| Drabner, Birgit: Charakterisierung und Identifizierung von immundominanten Bereichen der L3-Chitinase von Onchocerca volvulus |
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Die cDNA der O. volvulus-L3-Chitinase wurde uns von Prof. A. E. Bianco (Glasgow, UK) in einem T-overhang Vektor (pCR II, Invitrogen, Niederlande) zur Verfügung gestellt. Da ein direktes Klonieren in einen Expressionsvektor nicht möglich war, wurde die cDNA mittels PCR und spezifischen Primern, in die eine BamHI (Forward-Primer) bzw. HindIII (Reverse-Primer)-Schnittstelle eingefügt wurde, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in einem 1%igem Agarosegel aufgetrennt (Abb. 2) und das Amplifikat von 1500bp aus dem Gel herausgeschnitten und eluiert. Die so gewonnene DNA wurde in eine Ligation mit dem T-overhang Vektor pGEM-T (Promega, Mannheim, Deutschland) eingesetzt. Nach erfolgreicher Transformation in den kompetenten E. coli Stamm JM 109 konnte eine Selektion von positiven Transformanten mittels blau-weiß Screening erfolgen. Anschließend wurde das Insert mit Hilfe der Restriktionsenzyme BamHI und HindIII aus dem T-overhang-Vektor herausverdaut. Die Trennung von Plasmid und Insert erfolgte durch die Auftrennung der Fragmente im Agarosegel und nachfolgender Gelelution. Dieser Schritt war notwendig, um ein Produkt zu erhalten, das tatsächlich eine BamHI bzw. HindIII-Schnittstelle am C- bzw. N-Terminus besitzt.
Abb. 2.Amplifikation der O. volvulus-L3-Chitinase und Chitin-Binde-Domäne (CBD) mittels PCR und spezifischen Primern. Spur 1: DNA-Größenstandard in bp; Spur 2-3: Amplifikation der cDNA der CBD mit 200bp, Spur 4-7: Amplifikation der cDNA der Chitinase mit 1500bp; Spur 8-9: Negativkontrolle, Spur 10: Positivkontrolle
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Dieses Produkt wurde nun in den vorbereiteten Expressionsvektor pQE-30 (Abb. 3) ligiert. Dazu wurde der Vektor mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII linearisiert und durch das Enzym SAP dephosphoryliert. Nach erfolgreicher Ligation schloß sich eine Transformation in den kompetenten E. coli Stamm XL-1 blue an. Auf Selektionsagar gewachsene Kolonien wurden mittels Restriktionsverdau auf den korrekten Einbau des Inserts hin untersucht. Anschließend wurden Expressionsversuche in kleinen Volumina durchgeführt und Klone, die eine gute Expression zeigten, ausgewählt.
Abb. 3:Klonierung der OvL3-Chitinase und der OvL3-CBD in den bakteriellen Expressionsvektor pQE 30
Für die Induktion und Expression der O. volvulus-L3-Chitinase wurde ein Liter LB-Amp. mit 10ml einer Ü/N-Kultur angeimpft und den transformierten Bakterien XL-1 blue ein Wachstum bis zu einer OD600 von 0,4 erlaubt. Die Expression des Proteins wurde mit 5mM IPTG induziert. Nach 3-4 Stunden Wachstumsphase wurden die Bakterien zentrifugiert (15 000g, 20 min, 4°C) und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C eingefroren. Zur Überprüfung der Proteinexpression wurde das Pellet von 1ml der Bakterienkultur im SDS-Gel aufgetrennt. Hier konnte eine Bande von 56kDa detektiert werden (Abb. 4), die nur von induzierten Bakterien gebildet wurde.
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Abb. 4.: SDS-Gel mit aufgereinigten Proteinfraktionen der OvL3-Chitinase. Spur 1: MG-Marker, Spur 2: ohne Induktion; Spur 3: nach Induktion mit 5mM IPTG, Spur 4-15: Aufreinigungsfraktionen
Die Aufreinigung erfolgte mittels Ni-Chelat-Affinitätschromatographie unter denaturierenden Bedingungen (8M Harnstoff). Es schloß sich eine Dialyse an, in der Harnstoff schrittweise herauseluiert wurde, bis das Protein in 1 M Harnstoff bzw. PBS/0,5M NaH2PO4/1M Tris/2% Glyzerin vorlag. Ein Immunblot mit einem monospezifischen Mausserum gegen die rekombinante O. volvulus-L3-Chitinase erkannte die aufgereinigte Bande bei 56kDa (Abb. 5)
Abb 5.:Immunblot: Aufgereinigte Fraktionen der OvL3-Chitinase konnten mit Hilfe eines Mausserum gegen OvL3-Chitinase (Verdünnung1:100 in 3%RSA/TBS) bei 56 kDa detektiert werden.
