piessens et al. 1980) und reagieren bei in vivo-Hauttest mit O. volvulus-Antigen mit einer zellulären Überempfindlichkeitsreaktion (Bartlett et al. 1978). Da die spezifische humorale und zelluläre Immunantwort dieser Patienten hyperreaktiv ist, kommt es zu starken Hautveränderungen, meist an den Extremitäten (lokalisierte Onchozerkose) (Ngu 1978, Brattig et al. 1987).


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Es lassen sich in den Endemiegebieten aber auch Menschen finden, die keine Mikrofilarien in der Haut haben und auch keinerlei Pathologie zeigen. Bei der Untersuchung der PBMC dieser Gruppe konnte von Nutman et al. (1987) eine sehr starke Reaktivität auf parasitenspezifisches Antigen gefunden werden. Zusätzlich produzierten sie nach Stimulation mit O. volvulus-Antigen signifikant mehr IL-2 (Ward et al. 1988), und in ihren Seren konnten nur verminderte parasitenspezifische IgG- und IgE-Titer nachgewiesen werden.
Diese Menschen scheinen eine ädäquate Immunantwort gegen den Parasiten auszubilden und werden daher als „putative immunes" (vermeintlich Immune) bezeichnet (WHO 1987).

1.2. Die Nagetierfilarie Acanthocheilonema viteae

Untersuchungen über die Mechanismen von Immunität, Toleranz und Pathologie der Onchozerkose sind auf Grund der strengen Primaten-Spezifität nur eingeschränkt möglich, so daß auf Tiermodelle ausgewichen werden muß, die Rückschlüsse auf die humanpathogenen Arten erlauben. Hier eignet sich der natürliche Zyklus der Nagetierfilarie A. viteae in der Wüstenrennmaus Meriones unguiculatus (Abb.1). In diesem Zyklus dient die Lederzecke Ornithodoros moubata als Zwischenwirt, die bei der Blutmahlzeit Mikrofilarien (Mf) aufnimmt. Diese können sich dann innerhalb von 6 Wochen durch zweimaliges Häuten zu infektiösen Drittlarven (L3) entwickeln. Bei einer erneuten Blutmahlzeit werden diese L3 auf den Endwirt (M. unguiculatus) übertragen, wo sie sich über das L4-Stadium zu Adulten entwickeln. Die Männchen (1,5-3cm) und Weibchen (3-7cm) halten sich im subkutanen Bindegewebe auf, wo es zur Befruchtung der Weibchen kommt. Diese entlassen ungescheidete Mikrofilarien, die im Blut zirkulieren. Dabei verursachen die Filarien nicht die typischen Haut- und Augenveränderungen wie O. volvulus, sondern werden von M. unguiculatus gut toleriert. Trotzdem können gefundene Ergebnisse wichtige Hinweise für die humane Parasitose liefern, da sich die Adultwürmer wie bei der Onchozerkose im subkutanen Bindegewebe aufhalten. Zudem konnten hohe Homologien von Antigenen auf molekularer Ebene zwischen O. volvulus und A. viteae gefunden werden (Willenbücher et al. 1993, Adam et al. 1996).


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Abb. 1:Entwicklungszyklus von Acanthocheilonema viteae (Zeichnung aus dem Archiv des Lehrstuhls für Molekulare Parasitologie)

1.3. Rolle der Chitinase im Infektionsverlauf

Chitinasen treten an zwei essentiellen Punkten des Filarienzyklus auf: Während des Eischlupfes und bei der Häutung von L3 zu L4. Filarien sind lebendgebärend, dabei ist das erste Larvenstadium (Mikrofilarien) bei manchen Arten von der Eihülle umgeben (sog. „gescheidete Mikrofilarien“), während bei anderen Arten die Mikrofilarien nur bis zur Geburt von der Eihülle geschützt werden („ungescheidete Mikrofilarien“). Da nachgewiesen werden konnte, daß Eihüllen von Filarien Chitin besitzen (Brydon et al. 1987), liegt eine Beteiligung der Chitinase während des Eischlupfes nahe. Färbungen mit immungoldmarkierten Antikörpern konnten Chitinase bei Onchocerca spp. und A.viteae in uterinen Stadien nachweisen (Brydon et al. 1987, Adam et al. 1996), während bei gescheideten Arten Chitinase auf der Oberfläche der Mikrofilarien im Blut gefunden werden konnte (Fuhrman et al. 1995). Untersuchungen von Kaltman (1990) konnten mit Hilfe eines monoklonalen Antikörpers, der die A. viteae-Chitinase in Immunblots von L3-Antigenen und im L3-Kulturüberständen erkannte, zeigen, daß die Produktion von Chitinase durch Kulturbedingungen von


