Drabner, Birgit: Charakterisierung und Identifizierung von immundominanten Bereichen der L3-Chitinase von Onchocerca volvulus

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Kapitel 2. MATERIAL und METHODEN

2.1. Molekularbiologische Methoden

2.1.1. Polymerase Ketten Reaktion (PCR)

Die PCR dient zur enzymatischen Vermehrung spezifischer DNA-Sequenzen. Hierfür ist es notwendig, vom 5‘- und vom 3‘-Ende der zu amplifizierenden Sequenz DNA-Abschnitte zu kennen, die den zu amplifizierenden DNA-Abschnitt flankieren.
Die PCR ist in drei Schritte unterteilt, die sich in genau definierten Zyklen wiederholen.
(1) Zuerst erfolgt die Denaturierung der DNA, (2) gefolgt von der Anlagerung spezifischer Primer (annealing) und (3) schließlich die Verlängerung der einsträngigen DNA (extension). Hierbei werden die Primer durch die DNA-Polymerase in 3‘-Richtung verlängert. Durch erneutes Erhitzen wird die doppelsträngige DNA getrennt und es kann sich ein neuer Zyklus anschließen.
Für die Amplifikation der O. volvulus-L3-Chitinase und der Chitin-Binde-Domäne (CBD) wurden Primer verwendet, bei denen eine Schnittstelle (in der Sequenz fett dargestellt) eingefügt wurde. Dies diente dazu, die amplifizierte DNA über die Schnittstellen in einen anderen Vektor setzen zu können.

5‘-Primer mit BamHI-Schnittstelle für die O. volvulus-L3-Chitinase: 5‘ > CCG GAT CCT ATG TTC GAG GAT GCT ATT ATA C < 3‘
5‘-Primer mit BamHI-Schnittstelle für die O. volvulus-Chitin-Binde-Domäne: 5‘>ATG GAT CCA CGA CAA CGA TTG CTG TTG<3‘
3‘-Primer mit HindIII Schnittstelle für die O. volvulus-L3-Chitinase und die Chitin-Binde-Domäne: 5‘> TTT AAG CTT TTC ATC GCA TTC ACC AAA<3‘

Für die Amplifikation wurde der folgende Reaktionsansatz verwendet:
DNA: 1-5µl (je nach Konzentration)
5‘-Primer: 1µl (10pmol)
3‘-Primer: 1µl (10pmol)
MgCl2: 2µl (50mM)
10x PCR Puffer: 5µl
Taq: 0,2µl (5U/µl)
ddH2O: ad 50µl


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Zur Amplifikation der Chitinase und der CBD wurde folgender Zyklus verwendet:
Die Proben wurden zunächst 10min bei 94°C denaturiert und die DNA in 30 Zyklen amplifiziert. Jeder Zyklus bestand aus einer 15sec. Denaturierungsphase bei 94°C, gefolgt von einer 30sec. Annealingphase bei 57°C und einer 2minütigen Extensionsphase bei 72°C. Im Anschluß an den 30. Zyklus wurde die PCR bei 72°C für 5min beendet, gefolgt von einer Kühlphase bei 4°C bis zur Weiterverarbeitung.

2.1.2. Klonierung der O. volvulus-L3-Chitinase und der O. volvulus-L3-Chitin-Binde-Domäne in den Expressionsvektor pQE 30

Um die O. volvulus-L3-Chitinase in den Expressionsvektor pQE 30 (Qiagen, Hilden, Deutschland) klonieren zu können, war es notwendig, die DNA der O. volvulus-L3-Chitinase mit Primern, die eine Schnittstelle beinhalteten, zu amplifizieren. In den 5‘-Primer wurde eine BamHI-Schnittstelle und in den 3‘-Primer eine HindIII-Schnittstelle integriert. Das generierte PCR-Produkt wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt, aus dem Gel herausgeschnitten und eluiert (Kitsystem der Firma Qiagen). Die so gewonnene DNA wurde in einen T-overhang Vektor (pGEM-T, Promega, Mannheim) ligiert und in kompetente Bakterien transformiert. Positive Klone wurden anhand von Blau-Weiß-Screening identifiziert. Von diesen Klonen wurden Kulturen, die über Nacht bei 37°C kultiviert wurden (Ü/N-Kultur), angelegt. Am nächsten Tag wurde die DNA mittels Minipräparation (Kitsystem der Firma Qiagen) gewonnen. Es erfolgte ein Restriktionsverdau mit den Enzymen BamHI/ HindIII und eine Auftrennung im Agarosegel. Konnte ein Insert aus diesem Vektor herausverdaut und im Gel detektiert werden, wurde die Bande herausgeschnitten und die DNA des Inserts aus dem Gel eluiert. Dieses Produkt wurde in den Expressionsvektor pQE 30 ligiert, der zuvor mit den Enzymen BamHI/ HindIII linearisiert und mit Hilfe der alkalischen Phosphatase (SAP = Shrimps alkalische Phosphatase, Boehringer Mannheim, Deutschland) dephosphoryliert worden war. Die Ligationsansätze wurden zu einer Transformation von kompetenten Escherichia coli des Stammes XL-1 blue eingesetzt. 200µl von jedem Ansatz wurden auf Agar-Platten ausgestrichen, denen Ampicilin mit einer Endkonzentration von 50µg/ml zugesetzt worden war. Am nächsten Tag wurden gewachsene Kolonien über das oben genannte Verfahren (Ü/N-Kultur, Minipräparation, Restriktionsverdau) auf Einbau des Inserts überprüft. Ebenso wurde mit der cDNA der Chitin-Binde-Domäne verfahren.


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2.1.3. Expression der O. volvulus-L3-Chitinase und der Chitin-Binde-Domäne in E. coli

Für die Expression der O. volvulus-L3-Chitinase und der Chitin-Binde-Domäne wurden je 10ml LB-Amp. mit einer Einzelkolonie der Plasmid tragenden Bakterien angeimpft und über Nacht bei 37°C schüttelnd (220rpm) inkubiert. Die Ü/N-Kultur wurde auf zwei 500ml LB-Amp.-Kulturen aufgeteilt und weiter bei 37°C schüttelnd inkubiert. Bei einer OD600 = 0,4-0,5 wurde die Expression mit 5mM IPTG bei der Chitinase bzw. 1mM IPTG bei der CBD induziert und die Bakterien wurden für weitere 3-4h kultiviert. Anschließend wurde die Kultur abzentrifugiert (6000g, 15min, 4°C), der Überstand verworfen und das Bakterienpellet bis zur weiteren Verwendung bei -20°C eingefroren.


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2.1.4. Aufreinigung der O. volvulus-L3 Chitinase aus E. coli-Lysat

Das eingefrorene Bakterienpellet wurde in 20ml 8M Harnstoffpuffer (pH 8,0) aufgenommen und für eine Stunde lysiert. Anschließend wurden die Bakterien zweimal für eine Minute bei 30% Leistung (60W) auf Eis mit einem Ultraschallgerät beschallt (Heinemann, Schwäbisch-Gmünd, Deutschland).
Die Suspension wurde bei 10 000g, 4°C für 15min zentrifugiert. Der Überstand wurde zu einer Nickel-Matrix-Agarose (Quiagen) gegeben, die zuvor mit 8M Harnstoffpuffer (pH 8,0) äquilibiert wurde. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur, wurde die Matrix in eine Säule gegeben, die an ein Chromatographie System (Biorad, München, Deutschland) angeschlossen war. Es folgten Waschschritte mit 8M Harnstoff-Puffern, die einen absteigenden pH-Wert besaßen. Bei pH 4,5 wurde das Protein eluiert und in 1ml Fraktionen aufgefangen. Ein Aliquot jeder Fraktion wurde zur Kontrolle auf ein SDS-Gel aufgetragen. Es schloß sich eine Dialyse an, bei der die Proteine über eine ein-molare Harnstofflösung bis in PBS/0,5M NaH2PO4 /1M Tris/2% Glycerin dialysiert wurden. Teile des Proteins wurden nur gegen 1M Harnstoff dialysiert. Ein anderer Teil des Proteins wurde durch Passage über einen Membranfilter mit 0,22µm Porengröße sterilfiltriert. Anschließend wurde es in 1ml-Fraktionen aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20ºC gelagert.

2.1.5. Aufreinigung der O. volvulus-L3-Chitin-Binde-Domäne (CBD) aus E. coli-Lysat

Das Bakterienpellet wurde in 20ml Bindungs-Puffer aufgenommen. Nach Zugabe von Lysozym (100µg/ml; Sigma, Deisenhofen, Deutschland), DNase (70U/µl; Gibco, Karlsruhe, Deutschland) und 0,1% Triton-X-100 (Serva, Heidelberg, Deutschland) erfolgte eine Inkubation bei 30ºC für 30min. Anschließend wurden die Bakterien sechsmal für 10sec. bei 30% Leistung (60W) auf Eis ultrabeschallt. Die Suspension wurde bei 10 000g, 4°C für 15min zentrifugiert. Der Überstand wurde zu einer Nickel-Matrix-Agarose (Quiagen) gegeben, die zuvor mit 20ml Bindungspuffer äquilibriert worden war. Es folgten Waschschritte mit Bindungspuffer und mit Waschpuffer. Das Protein wurde mit Elutionspuffer von der Matrix verdrängt und in 1ml-Fraktionen aufgefangen. Ein Aliquot wurde zur Kontrolle auf ein SDS-Gel aufgetragen. Es schloß sich eine Dialyse gegen PBS/0,05% Triton-X-100 an. Dann wurde ein Teil des Proteins durch Passage über einen Membranfilter mit 0,22µm sterilfiltriert, in 1ml-Fraktionen aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20 º C gelagert.

2.1.6. Klonierung der O. volvulus-L3-Chitinase in den Salmonellenvektor pTECH

Das PCR-Produkt mit den eingefügten BamHI- und HindIII-Schnittstellen wurde zusätzlich in den Salmonellenvektor pTECH kloniert. Dazu wurde der Vektor mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII linearisiert und mit SAP dephosphoryliert. Es erfolgte die Ligation des gereinigten PCR-Produktes in den vorbereiteten Vektor mit Hilfe der T4-Ligase (New England Biolabs, Niederlande) über Nacht bei 4°C.

2.1.7. Expression der O. volvulus-L3-Chitinase in Salmonella typhimurium

Die Klonierung der Chitinase in den Vektor pTECH führte zu einer Fusion mit dem hochimmunogenen, aber atoxischen TetC-Fragment. Dieses 50kDa große Fragment und das Fremdprotein sind durch eine Hinge-Region mit einander verbunden, um eine optimale Faltung zu ermöglichen. Eine kontinuierliche Expression dieses Fusionsproteins erfolgt unter anaeroben Bedingungen ohne externe Induktion (Oxer et al. 1991). Nach erfolgreicher Ligation wurde das Konstrukt in den Salmonellenstamm SL 3261 transformiert und die Klone auf Expression untersucht. Dazu wurde eine Einzelkolonie in 2ml LB-Amp. angeimpft und Ü/N bei 37°C und 150rpm inkubiert. Am nächsten Tag wurden 150 µl der Übernachtkultur in weitere 2ml LB-Amp. überführt und bei 37°C und 150rpm bis zu einer OD650 von 0,5 kultiviert. Die Ansätze wurden für 20min auf Eis inkubiert und


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nachfolgend abzentrifugiert (20800g, 15min, 4°C). Die Expression wurde durch einen Immunblot mit einem monospefizischen Mausserum gegen OvL3-Chitinase nachgewiesen.