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Aus der cDNA der OvL3-Chitinase wurde mittels PCR und spezifischen Primern, in die eine BamHI (Forward-Primer) bzw. eine HindIII (Reverse-Primer) eingefügt wurde, die cDNA amplifiziert, die für die Chitin-Binde Domäne kodiert. Das PCR-Produkt wurde im Agarosegel aufgetrennt (Abb. 2) und das Amplifikat von 220bp aus dem Gel eluiert. Es schloß sich ein Restriktionsverdau mit den Enzymen BamHI und HindIII an. Das so vorbereitete Insert wurde in den Expressionsvektor pQE 30 ligiert, der zuvor mit BamHI und HindIII linearisiert und mit SAP dephosphoryliert worden war. Anschließend wurde das Plasmid in kompetente E. coli des Stammes XL-1 blue transformiert und auf Selektionsagar (LB-Amp.) ausgestrichen. Die gewachsenen Kolonien wurden durch Restriktionsverdau der DNA und durch Induktionstests auf den korrekten Einbau des Inserts hin untersucht.
Ein Klon, der das Insert korrekt eingebaut hatte, wurde ausgewählt und zur Expression eingesetzt. Eine Großkultur wurde mit einer Ü/N-Kultur von O. volvulus-L3-CBD angeimpft und bis zu einer Dichte OD600 von 0,4 kultiviert. Die Expression des Proteins wurde mit 1mM IPTG induziert und es schloß sich eine Wachstumsphase für 3-4 Stunden an. Die Aufreinigung erfolgte unter Verwendung von Imidazol durch Ni-Chelat-Affinitätschromatographie (Abb. 6). In hohen Konzentrationen verdrängt das Imidazol das gebundene Protein von der Nickelmatrix. Das aufgereinigte Protein wurde gegen PBS/0,05% Triton-X 100 dialysiert, um restliches Imidazol zu entfernen. So aufgereinigtes Protein mit einem Molekulargewicht von 20kDa konnte mit Hilfe eines Mausserum gegen OvL3-Chitinase nachgewiesen werden (Abb. 7).
Abb. 6: Aufreinigung der OvL3-CBD unter nativen Bedingungen. Spur 1: MG-Marker in bp, Spur 2: Low-Molekular-Weigt-Marker, Spur 3: ohne Induktion, Spur 4: nach Induktion mit 1mM IPTG, Spur 5-8: Aufreinigungsfraktionen
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Abb. 7: Nachweis von aufgereinigten Proteinfraktionen der OvL3-CBD durch Immunblot mit einem Mausserum gegen OvL3-Chitinase. Neben den aufgereinigten Fraktionen bei 14 kDa erkannte das Serum noch Multimere der OvL3-CBD bei 30 kDa und 56 kDa.
Zusätzlich wurde die cDNA der O. volvulus-L3-Chitinase in den Salmonellenvektor pTECH (Abb. 8) kloniert. Dazu wurde der Vektor pTECH mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII linearisiert und durch SAP dephosphoryliert. Anschließend wurde die cDNA der OvL3-Chitinase in den Vektor ligiert. Der Erfolg der Klonierung wurde mittels Restriktionsverdau und nachfolgender Auftrennung im Agarosegel überprüft. Es schloß sich eine Transformation in den Salmonellenstamm SL3261 an. Die auf Selektionsagar gewachsenen Kolonien wurde auf den korrekten Einbau des Insert durch Restriktionsverdau überprüft. Anschließend wurden positive Klone ausgewählt und Expressionversuche unter anaeroben Kulturbedingungen in kleinen Volumina durchgeführt. Da jedoch im SDS-Gel keine Expressionsbande sichtbar war, wurde ein Immunblot mit Kannichenserum gegen das TetC-Fragment durchgeführt. Mit Hilfe dieses Serum konnte das Fusionspotein von TetC und Chitinase bei 110kDa detektiert werden. Zusätzlich erkannte das Serum Abbauprodukte bei 56kDa und bei 38kDa (Abb. 9).
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Abb. 8. Klonierung der OvL3-Chitinase in den Salmonellen-Vektor pTECH.