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Wirbeltieren (Wirbeltier-Zellkulturmedium und 37°C) ausgelöst wird. Eine Reduktion der Temperatur auf 28 °C schränkte die Produktion der Chitinase ein, während nach Kultivierung der Chitinase in Insektenmedium und bei 28°C keine Chitinase nachgewiesen werden konnte. Diese Befunde werden durch die Ergebnisse von Wu et al. (1996) unterstützt, die eine Produktion von Chitinase 3-6 Tage unter Kulturbedingungen für Wirbeltiere während der Häutung von L3 zu L4 finden konnten. Durch weitere Untersuchungen mit monoklonalen Antikörpern konnte die Chitinase im zellulären Zytoplasma und im glandulären Ösophagus der L3 lokalisiert werden (Adam et al. 1996). Welche Rolle die Chitinase während der Häutung von L3 zu L4 spielt, ist jedoch noch nicht endgültig geklärt. Eine Möglichkeit wäre der Beitrag der Chitinase, die chitinhaltigen Mundwerkzeuge der Vektoren zu durchbrechen, damit die L3 in das Blut des Wirtes gelangen. Hierzu sind aber keine weiteren Studien durchgeführt worden. Eine andere denkbare Aufgabe der Chitinase könnte in der Interaktion mit Wirtsmolekülen in der frühen Phase der Infektion bestehen. Dabei könnten Moleküle der extrazellulären Matrix mögliche Angriffspunkte darstellen, so daß die Migration durch das Wirtsgewebe erleichtert wird. Diese These wird durch das Vorhandensein von chitinaseähnlichen Vertebraten-Molekülen (z.B. HC gp-39) unterstützt, denen eine Rolle bei der Degradierung von Vertebraten-Gewebe zugeschrieben wird (Hakala et al. 1993). Die dritte Möglichkeit ist die Beteiligung der Chitinase beim Häutungsprozeß der L3 zu L4. Während der Häutungsphase wird der Inhalt des glandulären Ösophagus vollständig in die Zwischenräume ausgeschüttet (Strote und Bonow 1991). Hier könnte die Chitinase bei der Degradierung der L3-Kutikula mitwirken, so daß das Schlüpfen der L4 erleichtert wird.

1.4. L3-Chitinase als potentieller Impfstoffkandidat

Das Auftreten von Chitinase wurde immer im Zusammenhang mit Protektion beschrieben. Die ersten Hinweise lieferten die Untersuchungen von Canlas et al. (1984), die durch die passive Immunisierung von M. unguiculatus mit dem monoklonalen Antikörper MF1 die Anzahl der zirkulierenden B. malayi-Mikrofilarien verringern konnten. Später konnten Fuhrman et al. (1992) das Zielantigen des MF1 als B. malayi-Mf-Chitinase identifizieren. Immunisierungen mit rekombinanter Chitinase, die als Fusionsprotein mit dem Maltose-Bindungs-Protein (MBP) in Escherichia coli exprimiert wurde, erzielte in M. unguiculatus eine Reduzierung der Mikrofilarienlast nicht jedoch der Adultwurmlast (Wang et al. 1997). Einen weiteren Hinweis auf die protektiven Eigenschaften der Chitinase lieferten Analysen der Antikörperantworten von immunisierten M. unguiculatus. Dabei stellt die