2.1.8. Lebendkeimzahlbestimmung von Salmonella typhimurium

Die Immunisierung der BALB/c-Mäuse erfolgte mit ca. 107-109 CFU/0,2ml über eine Schlundsonde. Zur Bestimmung der Lebendkeimzahl wurde die Korrelation zwischen optischer Dichte der Bakterienkultur und der Anzahl von Salmonellen herangezogen. Dazu wurden je 7ml LB-Amp. mit Chitinase/pTECH bzw. pTECH angeimpft und Ü/N bei 37°C und 150rpm inkubiert. Am nächsten Tag wurde von der Ü/N-Kultur eine 1:100 Verdünnung hergestellt und weiter inkubiert. Jede Stunde wurde die OD650 gemessen, Verdünnungen hergestellt (10-5-10-8) und 50µl davon auf LB-Amp.-Platten ausgestrichen. Die über Nacht gewachsenen Kolonien wurden ausgezählt und die CFU wie folgt berechnet: Anzahl der Kolonien x Verdünnung x Aliquot = CFU/Volumen

2.1.9. Nachweis von Salmonellen in Kot- und Organproben

Für den Nachweis der Salmonellen wurde der Kot der immunisierten Mäusen fünf Tage lang nach der ersten Immunisierung gesammelt. 0,5g Kot je Käfig wurden mit einem Mörser zerrieben und in 5ml autoklaviertem 1% gepufferten Peptonwasser aufgeschwemmt. Anschließend wurde Material aus jedem Ansatz direkt mit der Impföse auf je eine LB-Amp.-Platte, eine XLD-Platte und eine BPLA-Platte ausgestrichen. Der restliche Ansatz wurde Ü/N bei 37°C und 150rpm inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte ein Ausstrich direkt aus der Kultur und aus einer Verdünnung 10-3 auf die oben aufgeführten Platten.
Zudem erfolgte die Überimpfung von 50µl Kultur in 5ml Salmonellenanreicherungsmedium nach Rappaport und eine weitere Inkubation bei 42°C, 150rpm für 20-24h. Anschließend erfolgte ein Ausstrich direkt aus der Kultur und aus einer Verdünnung 10-3 auf die oben aufgeführten Platten. Für den Nachweis von Salmonellen aus den Organen wurden Milz und Leber 2 Tage nach der letzten Immunisierung steril entnommen und gewogen. Anschließend erfolgte die Homogenisation der Gewebe mittels Passagierung durch ein engmaschiges Sieb. Ein Teil des Homogenates wurde mit neun Teilen 1% gepufferten Peptonwasser versetzt, aufgeschwemmt und abzentrifugiert (1200g, 10min, 4°C). Der Überstand wurde verworfen und das Pellet erneut in 9 Teilen Peptonwasser resuspendiert. Hieraus erfolgte ein direkter Ausstrich auf LB-Amp.-Platten, XLD-Platten und auf BPLA-Platten. Der restliche Ansatz wurde für 20-24h bei 37°C und 150rpm inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte erneut ein


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Ausstrich direkt aus der Kultur und aus einer Verdünnung 10-3 auf die oben aufgeführten Platten.
Zudem wurden 100µl der Ü/N-Kultur in 10ml Anreicherungsmedium nach Rappaport überführt und für 20-24h bei 42°C und 150rpm inkubiert. Nach der Inkubation erfolgte der direkte Ausstrich auf LB-Amp.-Platten, XLD-Platten und auf BPLA-Platten. Ausgewertet wurde der Habitus und die Stoffwechselleistungen der Kolonien, die durch eine Verfärbung des Agars sichtbar wurden.

2.1.10. Herstellung eines O. volvulus-Gesamtextraktes (OvAg)

Für die Beschichtung der Mikrotiterplatten, die zur Bestimmung der O. volvulus-spezifischen Antikörper eingesetzt wurden, sowie für die spezifische Antigenstimulierung von isolierten PBMC wurde ein O. volvulus-Gesamtextrakt benötigt. Als Ausgangsmaterial dienten hierfür 20 adulte O. volvulus-Würmer, die von Patienten aus Kamerun stammten. Diesen Patienten wurden unter lokaler Betäubung die Onchozerkoseknoten operativ entfernt. Die Würmer wurden anschließend nach der Methode von Schulz-Key et al. (1977) aus den Knoten isoliert. Dazu wurden die Knoten 1-3 Tage in Zellkulturmedium (RPMI 1640), das mit 5mg/ml Kollagenase, 100U/ml Penicillin, 100µg/ml Streptomycin versetzt war, inkubiert. Anschließend wurden die noch lebenden Würmer mit PBS pH 7,4 gewaschen, um das anhaftende Wirtsgewebe und die Kollagenase zu entfernen. Für den Transport wurden die Würmer bis zu ihrer weiteren Verwendung bei -70°C aufbewahrt.
Zur Präparation des O. volvulus-Gesamtextraktes wurden die Würmer aufgetaut, vom Restmedium befreit und 3x in 1x PBS pH 7,4 gewaschen, in einen Gewebehomogenisator überführt und nach Zugabe von ca. 5ml PBS auf Eis mechanisch homogenisiert. Anschließend wurde das Homogenisat in ein Röhrchen überführt und der Gewebehomogenisator mit PBS gespült, um anhaftendes Material nicht zu verlieren. Das Homogenisat wurde zweimal 10sec., mit einer 30sec. Pause, mit 30% Leistung (60W) auf Eis ultrabeschallt (Branson Sonifier 250, Heinemann, Schwäbisch-Gmünd). Das Rohantigen wurde zuerst 5min bei 4000g und 4°C zentrifugiert und nach Abnahme des Überstandes wurde dieser erneut 25min 16000g und bei 4°C zentrifugiert. Der so gewonnene Überstand wurde aliquotiert und bis zu seiner weiteren Verwendung bei -70°C aufbewahrt. Dieser Überstand wird im folgenden als O. volvulus-Gesamtextrakt (OvAg) bezeichnet.


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2.1.11. Bestimmung des Proteingehalts von Lösungen

Rekombinante Proteine in Lösung wurden mit der BCA-Methode (Pierce, Rockford, USA) quantifiziert. Als erstes wurde ein Proteinstandard (RSA, Rinderserumalbumin mit 2000µg/ml) geometrisch verdünnt. Auf einer Mikrotiterplatte (Greiner, Solingen, Deutschland) wurden die Standardverdünnungen und die Verdünnungen der Proben mit je 25µl aufgetragen. Dann wurden 200µl einer Arbeitsverdünnung (50 Teile Reagenz A, 1 Teil Reagenz B) zugegeben, die Platte geschüttelt und 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die optische Dichte (OD) bei 570nm im Spektralphotometer (Dynatech, Denkendorf, Deutschland) bestimmt. Die Konzentration der Proteine wurde durch Extrapolation aus einer Regressionsgraden des Proteinstandards ermittelt.

2.1.12. Auftrennung von Proteinen in der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page)

Proteine wurden nach ihrem Molekulargewicht in der SDS-PAGE aufgetrennt. Vor dem Auftragen wurden die Proben mit zweifach konzentrierten SDS-Probenpuffer versetzt und 3min bei 95°C gekocht. Das Gel bestand aus einem 4% Sammelgel und einem 14% Trenngel. Für die Auftrennung wurde eine Spannung von 140V angelegt. Als Molekulargewichtsmarker wurde ein Proteinstandard (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) aufgetragen. Direkt nach der Elektrophorese erfolgte die Färbung des Gels in Coomassie-Färbelösung. Nachfolgend wurde mit Entfärbelösung (10% Eisessig, 20% Ethanol) schwächer gebundenes Coomassie wieder herausgelöst.

2.1.13. Herstellung transformationskompetenter E. coli

Die Herstellung kompetenter E. coli erfolgte nach dem Protokoll von Inoue et al. (1990). Mit einer Einzelkolonie des gewünschten Bakterienstammes wurden 250ml SOB-Medium angeimpft und bei 18°C über Nacht bis zur OD600 = 0,6 auf dem Rotationsschüttler inkubiert. Die Kultur wurde 10min auf Eis gekühlt, abzentrifugiert (10min, 4°C, 2500g) und in 16ml eiskaltem TB resuspendiert. Es folgte eine zehnminütige Inkubation auf Eis und eine erneute Zentrifugation. Die Bakterien wurden dann in 4ml kaltem TB aufgenommen. Unter leichtem Schütteln wurde Dimethylsulfoxid (DMSO) bis zu einer Endkonzentration von 7% dazugegeben. Nach weiteren 10min Inkubation auf Eis wurden die Bakterien in 1ml Fraktionen aliquotiert und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Anschließend wurden die Bakterien bei -80°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.


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2.1.14. Lagerung und Kultivierung von Bakterien

Langzeitlagerung (Stocks): 0,5ml einer 5ml Ü/N-Kultur eines gewünschten Bakterienstammes wurde mit 0,5ml Glyzerin versetzt und gründlich gemischt. Anschließend wurden die Bakterien bei -80°C gelagert.
Lagerung bei Raumtemperatur (Stabs): zur Anfertigung von Stab-Kulturen wurde 500µl Agar in ein Glasschraubdeckelgefäß gefüllt und autoklaviert. Nach Erkalten des Agars wurden die Röhrchen mit einer sterilen Platinöse mit dem gewünschten Bakterienstamm beimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Stab-Kulturen bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbewahrt und waren für 6-12 Monate lebensfähig.

2.1.15. Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen

Für Klonierungsschritte oder zur Überprüfung eines eingebauten Inserts war es notwendig, DNA mit bestimmten Restriktionsenzymen zu spalten. Dafür wurde die vom Hersteller (AGS, Heidelberg, Deutschland) angegebenen Einheiten des benötigten Enzyms zu der entsprechenden Menge an DNA gegeben und die DNA für ein bis zwei Stunden bei optimaler Temperatur und optimalem Puffer inkubiert.

2.1.16. Dephosphorylierung von Vektor-DNA

Um eine Religation des linearisierten Vektors zu verhindern wurden die terminalen Phophatgruppen durch SAP abgespalten. Dazu wurde eine Einheit SAP mit 1-5µg DNA in dem entsprechenden Puffer in einem Reaktionsvolumen von 10µl für 30min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Enzym bei 70°C innerhalb von 15min inaktiviert.

2.1.17. Agarose-Gelelektrophorese

Die Agarose-Gelelektrophorese ermöglichte es, DNA auf Grund ihrer unterschiedlichen Länge und dadurch bedingt ihrer Wanderungsgeschwindigkeit aufzutrennen.
Die als Anionen vorliegenden DNA-Moleküle wandern im elektrischen Feld von der Kathode zur Anode. Durch den fluoreszierenden Farbstoff Ethidiumbromid, der sich zwischen die Basen der DNA einlagert, können die aufgetrennten DNA-Moleküle sichtbar gemacht werden. Die Anregung erfolgt


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mit UV-Licht von 500-590nm Wellenlänge. Dazu wurde die DNA im Verhältnis 1:6 mit Proben-Puffer vermischt und auf ein 0,8-1,0%iges Agarosegel aufgetragen, das Ethidiumbromid (0,5µg/ml) enthielt. Der Elektrophoresepuffer, in dem auch der Agar gelöst wurde, bestand aus 0,5x TAE-Puffer. Anschließend wurde eine Spannung von 60-100V angelegt. Neben den Proben wurden DNA-Längenstandard (Biosizer I+IV, AGS) aufgetragen, so daß eine Größenbestimmung der Produkte erfolgen konnte.

2.1.18. DNA-Elution aus Agarosegelen

DNA wurde aus Agarosegelen mit Hilfe des Kit-Systems Qiaex (Qiagen) herauseluiert. Dazu wurde die entsprechende Bande aus dem Gel mit einem Skalpell herausgeschnitten. Es folgte die Auflösung der Agarose durch Temperaturerhöhung (10min bei 50°C) und in Gegenwart von Natriumjodid. Die freie DNA konnte dann an eine Glasmilchsuspension binden, die in dem Reaktionsansatz zugegeben wurde. Nach 30sec. Zentrifugation mit der Tischzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) erfolgte einmaliges Waschen mit dem Natriumjodid Puffer, an das sich wieder eine Zentrifugation anschloß. Nach zweimaligem Waschen mit einem Ethanol-haltigen Puffer konnte die DNA mittels H2O oder TE-Puffer von der Matrix heruntereluiert werden.

2.1.19. Photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA und RNA

Die Konzentration und die Reinheit der isolierten mRNA und DNA wurde im Photometer (Hitachi, Japan) bestimmt. Dazu wurde die Probe 1:50 ddH20 verdünnt und die optische Dichte (OD) gegen ddH20 bei einer Wellenlänge von 260nm und 280nm gemessen. Einem OD-Wert von eins bei 260nm entsprechen etwa 40µg/ml RNA oder 50µg/ml DNA. Für die Reinheitsbestimmung wurde der Quotient von OD260/OD280 gebildet. Reine mRNA/DNA ergibt einen Quotienten von 2,0. Durch Proteinverunreinigungen verringert sich dieser Quotient.


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2.1.20. Ligation von DNA

Die Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen benachbarten 5‘-Phosphatgruppen und gegenüberliegenden 3‘-Hydroxylgruppen wird durch das Enzym Ligase katalysiert. Dies macht man sich bei der Klonierung von Fremd-DNA in einen Vektor zu Nutze. Dazu wurden 50ng Vektor-DNA mit verschieden Konzentrationen des Insert (molares Verhältnis von 1:1, 1:3, 3:1) in Gegenwart von 100mM ATP, 10x Ligase-Puffer und der T4-Ligase (3Einheiten/µl) in einem Reaktionsvolumen von 10µl bei 4°C Ü/N inkubiert. Eine Negativkontrolle, die anstatt von Insert-DNA Wasser enthielt, und eine Positivkontrolle, die linearisierte, phosphorylierte Plasmid-DNA beinhaltete, wurden bei jedem Ansatz mitgeführt.

2.1.21. Transformation von Plasmid-DNA in kompetente E. coli

Kompetente E. coli wurden bei RT aufgetaut und je 100µl pro Reaktionsansatz in 1,5ml Eppendorfgefäße überführt. 1-5µl des Ligationsansatzes wurden zu den Bakterien gegeben, der Ansatz wurde vorsichtig gemischt und für 30min auf Eis inkubiert. Es schloß sich ein Hitzeschock für 30-45sec. bei 42°C an, um die Bakterienwände durchlässig für die Plasmid-DNA zu machen. Nach dem Hitzeschock wurden die Zellen für weitere 2min auf Eis gehalten, bevor 900µl SOC-Medium zu dem Reaktionsansatz gegeben wurde. Es schloß sich eine Inkubation von 60-90min bei 37°C an. Je 100µl eines Ansatzes wurden auf Agarplatten ausgestrichen, die das benötigte Antibiotikum enthielten. Diese Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und die gebildeten Kolonien am nächsten Tag auf Einbau des Inserts hin untersucht.

2.1.22. Plasmidpräparation aus E. coli-Kulturen

Alle Plasmid-Isolationen wurden mit Kit-Systemen der Firma Qiagen durchgeführt. Dabei wurde gemäß den Protokollen der Hersteller vorgegangen. Dieses Verfahren beruht auf den unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften von Plasmid- und Bakterien-DNA. Es gibt einen kleinen pH-Bereich, bei dem nicht-überspiralisierte DNA denaturiert wird. Das Bakterienpellet wird in einem Natriumhydroxid-Puffer aufgenommen, so daß sich ein pH-Wert von 12-12,5 einstellt. Dadurch wird die Doppelhelix der Bakterien-DNA entwunden und die DNA-Stränge trennen sich. Nach Zugabe von stark saurem Puffer lagern sich die denaturierten Stränge zu einem Aggregat zusammen, das unlöslich ist. Es erfolgt die Neutralisation mit einem Natriumacetat-haltigen Puffer. Eine anschließende


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Zentrifugation ermöglicht es, die Plasmid-DNA von der Bakterien-DNA zu trennen. Der Plasmid-haltige Überstand wird auf eine Säule gegeben, wo die DNA an eine Matrix gebunden wird. Es erfolgt zweimaliges Waschen mit einem Waschpuffer. Der letzte Waschschritt wird mit Ethanol-haltigem Puffer durchgeführt, bevor die DNA durch H2O oder TE-Puffer von der Matrix eluiert wird. Bei Plasmidpräparationen aus großen Kulturvolumina wird das Eluat durch eine Ethanol-Fällung konzentriert.

2.2. Parasitologische Arbeitsmethoden

2.2.1. Versuchstiere

Für die Immunisierungsversuche wurden BALB/c-Mäuse verwendet, die in der Regel acht Wochen alt waren. Diese Mäuse wurden von Charles River (Sulzfeld, Deutschland) erworben. Für die Infektionsversuche wurden im Institut gezüchtete Wüstenrennmäuse der Art Meriones unguiculatus des Inzucht-Stammes Tumblebrook verwendet. Für den Versuch wurden ausschließlich Männchen eingesetzt, die nicht älter als 6 Monate waren.

2.2.2. Experimenteller Lebenszyklus der Nagetierfilarie Acanthocheilonema viteae

Das Nymphenstadien IV der Lederzecke Ornithodoros moubata wurde durch Saugen von Hammelblut mit definiertem Mikrofilariengehalt (6000 Mikrofilarien/ml) durch Membranfütterung (Lucius & Textor, 1995) ernährt und infiziert. Es erfolgt die Entwicklung zur infektiösen Drittlarven (L3). Nach zwei Monaten wurden die L3 aus den Zecken isoliert. 70 oder 75 L3 wurden unter die Nackenhaut von männlichen Meriones unguiculatus injiziert.

2.2.3. Immunisierungsversuche mit O. volvulus-L3-Chitinase und O. volvulus-L3-Chitin-Binde-Domäne in Meriones unguiculatus

Die O. volvulus-L3-Chitinase und die Chitin-Binde-Domäne (CBD) wurden in Immunisierungsstudien eingesetzt. Sechs bis Acht Wochen alte männliche Meriones wurden durch Inhalation von Narkosemittel Methophane® (Janssen GmbH, Neuss, Deutschland) betäubt und mit einer Dosis von 25µg Antigen subkutan an vier verschiedenen Stellen immunisiert.
Zuvor wurde die Chitinase 1:1 mit dem Adjuvans STP gemischt. Die Chitin-Binde-Domäne wurde mit dem Adjuvans Alum verabreicht. Für die Applikation des Antigens mit Alum war es notwendig, eine 1:20 Verdünnung herzustellen, die für 30min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. So wurde eine


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Bindung des Antigens an Alum ermöglicht. Die zweite Immunisierung mit identischem Ansatz erfolgte zwei Wochen später. Nach weiteren zwei Wochen wurde eine Belastungsinfektion mit 75 L3 (bzw. mit 70 L3 bei dem Versuch der OvL3-CBD mit Alum) gesetzt. Zudem erfolgte eine Blutabnahme und die Bestimmung der Mf-Dichte an verschiedenen Zeitpunkten. Elf Wochen nach der Belastungsinfektion wurden die Tiere getötet und auf Adultwürmer hin untersucht.

2.2.4. Gewinnung der L3 aus Ornithodoros moubata und Infektion der Meriones unguiculatus

L3 wurden aus Zecken gewonnen, die zwei Monate zuvor mit Mikrofilarien infiziert worden waren. Die Zecken wurden sagittal im RPMI-Medium aufgeschnitten, grob von Darminhalt und Resten der Blutmahlzeit gereinigt. Die ausgewanderten L3 wurden unter einem Binokular einzeln mit einer Pasteurpipette aufgesaugt. Nach zweimaligem Zählen wurden die L3 (75/Tier bzw. 70/Tier) in eine 1ml Spritze überführt und sofort unter die Nackenhaut von betäubten M. unguiculatus injiziert. Anschließend wurde mit 0,2ml RPMI nachgespült.

2.2.5. Blutentnahmen

Um den Verlauf der Immunisierung und der Infektion charakterisieren zu können, wurden in regelmäßigen Abständen Blutentnahmen durchgeführt. Die erste Blutentnahme erfolgte vor der ersten Immunisierung, die zweite am Infektionstag. Die Tiere wurden jeweils vier, acht und elf Wochen (Sektion) nach der Infektion geblutet, um die Mikrofilariendichte festzustellen und um Serum zu gewinnen. Die Wüstenrennmäuse wurden zuerst durch Inhalation von Narkosemittel Methophan® (Janssen GmbH) betäubt. Die Blutentnahme wurde durch Punktion des retroorbitalen Venenplexus mit einer Mikro-Hämatokritkapillare durchgeführt. Entnommen wurden ca. 500µl Blut, das zur Koagulation eine Stunde bei 4°C aufbewahrt und anschließend zentrifugiert (10600g, 10min, 4°C) wurde. Das so gewonnen Serum (ap 200µl) wurde abgenommen, in Eppendorfgefäße überführt und bei -20°C gelagert.