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Immunisierung der M. unguiculatus mit strahlungsattenuierten L3 den effektivsten Weg dar, die Tiere vor einer Belastungsinfektion zu schützen (Lucius et al. 1991). Vergleicht man nun die Seren der geschützten Tiere mit denen infizierter Tiere, so erkennen Antikörper geschützter Tiere differentiell eine Bande bei 205 kDa und 67 kDa im Immunblot. Adam et al. (1996) identifizierten diese Proteine als Monomer und Trimer der L3-Chitinase. Gestützt werden diese Ergebnisse von Untersuchungen im Humansystem. Hier konnte ein chitinaseähnliches Protein von Antikörpern der vermeintlich Immunen erkannt werden, während W. bancrofti-infizierte Patienten keine Antikörper gegen dieses Protein im Serum enthielten. Dieses 43 kDa große Protein wurde aus der genomischen Expressionsbibliothek von W. bancrofti isoliert. Durch Sequenzvergleiche konnte das Protein als ein Chitinase-ähnliches Protein identifiziert werden (Raghavan et al. 1994).
Erste Immunisierungsversuche im A.viteae-Meriones-Modell mit der L3-Chitinase von A. viteae und O. volvulus konnten einen Trend zur Protektion zeigen. Während die Applikation der A. viteae-L3-Chitinase mit dem Adjuvans STP in zwei Versuchen zu keiner signifikanten Reduktion der Wurmlast führte, konnte die Gabe von Salmonellen, die A. viteae-L3-Chitinase exprimierten, einen signifikanten Schutz vor einer Belastungsinfektion bewirken, der jedoch nicht reproduzierbar war (Adam pers. Mitteilung). Der Einsatz der O. volvulus-L3-Chitinase mit komplettem Freund Adjuvans (Wu et al., pers. Mitteilung) konnte die Tiere nicht vor einer Belastungsinfektion schützen. Die Immunisierung mit cDNA, die für Chitinase codierte, konnte in einem Experiment einen signifikanten Schutz erzielen, während in einem zweiten Versuch die Wurmbürde nicht signifikant vermindert war (Harrison et al. 1999). Durch diese Versuche wird deutlich, daß nach Immunisierungen mit L3-Chitinase ein Trend zur Protektion besteht. Optimierungsschritte sind notwendig, die gefundenen Ergebnisse zu bestätigen.
In diesen Studien wurden nur die Antikörperantworten der Tiere untersucht. Die immunologische Charakterisierung der putativ Immunen hat gezeigt, daß diese Gruppe sich durch eine erhöhte T-Zell-Reaktivität (Nutman et al. 1987), verbunden mit einer erhöhten IL-2-Produktion (Ward et al. 1988) auszeichnet. Einen weiteren Hinweis auf eine Beteiligung der zellulären Immunantwort lieferten Untersuchungen von Soboslay et al. (1992), die einen Anstieg der T-Zell-Reaktivität bei PBMC von Patienten mit generalisierter Onchozerkose nach Behandlung mit dem Medikament Ivermectin® beobachteten.
Ob und wie T-Zell-Antworten bei der Eliminierung der Krankheit eine Rolle spielen, müssen weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet zeigen. Dabei könnten neben der zellulären Reaktivität von Gesamt-Proteinen auch T-Zell-Epitope, die durch Algorithmen innerhalb des Proteins vorhergesagt werden, eingesetzt und untersucht werden.


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1.5. Ziele der Arbeit

In der vorliegenden Arbeit sollte das protektive Potential der L3-Chitinase von O. volvulus untersucht werden. Dazu sollte die cDNA der Chitinase in einen prokaryotischen Expressionsvektor kloniert und exprimiert werden, um anschließend das Protein mittels Affinitätschromathographie aufzureinigen. Zusätzlich sollte das C-terminale Ende des Moleküls, das für die Chitin-Bindung verantwortlich ist (Tellam et al. 1996), in gleicher Weise bearbeitet werden. Durch diese Domäne sollte das protektive Potential der Chitinase näher charakterisiert und immundominante Bereiche innerhalb des Proteins lokalisiert werden. Die Überprüfung des protektiven Potentials der OvL3-CBD und der OvL3-Chitinase sollte in dem Tiermodell A. viteae-Meriones durch die Rückfindungsrate von adulten Würmern erfolgen. Dabei sollte nicht nur die Schutzrate der immunisierten Tiere ermittelt werden, sondern die Analyse der Antikörperantworten sollte Hinweise auf die Ausprägung einer bestimmten Immunantwort der Tiere liefern.
Da für den Immunisierungserfolg nicht nur das Antigen von entscheidender Bedeutung ist, sollten Immunisierungsstudien mit verschiedenen Adjuvantien durchgeführt werden. Dabei sollte neben der Reaktivität der Chitinase ohne Adjuvans der Einfluß und die Fähigkeit von Adjuvantien geprüft werden, Immunantworten in bestimmte Richtungen zu verschieben.
Zusätzlich sollte die Charakterisierung und Identifizierung von T-Zell-Epitopen innerhalb der Chitinase erfolgen. Dazu sollten drei verschiedene T-Zell-Algorithmen verwendet werden. Die vorhergesagten T-Zell-Epitope sollten synthetisch hergestellt und in T-Zell-Proliferationsassays eingesetzt werden. Ein Set überlappender Peptide, die die Gesamtheit der Chitinase umfaßten, sollte gewährleisten, daß möglichst viele T-Zell-Epitope innerhalb der Chitinase entdeckt werden. Die Algorithmen sollten außerdem auf ihre Genauigkeit und Zuverlässigkeit geprüft werden. Dies sollte durch die Beurteilung von Sensitivität und Spezifität der einzelnen Algorithmen und der Kombination der Algorithmen erfolgen, um Rückschlüsse auf die Anwendbarkeit der Algorithmen auf große Datenbanken ziehen zu können.


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Tue Jun 13 12:06:57 2000