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2.2.6. Bestimmung der Mikrofilariendichte im Blut A. viteae-infizierter Meriones unguiculatus

Die Blutabnahme wurde mit Hilfe einer heparinisierten Einmal-Mikropipette durchgeführt, die in den retroorbitalen Venenplexus eingeführt wurde. 44,7µl des Blutes wurde mit 100µl 10% Teepol 610 (Serva, Heidelberg, Deutschland) gründlich gemischt und in einer Fuchs-Rosenthal Zählkammer gezählt. Die Mikrofilarienzahl wurde acht Wochen und elf Wochen nach der Infektion bei der Sektion bestimmt.

2.2.7. Sektion und Isolation von Adultwürmern

Elf Wochen nach der Belastungsinfektion wurden die infizierten M. unguiculatus durch Inhalation von Narkosemittel Methophan® (Janssen GmbH) betäubt und zur Serumgewinnung über den retroorbitalen Plexus ausgeblutet. Anschließend wurden sie durch Chloroform-Inhalation getötet und seziert. In der Muskulatur, den Geweben und zwischen den Organen wurden nach Adultwürmern von A. viteae gesucht. Das Geschlecht und die Länge der Würmer wurde protokolliert. Männchen und Weibchen wurden getrennt in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C aufbewahrt. Nach der Sektion wurden die Körper und die Häute der Wüstenrennmäuse in mit 0,9% NaCl gefüllte Bechergläser über Nacht eingelegt. Am Morgen danach wurden die aus den Körpern ausgewanderten Adulten ausgezählt und deren Geschlecht bestimmt. Die Länge der ausgewanderten Filarien wurde nicht ausgewertet, da die Würmer sich in NaCl strecken.

2.3. Immunologische Methoden

2.3.1. Immunisierungsstudien mit verschiedenen Adjuvantien im Mausmodell

Um den Einfluß von verschiedenen Adjuvantien zu testen, wurden Immunisierungsstudien in der Maus durchgeführt. Dazu wurden je 25µg Chitinase ohne Adjuvans, mit STP und mit Alum dreimal 6 Tieren pro Gruppe verabreicht (siehe unten). Die Kontrollgruppen erhielten nur STP, Alum oder PBS/1M Harnstoff. Der Abstand zwischen den Immunisierungen betrug zehn Tage. Den Tieren wurde vor jeder Immunisierung Blut über den retroorbitalen Plexus abgenommen, um anschließend die Antikörperantwort charakterisieren zu können. Zehn Tage nach der letzten Immunisierung wurden zwei Tiere ausgeblutet. Die Milzzellen der verbleibenden Tiere wurden in T-Zell Proliferationstests und


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Zytokintests eingesetzt. Dazu wurden die Milzen von zwei Tieren aus jeder Gruppe entnommen und die Milzzellen gemäß dem Standardprotokoll (Bradley et al. 1980) isoliert. 4x 105 Zellen/Vertiefung wurden für T-Zell-Proliferationstests eingesetzt. Die Milzzellen wurden mit rekombinanter O. volvulus-L3-Chitinase oder ohne Antigen inkubiert. Nach vier Tagen erfolgte die Zugabe von 3H-Thymidin für weitere 18 Stunden. Anhand von eingebautem Thymidin konnte die Proliferationsrate ermittelt werden. Dabei wurde die spontane Proliferation aus dem Ansatz ohne Antigen von den Werten der Ansätze mit Antigen abgezogen, so daß in den Graphiken Netto-Werte dargestellt sind.

Antigene, die jeweils 6 Mäusen pro Gruppe verabreicht wurden:
Gruppe 1. 25µg Chitinase in 1M Harnstoff
Gruppe 2: PBS/1M Harnstoff
Gruppe 3: 25µg Chitinase/STP
Gruppe 4 STP
Gruppe 5. 25µg Chitinase/Alum
Gruppe 6: Alum

Für die Bestimmung des Zytokinmusters mittels RT-PCR wurden die Zellen auf eine Zellzahl von 2x 10 6 Zellen/Vertiefung in 48-Vertiefung-Zellkulturplatten (Corning Costar, Bodenheim, Deutschland) eingesät. Es erfolgte eine Inkubation in Gegenwart von 20µg/Vertiefung, Chitinase oder ohne Antigen für maximal drei Tage. Nach 8h, 24h, 48h und 72h wurde der Überstand abgenommen und die Zellen in RNA-Isolierungsreagenz (Tristar®, AGS) aufgenommen und bei -70°C bis zur Weiterverwendung eingefroren.

2.3.2. Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit Salmonellen

Es erfolgte die Immunisierung von je 6 BALB/c-Mäusen mit Salmonellen, die Chitinase exprimierten, und mit Salmonellen, die nur den Vektor pTECH enthielten. Den Tiere wurden zweimal oral die unten aufgeführten Mengen an Salmonellen verabreicht. Der Abstand zwischen den Immunisierungen betrug 10 Tage. Nach 2 Tagen wurde jeweils ein Tier aus jeder Gruppe getötet und es erfolgte der Nachweis von Salmonellen in Leber und Milz (Kapt.2.1.9). 10 Tage nach der letzten Immunisierung wurden jeweils 2 Tieren aus jeder Gruppe die Milzen entnommen und die Milzzellen isoliert, so daß sie in Proliferationsstudien und in Zytokinuntersuchungen eingesetzt werden konnten.


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Gruppe 7: Chitinase/pTECH (5-8 x 107 CFU bei der 1. Immunisierung; 2-5 x 108 CFU bei der 2. Immunisierung
Gruppe 8: pTECH (5-20 x 109 CFU bei der 1. Immunisierung; 1,5 x 109 CFU bei der 2. Immunisierung)

2.3.3. Isolierung von Maus-Milzzellen

Für die Gewinnung der Milzzellen von immunisierten und naiven Mäusen wurden die Tiere mittels CO2-Inhalation getötet. Anschließend wurden ihnen unter sterilen Bedingungen die Milz entnommen. Alle Schritte wurden zügig und auf Eis durchgeführt, um die einsetzende Apoptose zu verzögern. Das Organ wurde mit Hilfe eines Stempels durch ein engmaschiges Netz passiert, um so Einzelzellen zu gewinnen. Durch Auf- und Abpipettieren wurden die Zellen aus ihren Zellverbänden gelöst und anschließend in ein 50ml Falcon-Röhrchen überführt. Zu den Zellen wurde 30ml kaltes RPMI gegeben und die Suspension wurde für 5min auf Eis inkubiert. Zur Abtrennung der groben Bestandteile wurde der Überstand mit den Zellen in ein neues Röhrchen überführt und bei 1200rpm für 10min bei 8°C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgegossen und das Zellsediment aufgemischt. Es erfolgte die Zugabe von 11ml Erythrozyten-Lyse-Puffer und eine Inkubation für 7min auf Eis. Nach der folgenden Zentrifugation (1200rpm, 10min bei 8°C) wurden die Zellen zweimal mit kaltem RPMI gewaschen. Die Zellen wurden dann in 3-5ml RPMI aufgenommen und die Lebendzellzahl bestimmt. Dafür wurde eine 1:20 Verdünnung mit Trypanblau hergestellt und die lebenden Zellen, die keinen Farbstoff aufgenommen hatten, in einem Großquadrat in der Neubauerkammer bestimmt. Die Zellzahl wurde auf eine Konzentration von 4x 106/ml eingestellt. Je 100µl dieser Suspension wurde in jede Vertiefung der 96-Vertiefung-Mikrotiterplatte gegeben. Nach Zugabe der Antigene bzw. der Mitogene wurde mit RPMI auf ein Gesamtvolumen von 200µl aufgefüllt.

2.3.4. Immunblot

Der Nachweis von Proteinen erfolgte nach Auftrennung in der SDS-Gelelektrophorese mit Hilfe spezifischer Antikörper. Dazu wurden die Proteine nach der Auftrennung auf eine Nitrozellulose-Membran (Porengröße 0,45µm, Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) über Nacht bei 70mA oder bei 400mA in 4h transferiert. Es schloß sich eine Inkubation von 30min bei RT oder bei 4°C über Nacht in 5% Milchpulver in TBS-Lösung an, um freie Proteinbindungskapazitäten zu blockieren. Anschließend erfolgte dreimaliges Waschen für 10min mit TBS-Lösung. Die Inkubation mit


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monospezifischen Mausserum gegen OvL3-Chitinase (Verdünnung 1:100 in 3%RSA/TBS) erfolgte für 2h bei RT unter ständiger Bewegung. Das nachfolgende Waschen mit TBS-Lösung diente zum Entfernen ungebundener primärer Antikörper. Der sekundäre mit Peroxidase konjugierte Antikörper (AP-Ziege-anti-Maus-IgG; Dianova, Hamburg, Deutschland; Verdünnung 1:1000 in 3%RSA/TBS) wurde für eine Stunde mit der NC-Folie inkubiert. Nach erneuten dreimaligen Waschen mit TBS-Lösung erfolgte die Zugabe der Substratlösung. Als Substratlösung wurde das Chromogen 4-Chloro-1-Naphtol (Lösung von 50ml TBS, 400µl 0,4% Chlornaphtol und 40µl H2O2) verwendet. Die Reaktion wurde mit fließendem H2O abgestoppt, die NC-Folie wurde getrocknet und vor Licht geschützt aufbewahrt. Je nach Verwendung anderer Antikörper wurden andere Verdünnungen eingesetzt.

2.3.5. Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA) zur Bestimmung der O. volvulus-spezifischen IgG bei der Maus

Polysorb Mikrotiterplatten (Nunc, Roskilde, Dänemark) wurden mit 1µg/ml O. volvulus-Chitinase in Beschichtungspuffer über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach wurden die Platten zweimal mit PBS/0,025% Tween-20 gewaschen und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C zwischengelagert.
Für den ELISA wurden die Platten zweimal mit PBS/0,025% Tween-20 gewaschen. Anschließend wurde mit je 100µl 1x PBS/3% RSA die unspezifischen Bindungsstellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur abgesättigt. Nach Waschen mit PBS/0,025% Tween-20 wurden 50µl der zu testenden Seren in einer 1:100 Verdünnung (in PBS/3% RSA) aufgetragen und bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Es folgte 3maliges Waschen mit PBS/0,025% Tween-20 bevor 50µl der subklassenspezifischen Alkalische Phosphatase gekoppelten Kaninchen anti-Maus Antikörper (Rockland, Gilbertsville, USA) auf die Platten gegeben wurden. Dabei wurden die verschiedenen Antikörper in den folgenden Verdünnungen eingesetzt (alle in 3% RSA/TBS verdünnt):

IgG 1:3000
IgG1 1:2000
IgG2a 1:200
IgG2b 1:100
IgG3 1:100

Die Platten wurden bei 37°C 1h inkubiert. Danach wurde mit PBS/Tween-20 gewaschen. Es wurde 50µl der Substratlösung (1 Tablette p-Nitrophenyl-phosphat (Sigma) in 10ml Carbonatpuffer und 1mM MgCl2 gelöst) zugegeben und 30min bei 37°C inkubiert. Mit 25µl einer 100mM EDTA-Lösung wurde die Reaktion abgestoppt. Die optische Dichte wurde bei 405nm im ELISA-Reader (Dynatech) gemessen.

2.3.6. Nachweis spezifischer mRNA mittels reverser Transkription (RT)

Zum Nachweis und zur Quantifizierung von spezifischer mRNA wurde die RT-PCR eingesetzt. Bei dieser Methode werden vier Abschnitte unterschieden:
Isolierung von RNA, reverse Transkription, Polymerase-Kettenreaktion, Agarose-Gelelektrophorese. Durchgeführt


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wurde die RT-PCR gemäß den Anweisungen von Sambrook et al. (1989).

2.3.7. Isolierung von mRNA für RT-PCR

2x 106 Milzzellen /Vertiefung wurde nach Inkubation mit Chitinase oder ohne Antigen in 400µl des RNA-Isolierungsreagenz Tristar® aufgenommen und bis zur Weiterverwendung bei -70 °C gelagert. Nachdem die Proben aufgetaut waren, schloß sich eine Inkubation von 5min bei Raumtemperatur an. Ein Fünftel Volumen Chloroform wurde zu jedem Ansatz gegeben und für 15sec. stark geschüttelt. Anschließend wurde der Reaktionsansatz nochmals für 3-10min bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zentrifugation (12000g, 5min, 4°C) erfolgte die Abtrennung der RNA und DNA von den Proteinen. Die obere, wäßrige Phase wurde vorsichtig in ein neues 2ml-Reaktionsgefäß (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) überführt und mit einem halben Volumen Isopropanol versetzt. Es schloß sich eine Inkubation für 5-15min bei Raumtemperatur an, bevor erneut für 10min bei 12000g und 4°C zentrifugiert wurde. Das Isopropanol wurde vorsichtig abpipettiert und das Pellet zweimal mit einem Volumen 75% Ethanol (in DMDC-H2O) gewaschen. Das Pellet wurde an der Luft getrocknet und anschließend in 20-40µl DMDC-H2O aufgenommen. Es erfolgte die Konzentrationsbestimmung der RNA bei OD260/280 im Photometer.

2.3.8. Umschreibung von mRNA in cDNA

Ein bis fünf µg der isolierten RNA wurden mit 1µl oligo-DT (0,5µg/ml) in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit ddH2O auf ein Volumen von 12µl aufgefüllt. Es erfolgte eine 10minütige Inkubation bei 70°C, die durch schnelles Überführen auf Eis abgestoppt wurde. Zu jedem Ansatz wurden 4µl 5xFirst Strang Buffer (Gibco, Karlsruhe, Deutschland), 2µl 0,1 M DTT und 1µl 10 mM dNTP (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) gegeben und 2min bei 42°C inkubiert. Anschließend wurde 1µl


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(200 Einheiten) Reverse Transkriptase (SuperScript® Gibco) zugegeben und für weitere 50min bei 42°C inkubiert. Das Enzym wurde für 15min bei 70°C inaktiviert. Um RNase vollständig zu entfernen, wurde 1µl (4 Einheiten) RNase Inhibitor (Gibco) für 20min bei 37°C zugeführt. Die so gewonnene cDNA konnte in die PCR Reaktion eingesetzt werden.

2.3.9. Amplifikation von Maus-Zytokinen

Die erhaltene cDNA konnte nun in einer Polymerase-Kettenreaktion auf die Transkripte der Zytokine IL-4, IL-10, INF-gamma und TNF-alpha untersucht werden.
Als Positivkontrolle und zur Qualitätskontrolle der cDNA wurde ß2-Mikroglobulin amplifiziert, das in allen Eukaryotenzellen in hohem Maße exprimiert wird. Um eine semiquantitative Aussage über die Stärke der Zytokinexpression zu erhalten, schloß sich nach der ersten Amplifikation von ß2-Mikroglobulin eine Titration an, bei der alle eingesetzten Proben auf die gleiche Menge des Amplifikates eingestellt wurden.
Die Auswertung der Bandenstärke erfolgte mit Hilfe eines Videodokumentationsgerätes (Herolab, Wiesloch, Deutschland) und dem Auswertungsprogramm E.A.S.Y. Die Menge an DNA, die für eine gleich starke Bande von ß2-Mikroglobulin in allen Proben benötigt wurde, wurden für die Amplifikation der anderen Zytokine eingesetzt. So konnten Aussagen über die mRNA-Menge der Zytokine erfolgen.

Die Proben wurden in den folgenden Reaktionsansatz eingesetzt:
DNA: 1-5 µl
5‘-Primer: 1µl (10pmol)
3‘-Primer: 1µl (10pmol)
MgCl2: 2µl (50mM)
10x PCR Puffer: 5µl
Taq: 0,2µl (5U/µl)
ddH2O: ad 50µl

Zur Amplifikation der Zytokine wurde der folgende Zyklus verwendet:

Die Proben wurden zunächst 10min bei 94°C denaturiert und die DNA in 40-50 Zyklen amplifiziert. Jeder Zyklus bestand aus einer 1minütigen Denaturierungsphase bei 94°C, gefolgt von einer 1minütigen Annealingphase bei 55°C und einer 1minütigen Extensionsphase bei 72°C. Im Anschluß


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an den 40. oder 50. Zyklus wurde die PCR bei 72°C für 5min beendet, gefolgt von einer Kühlphase bei 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
Für die Amplifikation der cDNA der Zytokine wurden 2,5 Einheiten Gold-Taq® (PE Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die Proben wurden 10 min bei 94°C erhitzt, bevor die Taq zugegeben wurde und der oben beschriebene Zyklus gestartet wurde.

Zytokin

Länge des cDNA Amplifikates (bp)

Primersequenzen

ß2-Mikroglobulin

222

sense : 5‘-TGACCGGCTTGTATGCTATC-3‘

antisense:5‘-cagtgtgagccaggatatag-3‘

IL-4

216

sense: 5‘-tcggcattttgaacgaggtc-3‘

antisense: 5‘-gaaaagcccgaaagagtctc-3‘

IL-10

254

sense: 5‘-ATGCAGgactttaagggttacttg-3‘

antisense:5‘-tagacaccttggtcttggagctta-3‘

TNF-alpha

212

sense: 5‘-tctcatcagttctatggccc-3‘

antisense:5‘-gggagtagacaaggtacaac-3‘

INF-gamma

227

sense:5‘- gctctgagacaatgaacgct-3‘

antisense: 5‘-aaagagataatctggctctgc-3‘

2.4. Charakterisierung von T-Zell-Epitopen innerhalb der O. volvulus-L3-Chitinase

Um die immunologischen Eigenschaften der Chitinase näher zu charakterisieren, wurde mit Hilfe von drei verschiedenen Algorithmen T-Zell-Epitope innerhalb des Proteins identifiziert. Dabei kamen die folgenden Algorithmen zur Anwendung:
der Algorithmus von Rothbard und Taylor (1988)
die MHC-II-Bindungs-Motive nach Rammensee (Rammensee et al. 1995)
der Algorithmus nach Humphreys (Modifikation des Stille-Algorithmus, 1987)


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2.4.1. Algorithmus von Rothbard und Taylor

Der Algorithmus von Rothbard und Taylor (1988) findet seine Anwendung innerhalb der linearen Sequenz eines Proteins. Diese Epitop-Vorhersage identifiziert Bereiche mit fünf Aminosäuren, an deren ersten Stelle eine geladene Aminosäure oder Glycin steht, gefolgt von zwei hydrophoben Aminosäuren. Die dritte Stelle erfordert ein Prolin oder eine hydrophobe Aminosäure, während an der letzten Position eine polare Aminosäure oder Glycin steht. Diese Abfolge von Aminosäuren ist jedoch nicht ausreichend für die Stimulierung von T-Zellen. Erst Peptide mit einer Länge von 8-12 Aminosäuren können mit MHC-Molekülen interagieren, so daß synthetische Peptide mit einer Länge von 15 Aminosäuren hergestellt und eingesetzt wurden. Dieser Algorithmus wurde mit Hilfe des Computerprogrammes HUSAR (DKFZ, Heidelberg, Deutschland) auf die OvL3-Chitinase angewendet.

2.4.2. MHC-II-Bindungs-Motive nach der Vorhersage von Rammensee

Die Vorhersage von Rammensee (Rammensee et al. 1995) über die MHC-Bindungs-Motive von Peptiden wurde durch Sequenzierung von natürlichen Liganden ermittelt. Dabei wurden gebundene Peptide von MHC-II-Molekülen eluiert, über HPLC getrennt und anschließend sequenziert. Die so erhaltenen Daten zeigten, daß besonders die Positionen P1, P4, P6 und P9 entscheidend für die Bindung der Peptide an die Bindungsgruben von MHC-Molekülen sind.
Dabei kommt es jedoch zwischen den einzelnen MHC-II-Allelen zu einem unterschiedlichen Bindungsverhalten der einzelnen Positionen. So ist für die Position P1 bei dem murinen H2-Ek eine aliphatische Aminosäure gefordert, während das homologe H2-Ed an dieser Stelle eine aromatische Aminosäure verlangt (Schild et al. 1995). Deshalb ist es notwendig, für jedes MHC-II-Allel eine gesonderte Vorhersage über das Bindungsverhalten und somit über die AS-Abfolge zu treffen. Uns wurde die Vorhersage von MHC-Bindung-Motiven innerhalb der OvL3-Chitinase für BALB/c-Mäuse mit dem genetischen Hintergrund H2-Ed von der Arbeitsgruppe Rammensee zur Verfügung gestellt.

2.4.3. Algorithmus nach Humphreys

Der Algorithmus nach Humphreys basiert auf der Arbeit von Stille et al. (1988), dessen Grundlage die Untersuchungen von DeLisi und Berzofsky (1985) ist. Hier werden amphipathische Strukturen und die damit verbundene mögliche T-Zell-Antigenität innerhalb eines Proteins erkannt. Das von Humphreys


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entwickelte Programm identifiziert die mittlere Hydrophobizität einer Aminosäuregruppe auf einem axialen Abschnitt einer Helix mit 3-6 Windungen. Dabei sollen sich die Aminosäuren in Position n, n + 4, n+7, n+11, n+14 oder n+18 befinden.
Mit Hilfe dieses Programmes werden Abschnitte mit 12-19 Aminosäuren innerhalb 4-6 Windungen auf einer alpha-Helix bestimmt. Diese Abschnitte weisen durch ihre Seitenketten hohe Hydrophobizität auf, wobei Prolin nicht berücksichtigt wird. Angrenzend befindet sich ein mäßig hydrophiler Bereich. Die so charakterisierten Bereiche stellen potentielle T-Zell-Epitope dar, die in Verbindung mit MHC-Klasse-II-Molekülen T-Zellen präsentiert werden.Dieser Algorithmus wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Humphreys auf die OvL3-Chitinase angewendet.

2.4.4. Beurteilung der Sensitivität und Spezifität der Algorithmen

Um Aussagen über die Genauigkeit und die Zuverlässigkeit der Algorithmen machen zu können, wurden die Begriffe Sensitivität und Spezifität verwendet (Deavin et al. 1996). Dabei wurde die Sensitivität wie folgt definiert:
Sensitivität = Anzahl der AS der korrekt vorhergesagten Epitope/
Gesamtanzahl der AS aller bekannten Epitope
Spezifität = Anzahl der AS der korrekt vorhergesagten Epitope
Gesamtanzahl der AS der vorhergesagten Epitope

2.4.5. Herstellung der vorhergesagten T-Zell-Epitope als synthetische Peptide

Die vorhergesagten T-Zell-Epitope wurden von der Arbeitsgruppe Schneider-Mergener (Institut für Immunologie, Charitè, Berlin) als synthetische Peptide nach dem Standard Spot-Synthese-Protokoll (Frank 1992) mit einer automatischen Syntheseapparatur (Abimed GmbH, Langenfeld, Deutschland) hergestellt (Kramer et al. 1994, Kramer und Schneider-Mergener 1998). Nach der Synthese und Abspaltung der Schutzgruppen wurden die Peptide von der Zellulose durch Ammoniak-Dampf abgelöst. Die noch an der Membran heftenden Peptide wurden ausgestanzt und in 96-Vertiefung-Mikrotiterplatten überführt. Jeder Spot enthielt ca. 50nmol Peptid. Jedes 20ste Peptid wurde als Duplikat hergestellt und im HPLC (Hewlett Packard, Waldborn, Deutschland) auf seine Reinheit (>70%) überprüft.


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2.5. Aktivitätstest der O. volvulus-L3-Chitinase

Zur Überprüfung der enzymatischen Aktivität des Proteins wurde ein Aktivitätstest durchgeführt. Dabei wurde das Substrat N-Acetyl-Glucosamin verwendet, das mit dem Fluoreszenzfarbstoff Methylumbellyferyl (4-methylumbelliferyl-N,N,N,-triacetylchito-triose; Sigma) gekoppelt war. Die Endkonzentration des Substrates betrug 5µM in 2ml 50mM NaPO4. Der Start erfolgte durch die Zugabe der Probe (Endkonzentration zwischen 0,2-5µg) und anschließender Inkubation bei 37°C. Die Zunahme der Fluoreszenz wurde in einem Zeitraum von 40min alle 5min im Fluoreszenzphotometer (Contron, Neufahn, Deutschland) gemessen. Als Positivkontrolle


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diente eine käufliche Chitinase des Bakteriums Serratia marcescens, die in Konzentrationen zwischen 0,2µg/ml und 10µg/ml eingesetzt wurde. Zudem wurde neben PBS als Negativkontrolle ein rekombinantes Filarienprotein (das Cystatin der Filarie A. viteae; Hartmann et al. 1997) mitgeführt, um unspezifische Reaktionen auszuschließen.

2.6. Charakterisierung der T-Zell-Reaktivität von rekombinanten Proteinen und Peptiden in Feldstudien in Kamerun

2.6.1. Lage des Projektgebietes

Alle Patienten dieser Studie stammten aus der Provinz Centré, einem Feuchtsavannengebiet mit meso- bis hyperendemischer Onchozerkose aus den Dörfern um Mbangassina (Distrikt Mbam, nahe dem Fluß Mbam) und aus der Hauptstadt Yaoundé.

2.6.2. Parasitologische Untersuchungen des Patientenkollektives

Alle Patienten wurden mit Namen, Alter und Herkunft registriert. Die Hautveränderungen, die Anzahl und die Lokalisation von Knoten, in denen sich Würmer befinden (Onchozerkome), wurde protokolliert. Zudem wurde die Häufigkeit der vorangegangenen Einnahme von Ivermectin® (Merk, Sharp und Dohme, USA) vermerkt. Den Patienten wurden je nach Diagnose Medikamente gegen Durchfall, Malaria und Vitaminmangel verabreicht. In Mitarbeit mit dem örtlichen Basisgesundheitsdienst wurden 73 Patienten die Onchozerkome operativ entfernt. Von den 350 behandelten Patienten wurden 61 Personen ausgewählt, die in die Studie aufgenommen wurden.


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Diesen Patienten wurde zusätzlich Blut abgenommen, Stuhlproben gewonnen und zur Bestimmung der Hautmikrofilariendichte von O. volvulus mit Hilfe eines Skalpells an beiden Schulterblättern eine Hautbiopsie entnommen (“Skin Snip“). Die Hautbiopsien wurden auf einer Torsionswaage (Bereich 0,1 bis 10mg/) gewogen (nachträglich in Berlin), in 1x PBS inkubiert und am folgenden Tag wurde die Anzahl der ausgewanderten Mikrofilarien bestimmt. Die Mikrofilariendichte eines Patienten wurde als arithmetisches Mittel der Mikrofilarienzahl pro mg Haut beider Hautbiopsien berechnet. Aus den Blutproben wurden Blutausstriche angefertigt und ein Differentialblutbild erstellt. Zudem erfolgte die Isolierung von PBMC, die in Proliferationstests eingesetzt wurden. Die Stuhlprobe wurden mit Lugol-Lösung (eine 1% Lösung, die aus der Stammlösung: 1g Jod und 2g Jodkalium auf 100ml dd H2O hergestellt wurde) vermischt und mikroskopisch auf Wurmeier, und -larven, sowie auf Amöben- und Lamblienzysten untersucht.

2.6.3. Isolierung mononukleärer Blutzellen (PBMC) von Onchozerkose-Patienten

Humane mononukleäre Blutzellen (T-und B-Lymphozyten, Monozyten) wurden über die Ficoll-Paque-Dichtegradientenzentrifugation isoliert (Boyum 1968). Als Ausgangsmaterial für die Isolierung diente venöses Blut, das in heparinisierte Röhrchen abgenommen wurde.
Das Blut wurde zunächst 1:2 mit Zellkulturmedium (RPMI 1640) verdünnt, anschließend auf Ficoll-Paque überschichtet und 35min bei 140g zentrifugiert. Dies diente dazu, das Blut in seine zellulären Bestandteile zu trennen. Die obere Phase enthielt das Plasma, die Interphase bestand aus mononukleären Blutzellen, die sich durch ihre geringere Dichte auf der mittleren Ficoll-Paque-Phase auflagerten, während die Granulozyten und die Erythrozyten im Sediment zu finden waren.
Nach der Zentrifugation wurden die PBMC mit Hilfe einer Transferpipette vorsichtig entnommen und in ein neues 50ml Plastikröhrchen (Greiner) überführt und anschließend dreimal mit RPMI 1640 gewaschen (1100rpm, 10min, 15°C). Der Anteil der lebenden Zellen wurde mit Hilfe der Trypanblau-Färbung in der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die PBMC wurden auf eine Zellzahl von 1x 107Zellen/ml eingestellt und je 100µl je Vertiefung in Zellkulturplatten eingesät.

2.6.4. Zellkultur und Stimulierung von mononukleären Blutzellen

Die Teilungsrate der PBMC wurde durch den Einbau von 3H-Thymidin in die zelluläre DNA gemessen. Die Höhe der Radioaktivität in der Gesamt-DNA einer Zellkultur erlaubte Rückschlüsse auf die Proliferationsrate.


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Die PBMC wurden mit Zellkulturmedium, das mit 25mM Hepes, 100U/ml Penicillin, 10mg/ml Streptomycin und 10% hitzeinaktiviertem foetalem Kälberserum (FCS) versetzt war, auf eine Zelldichte von 1x107 Zellen/ml eingestellt.
In 96-Vertiefung-Rundboden-Zellkulturplatten (Corning Costar, Bodenheim, Deutschland) wurden 100µl dieser Suspension in jede Vertiefung pipettiert und verschiedene Antigene oder Mitogene in die Ansätze gegeben. Dabei wurde jeweils eine Doppelbestimmung durchgeführt. Als Mitogene wurden Concanavalin A (ConA 2µg/Vertiefung) und Phytohämagglutinin (PHA 1:100/Vertiefung) verwendet. Für die Antigenstimulation wurden 18 verschiedene rekombinante A. viteae- und O. volvulus-Antigene (Endkonzentration 1-10µg/Vertiefung) eingesetzt. Zudem wurden auf jeder Platte eine Negativkontrolle, die nur Zellen in RPMI enthielt, und zwei Positivkontrollen mitgeführt. Zu einem wurde eine Stimulation mit dem ubiquitären Antigen Streptolysin-O von Streptococcus pyrogenes (unverdünnt), zum anderen eine spezifische Stimulation mit O. volvulus-Gesamtextrakt-Antigen (20µg/Vertiefung) vorgenommen. Die Zellkulturen wurden bei 37°C, 5% CO2 und gesättigter Luftfeuchtigkeit inkubiert. Den mit Mitogen stimulierten Zellansätzen wurde nach zwei Tagen, den mit Antigen stimulierten Zellen nach vier Tagen 0,5µC 3H-Thymidin pro Vertiefung zugegeben und die Ansätze für weitere 18 h inkubiert. Danach wurden die Zellen mit einem automatischen Zellerntegerät (Wallac, Turku, Finnland) auf Filtermatten übertragen und das in die DNA eingebaute 3H-Thymidin über Szintillations-Spektroskopie (Trilux 1450, Wallac) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Stimulationsindices angegeben. Dazu wurden die Impulse pro Minute (cpm) der Ansätze mit Antigenstimulation durch die Impulse pro Minute der Ansätze ohne Antigenstimulation geteilt.

2.6.5. Zytokinproduktion von PBMC nach in vitro-Stimulation

Die Zytokinproduktion der isolierten PBMC wurde untersucht. Dafür wurden die isolierten PBMC (3x 106 Zellen/Vertiefung) mit 2% FCS in 48-Vertiefung-Zellkulturplatten (Corning Costar) bei 37°C, 5% CO2 und 90% Luftfeuchtigkeit kultiviert. Zur Stimulation wurden die OvL3-Chitinase bzw. OvL3-CBD (beide mit je 10µg/Vertiefung) verwendet. Dabei wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beginn der Stimulation (14h, 24h und 48h) die Zellen abzentrifugiert (400g, 2min, 4°C), die Zellkulturüberstände in sterile Kryoröhrchen überführt und bei -70°C bis zum Zytokinnachweis eingefroren.
Das Zellsediment wurde für die RNA-Isolierung in 100-150µl 4M Guanidin-Thiocyanat, 25mM Natriumcitrat, 0,5% Sarcosyl, 0,1M 2-Mercaptoethanol (Solution D) gelöst und bis zur Aufarbeitung bei -70°C gelagert.


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2.6.6. Zytokinnachweis aus Kulturüberständen mononukleärer Blutzellen

Die Konzentrationen der in die Zellkulturüberstände abgegebenen Zytokine (IL-4, IL-5, IL-10 und INF-gamma) wurden mit Hilfe eines “sandwich“-ELISA (Genzyme, Rüsselsheim, Deutschland) bestimmt. Hierbei wird ein monoklonaler zytokinspezifischer Antikörper an die feste Phase von Mikrotiterplatten bei 4°C über Nacht adsorbiert. Die unspezifischen Bindungen werden durch PBS mit 4% Rinderserumalbumin (Sigma,) bei 37°C für zwei Stunden blockiert. Anschließend werden die Zellkulturüberstände in die Vertiefungen gegeben und 1h oder 2h (je nach Zytokinbestimmung) bei 37°C inkubiert. Nach dem Auswaschen der nicht gebundenen Zytokine wird mit einem biotinylierten Antikörper für 30-60min (je nach Zytokinbestimmung) bei 37°C inkubiert. Anschließend wird enzymgekoppeltes (Merrettichperoxidase) Streptavidin zugegeben. Durch Zugabe der Substratlösung Teramethylbenzidine (TMB) und H2O2 kommt es zu einer blauen Farbreaktion, deren Intensität proportional zu der Konzentration der zu messenden Zytokine ist. Gestoppt wird die Reaktion mit 2N H2SO4, die einen Farbumschlag nach Gelb bewirkt, so daß die Farbintensität im Photometer bei OD405nm gemessen werden kann. Mit Hilfe einer Standardkurve kann anschließend die Zytokinkonzentration ermittelt werden.
Zur Konzentrationsbestimmung von IL-4 wurden pro Vertiefung 50µl maus-anti-human IL-4 mAk (Konzentration: 2,5µg/ml) bzw. anti human INF-gamma mAk, maus-anti human IL-5 mAk, anti human IL-10 mAk über Nacht bei 4°C an Flachbodenplatten (Corning Costar) gebunden. Nach zweimaligem Waschen mit 1x PBS/0,05% Tween 20 wurden die Mikrotiterplatten bis zu ihrer Weiterverwendung bei -20°C gelagert. Nach dem Auftauen wurden die freien Bindungsstellen mit je 100µl 1x PBS/3% RSA bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurde zweimal mit je 75µl 1x PBS/0,05% Tween 20 gewaschen und 50µl Zellkulturüberstand bzw. der zugehörige Zytokinstandard (Konzentrationsbereich 16-2000pg/ml) in die Vertiefungen gegeben. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 4°C. Nach weiteren vier Waschschritten erfolgte 45min lang die Inkubation mit je 50µl des biotinylierten zweiten Antikörpers (Konzentration 1,25µg/ml) bei Raumtemperatur. Danach wurde zwölfmal gewaschen und anschließend wurde 50µl Substratlösung zugegeben. Die Messung der optischen Dichte erfolgte bei 405nm alle 3 min im ELISA-Reader (Dynatech).

2.6.7. ELISA zur Bestimmung der O. volvulus-spezifischen IgG beim Menschen

Mit Hilfe des ELISA wurden Antikörper der Onchozerkose-Patienten gegen O. volvulus, Chitinase und die CBD bestimmt. Polysorb Mikrotiterplatten (Nunc, Roskilde, Dänemark) wurden mit 2,5µg/ml OvAg oder 2 µg/ml O. volvulus-L3-Chitinase bzw. OvL3-CBD in Beschichtungspuffer über Nacht bei 4°C inkubiert.


41

Danach wurden die Platten zweimal mit 1x PBS/0,025% Tween-20 gewaschen und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C zwischengelagert. Die Platten wurden zweimal mit PBS/Tween-20 gewaschen, und die unspezifischen Bindungsstellen mit PBS/3% RSA zwei Stunden lang bei Raumtemperatur abgesättigt. Nach Waschen mit PBS/Tween-20 wurden die zu testenden Seren in einer 1:100 Verdünnung (in PBS/3% RSA) aufgetragen und bei 4°C über Nacht inkubiert. Es folgte Waschen mit PBS/Tween-20, bevor 50µl der subklassenspezifischen biotinylierten Maus-anti-human Antikörper auf die Platten gegeben wurden. Dabei wurden die Antikörper in folgenden Verdünnungen verwendet (alle in PBS/3% RSA verdünnt):

IgG 1:2000
IgG1 1:3000
IgG3 1:3000
IgG4 1:1000

Diese wurden bei 37°C 3h inkubiert. Danach wurde mit PBS/Tween-20 gewaschen. Es erfolgte die Inkubation mit 50µl Alkalischer-Phosphatase-konjugiertem Ziege-anti-Maus IgG+IgM Antikörper (1:3000 in PBS/3% RSA verdünnt) eine Stunde lang bei 37°C. Nach Waschen mit PBS/Tween-20 wurden 50µl der Substratlösung (1 Tablette p-Nitrophenyl-phosphat (Sigma) in 20ml Substratpuffer und 1mM MgCl2 gelöst) zugegeben und die optische Dichte bei 405nm im ELISA-Reader (Dynatech) gemessen.

2.7. Datenverarbeitung

Die Auswertung der Versuche erfolgte mit Hilfe des SPSS-Programms. Die statistische Auswertung erfolgte mit den Student-t-Test für unabhängige Stichproben. Unterschiede zwischen den Gruppen, die p<0,05 waren, wurden als signifikante Unterschiede bewertet. Die Berechnung der Korrelationskoeffizienten erfolgte mit Hilfe des Tabellenkalkulationsprogramms EXCEL.


[]


42

2.8. Material

2.8.1. Verwendete Tiere für parasitologische Arbeiten

Tiere

BALB/c-Mäuse

Charles River, Sulzfeld, Deutschland

Meriones unguiculatus

eigene Nachzucht des Inzuchtstammes von Tumblebrook Farms,

West Brookfield, MA (USA)

Lederzecke Ornithodoros moubata

Eigene Zucht

Filarien Acanthocheilonema viteae

aus eigener Haltung

Onchocerca volvulus

Kamerun, Westafrika

2.8.2. Material für immunologische Arbeiten

ELISA


43

Beschichtungspuffer (pH 9,6)

0,14g NaCO3

 

0,3g NaHCO3

 

 

10x PBS (pH 7,4)

80g NaCl

 

2g KCl

 

11,5g Na2HPO4

 

2g KH2PO4

 

 

PBS/RSA

3% Rinderserumalbumin in 1x PBS

 

 

Waschlösung

1x PBS

 

0,025% Tween 20

 

 

Substratlösung

1 Substrat-Tablette (Sigma, Deisenhofen, Deutschland)

 

10ml Carbonatpuffer

 

1mM MgCl2

 

 

Stopplösung

100mM EDTA

 

 

TCA-LPS aus S. typhimurium

(Sigma, München, Deutschland)

 

 

RSA (Rinderserumalbumin)

(AppliChem, Darmstadt, Deutschland)

Antikörper-Konjugate für ELISA

Ziege-anti Maus IgG (Fc Fragment, AP konjugiert)

(Dianova, Hamburg, Deutschland)

Kaninchen-anti Maus IgG1 (AP konjugiert)

(Biotrend, Köln, Deutschland)

Kaninchen-anti Maus IgG2a (AP konjugiert)

(Biotrend, Köln, Deutschland)

Kaninchen-anti Maus IgG2b (AP konjugiert)

(Biotrend, Köln, Deutschland)

Kaninchen-anti Maus IgG3 (AP konjugiert)

(Biotrend, Köln, Deutschland)

Immunblot

Transferpuffer

25mM

Tris

 

192mM

Glycin

 

10%

Methanol

 

 

 

10x TBS

1M

NaCl

 

50mM

Tris pH 7,4

 

 

 

Substratlösung

50ml

TBS

 

400µl 0,4%

Chlornaphtol

 

40µl

H2O2

Antikörper-Konjugate für Immunblo

Monospezifisches anti OvL3-Chitinase-Serum (Maus)

Anti-6His-Antikörper: (Maus-IgG1 Isotyp) (Qiagen, Hilden, Deutschland)

Kaninchen-Anti-TetC: Dr. A. Khan, Division of Microbiology and Parasitology, Department of Pathology, University of Cambridge


44

Isolierung von Milzzellen

Medium:

RPMI 1641 (Gibco, Deutschland) mit Hepes,

 

10 U Penicillin (Gibco,Karlsruhe, Deutschland )

 

10mg/ml Streptomycin (Gibco, Deutschland)

 

10% foetales Kälberserum (Gibco, Deutschland)

 

200mM L-Glutamin (Gibco, Deutschland)

 

 

Erytrozytenlyselösung

90ml 160mm NH4Cl

 

10ml 170 mM Tris, pH 7,6

Trypanblau

(Gibco, Deutschland)

 

 

Mitogen

Concanavalin A (Pharmacia, Freiburg, Deutschland)

 

 

Radioaktivität

3H-Thymidin (NCI, Eschwege, Deutschland)

 

 

Zellerntesystem

Filtermatten (Wallac, Turku, Finnland)

 

Meltilex-Filter (Wallac, Turku, Finnland)

zusätzlich wurde die Isolierung der PBMC benötigt:

Ficoll-Paque

(Pharmacia, Freiburg, Deutschland)

PHA

Phytohämagglutinin (Pharmacia, Freiburg, Deutschland)

SL-O

Streptolysin-O (Fisher Scientific, USA)

2.8.3. Material für molekularbiologische Arbeiten

SDS-PAGE

5x SDS-Laufpuffer

12,4mM

Tris gepuffert

 

325mM

Glycin

 

0,10%

SDS

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2x Probenpuffer

2,5mM

6 Tris-HCl (pH 6,8)

 

8%

ß-Mercaptoethanol

 

3%

SDS

 

20%

Glyzerin

 

0,02%

Bromphenolblau

 

 

 

Ammoniumpersulfat (APS)

10%

in H2O

 

 

 

Coomassie-Färbelösung

10%

Essigsäure

 

20%

Ethanol

 

0,10%

Coomassie R250

 

 

 

Coomassie-Entfärbelösung

10%

Essigsäure

 

20%

Ethanol

Trenngel (12,5%)

Acrylamid

16,7ml (30%)

H2O

12,7ml

Tris-HCl pH 8,8

10ml

TEMED

20µl

SDS 10%

400µl

APS

200µl

Sammelgel (4%)

Acrylamid

2,7ml (30%)

H2O

12ml

Tris-HCl pH 6,8

5ml

TEMED

20µl

SDS 10%

200µl

APS 10%

200µl


46

Proteinmarker:

Prestained

(Sigma, München, Deutschland)

Mit den folgenden Komponenten:

alpha-Makroglobulin

205 000 Da

 

ß-Galaktosidase

112 000 Da

 

Fruktose-6-Phosphat Kinase

87 000 Da

 

Pyruvat Kinase

69 000 Da

 

Fumarase

56 000 Da

 

Laktat Dehydrogenase

38 500 Da

 

Triosephosphat Isomerase

33 500 Da

Agarose-Gelelektrophorese

10x TAE

48,4g

Tris

 

20ml

EDTA pH 8,0

 

11,42ml

Essigsäure

 

ad 1l

H2O

 

 

 

 

 

 

DNA-Ladepuffer (6x)

0,25%

Bromphenolblau

 

40%

Sucrose in H2O

 

 

 

Ethidiumbromid-Stammlösung

10mg/ml

in H2O

 

 

 

Farbmarker für DNA-Proben:

Bio-Sizer II+V (AGS, Heidelberg, Deutschland)

Bakterien:

E.coli-Stämme:

XL1-Blue

Qiagen, Hilden, Deutschland

JM 109

Qiagen, Hilden, Deutschland

Salmonella typhimurium-Stämme

SL3261: Die Salmonellen wurden uns von Dr. A. Khan, Division of Microbiology and Parasitology, Department of Pathology, University of Cambridge, freundlicherweise zur Verfügung gestellt


47

Plasmid-Vektoren:

pGEM-T

T-overhang Vektor der Firma Promega, Mannheim, Deutschland

pQE-30

Expressionsvektor mit einer Kassette, die für 6-Histidine codiert und sich am N-Terminus der Multi Cloning Site (MCS) befindet. Qiagen, Hilden, Deutschland

pTECH

Vektor für Salmonellen, bei dem das Fremdprotein als Fusionsprotein mit dem TetC exprimiert wird.
Das Plasmid wurde uns von Dr. A. Khan, Division of Microbiology and Parasitology, Department of Pathology, University of Cambridge, freundlicherweise zur Verfügung gestellt.

Aufreinigung rekombinanter Proteine aus E.coli-Lysat

IPTG Stammlösung: 1M in H2O, (BIOMOL, Hamburg, Deutschland)

native Aufreinigung

Bindungspuffer

5mM

Imidazol

 

500mM

NaCl

 

20mM

Tris HCl, pH 7,9

 

 

 

Waschpuffer

60mM

Imidazol

 

500mM

NaCl

 

20mM

Tris HCl, pH 7,9

 

 

 

Elutionspuffer

1M

Imidazol

 

500mM

NaCl

 

20mM

Tris HCl, pH 7,9

Beladungspuffer

400mM

NiSO4

 

 

 

Denaturiende Aufreinigung

 

 

 

 

 

Puffer B-E:

8M Harnstoff

 

 

0,1 M NaH2PO4

 

 

0,01 M Tris

 

 

Puffer B: pH 8,0

 

 

Puffer C: pH 6,3

 

 

Puffer D. pH 5,9

 

 

Puffer E: pH 4,5

 

Kultivierung von Bakterien

 

 

 

 

 

LB-Medium

10g

NaCl

 

5g

Hefeextrakt (Difco, USA)

 

10g

Trypton (AppliChem, Darmstadt, Deutschland)

 

ad 1l H2O

 

 

 

 

LB-Platten

10g

NaCl

 

5g

Hefeextrakt (Difco, USA)

 

10g

Trypton (AppliChem, Darmstadt, Deutschland

 

15g

Bacto-Agar (AppliChem, Darmstadt, Deutschland

 

ad 1l H2O

 

 

 

 

 

 

 

Ampicillin Stammlösung

50mg/ml (Roth, Karlsruhe, Deutschland)

Gebrauchslösung

50µg/ml

 

 

 

 

Kanamycin Stammlösung

25mg/ml (Fluka, Neu-Ulm, Deutschland)

Gebrauchslösung

25µg/ml

 

 

 

 

Salmonellen-Anreicherungs-Medien:

 

 

BPLS-Agar

51g (Merk, Darmstadt, Deutschland)

 

ad 1l ddH2O

 

XLD-Agar

55g (Merk, Darmstadt, Deutschland)

 

ad 1l ddH2O

 

 

 

 

1% Peptonwasser, gepuffert

10g Pepton

 

 

5g NaCl

 

 

3,5g Na2HPO4

 

 

1,5 g K2HPO4

 

 

ad 1l ddH2O

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Transformation kompetenter Bakterien

 

 

 

 

SOB-Medium

2g

Trypton

 

0,5g

Hefeextrakt

 

0,05g

NaCl

 

250µ

KCl

 

20µl

NaOH

 

Ad 100ml H2O

 

 

autoklavieren 0,5ml MgCl2 (steril)

 

 

 

SOC-Medium

SOB-Medium

 

 

20mM Glucose

 

 

sterilfiltrieren (Filter mit 0,45µm Porengröße)

 

 

 

 

 

 

TB

10mM Pipes

 

 

55 mM MnCl2

 

 

15 mM CaCl2

 

 

250 mM KCl

 

alles ohne MnCl2 mit KOH auf pH 6,7 stellen, MnCl2 dazu, und sterilfiltrieren (Filter mit 0,45µm Porengröße)


50

Aktivitätstest

50 mM Phosphatpuffer, pH 6,4

4-Methylumbelliferyl-N-N-N-triacetylchitotriose: Sigma, München, Deutschland

Chitinase von Serratia marcescens: Sigma, München, Deutschland

Isolation von Plasmid-DNA

Minipräparation

QIAGEN-Säulen: Tip 20 der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland

Puffer P1

50mM Tris-HCl, pH 8,0

 

10mM EDTA

 

1µg/ml RNase A

Puffer P2

200mM NaOH

 

1% SDS

Puffer P3

3M K-Acetat, pH 4,8

 

 

TE-Puffer

10mM Tris HCl, pH 8,0

 

1mM EDTA

Maxipräparation

QIAGEN-Säulen: Tip 500 der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland


51

Isolation von DNA aus Agarosegelen

Es wurde das QIAEX II Kit-System der Firma Qiagen, Hilden, Deutschland gemäß der Herstellerangaben verwendet.

Puffer QBT

750mM

NaCl

 

50mM

MOPS, pH 7,0

 

15%

Isopropanol

 

0,15%

Triton X-100

Puffer QC

1.0M

NaCl

 

50mM

MOPS, pH 7,0

 

15%

Isopropanol

Puffer QF

1,25M

NaCl

 

50mM

Tris HCl, pH 8,5

 

15%

Isopropanol

Polymerase Kettenreaktion (PCR)

Taq-Polymerase (Gibco, Karlsruhe, Deutschland),

Gold®-Tag-Polymerase (PE Biosystems, Weiterstadt, Deutschland)

Deoxynukleotid-Triphosphate (Promega, Heidelberg, Deutschland)

mitgelieferter 10-fach PCR-Puffer und MgCl2 gemäß der Herstellerangaben

Synthetische Oligonukleotide

Alle verwendeten Oligonukleotide wurde bei der Firma Roth, Karlsruhe, Deutschland hergestellt.

2.8.4. Kits und Enzyme

Zytokin-ELISA (IL-4, IL-5, IL-10 und INF-gamma)

Genzyme, Rüsselsheim, Deutschland

QIAGEN Plasmid-Kit (Mini, Maxi)

QIAGEN, Hilden, Deutschland

QIAEX II-Kit

QIAGEN, Hilden, Deutschland

Chromatographie Ni-NTA-Matrix

QIAGEN, Hilden, Deutschland

BCA-Bestimmungskit

Pierce, Rockford, USA

Geltrockner-Kit

Promega, Heidelberg, Deutschland

Lysozym

Sigma, München, Deutschland

Restriktionsenzyme

AGS, Heidelberg, Deutschland

T4-DNA-Ligase

New England Biolabs, Niederlande

DNase

AGS, Heidelberg, Deutschland

SAP

Boehringer Mannheim, Deutschland

Alkalische Phosphatase-Tabletten

Sigma, München, Deutschland

2.8.5. Verbrauchsmaterial


52

0,2 ml Reaktionsgefäße

Biozym, Oldendorf, Deutschland

0,5 ml Reaktionsgefäße

Biozym, Oldendorf, Deutschland

1,5 ml Reaktionsgefäße

Greiner, Nürtingen, Deutschland

2,0 ml Reaktionsgefäße

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Polypropylenröhrchen 15,5,50 ml

Greiner, Nürtingen, Deutschland

Stülpdeckelröhrchen

Greiner, Nürtingen, Deutschland

Petrischalen

Greiner, Nürtingen, Deutschland

Pipettenspitzen 10,1000 µl

Greiner, Nürtingen, Deutschland

Pipettenspitzen 200 µl

Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Nitrozellulosemembran 0,45 µm

Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland

ELISA-Platten (Maxisorb)

Corning Costar, USA

Einwegkanülen, -spritzen

Braun, Melsungen, Deutschland

Mikro-Hämatokritkapillaren

Brand, Wertheim, Deutschland

Einmal-Sterilfilter 0,2µm

Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland

Einmal-Sterilfilter 0,45 µm

Corning Costar, USA

Falten-Filter

Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland

Dialysemembranen

Roth, Karlsruhe, Deutschland

Sterile Einwegpipetten 10, 25 ml

Costar, USA

Einwegküvetten

Brand, Wertheim, Deutschland

0,2 ml Reaktionsgefäße

Biozym, Oldendorf, Deutschland

Alle Chemikalien wurden, so weit nicht anders angegeben, von Sigma (München, Deutschland) bezogen

2.8.6. Laborgeräte

Analytische Waage

Sartorius, Göttingen, Deutschland

Elektrophoreseapparaturen

Pharmacia, Freiburg, Deutschland

ELISA Reader MR 5000

Dynatech, Denkendorf, Deutschland

ELISA-Waschgerät

Dynatech, Denkendorf, Deutschland

ELISA-Drucker

NEC, Ismaning, Japan

Feinwaage BP1105

Sartorius, Göttingen, Deutschland

Geltrockner

Biorad, München, Deutschland


53

Kühlzentrifuge 5417R

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Großraumkühlzentrifuge

Beckman. München, Deutschland

Minigelapparatur

Pharmacia, Freiburg, Deutschland

Multikanalpipette

Brandt, Wertheim, Deutschland

Netzgerät EPS 200

Pharmacia, Freiburg, Deutschland

pH-Meter

WTW, Weilheim, Deutschland

PCR-Thermocycler

Perkin Elmer, Konstanz, Deutschland

Tischzentrifuge 5415C

Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Proteinelutionsapparatur:

Biorad, München, Deutschland

(Pumpe, UV-Monitor, Fraktionssammler)

Videodokumentationsgerät

Herolab, Wiesloch, Deutschland

Spektralphotometer,

Hitachi, Japan

Ultraschall-Desintegrator “Sonifier W-250“

Heinemann, Schwäbisch-Gmünd, Deutschland

Zellerntegerät

Wallac, Turku, Finnland

Szintillations-Spektroskop Trilux 1450

Wallac, Turku, Finnland

Fluoreszenzphotometer

Contron, Neufahn, Deutschland


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