Abb. 9.Nachweis der Expression der OvL3-Chitinase im Salmonellen-Vektor pTECH. Die OvL3-Chitinase konnten mit Hilfe eines Kanninchenserums gegen das TetC-Fragment detektiert werden. Es konnte sowohl das Fusionsprotein mit dem TetC-Fragment bei 96kDa, als auch Abbauprodukte der Chitinase mit dem Tet C-Anteil bei 56kDa und 38,5kDa nachgewiesen werden. Spur 1,2+4: Klon von SL3261 mit Chitinase/pTECH, Spur 3: Negativkontrolle: SL3261 ohne Insert
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Die O. volvulus-L3-Chitinase gehört in die Gruppe der Familie 18 Gykosyl Hydrolasen, die die Spaltung von ß-1-4-N-Acetyl-D-Glucosaminbausteinen katalysieren. Dabei entstehen 2-6 Chito-Oligomere, die wahrscheinlich von parasiteneigenen ß-N-Acetylglucosaminidasen weiter zu Monomeren degradiert werden. Die Enzyme der Gruppe 18 besitzen ein konserviertes aktives Zentrum bestehend aus folgendem Motiv: LIVMFY-DN-G-LIVMF-DN-LIVMF-DN-X-E (Watanabe et al. 1994, Henrissat 1990). Lokalisiert ist dieses aktive Zentrum im vorderen Bereich der katalytischen Domäne, die einer 17-22 Aminosäuren langen Signalsequenz folgt. An die katalytische Domäne schließt sich ein Serin/Threonin reicher Bereich an, der vermutlich Ort einer extensiven O-Glykosilierung ist (Kuranda und Robbins 1991). Zudem befinden sich in diesem Bereich eine große Anzahl an Prolinen, durch die sterisch eine flexible Verbindung zu dem C-terminalen Ende entsteht. Am C-terminalen Ende der Chitinase ist die Chitin-Bindung lokalisiert und sie ist gekennzeichnet durch das Vorhanden sein von 6 Cysteinen. Dieses Motiv läßt sich auch bei Insekten Chitinase wiederfinden, und ihnen wird eine mögliche Rolle bei der Zuführung des gebundenen Substrates zu dem aktiven Zentrum zugeschrieben (Tellam et al. 1996). Insgesamt sind die Chitinase der Filarien untereinander relativ homolog. Sequenzabgleiche der O. volvulus-L3 Chitinase mit der L3-Chitinase von A. viteae oder mit der Mf-Chitinase von B. malayi zeigten 75% Identität auf DNA-Ebene und 70-80% Identität auf Proteinebene. Es konnte jedoch nur 42% Identität auf DNA- und Proteinebene mit der Chitinase des freilebenden Nematoden Caenorhabditis elegans (Swiss Prot Q11174) gefunden werden.
Zur Überprüfung der enzymatischen Tätigkeit des Proteins wurde ein Aktivitätstest durchgeführt. Dabei wurde das Substrat N-Acetyl-Glukosamin verwendet, das mit dem Fluoreszenzfarbstoff Methylumbellyferyl gekoppelt war.
Die rekombinante O. volvulus-L3-Chitinase (eingesetzte Konzentration: 0,5-5µg) war in der Lage, das Substrat zu spalten. Dies konnte durch die Zunahme der Fluoreszenz im Fluoreszenzphotometer (Contron, Neufan, Deutschland) verfolgt werden. Als Positivkontrolle diente eine käufliche Chitinase von Serratia marcescens (eingesetzte Konzentration 0,2-2µg). Bei der Negativkontrolle (ein rekombinantes Cystatin der Nagetierfilarie Achanthoceilonema viteae mit 17kDa) konnte keine Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden (Abb. 10).
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Abb. 10: Enzymatische Aktivität der O. volvulus-L3-Chitinase. Dargestellt ist die Zunahme des Chromogens 4-Methylumbellyferyl, das durch die Chitinase (0,5µg) vom Substrat GlucNac3 abgespalten wurde. Positivkontrolle: Chitinase von Serratia marcescens (0,2µg), Negativkontrolle: Cystatin von A. viteae mit 17kDa und PBS.
Die OvL3-Chitinase und die OvL3-CBD wurden im Tierversuch mit der Nagetierfilarie A. viteae eingesetzt. Das Tiermodell mit der Filarie A. viteae und den Wüstenrennmäusen M. unguiculatus erlaubt es, das protektive Potential von Antigenen gegen eine Belastungsinfektion mit 75 bzw. 70 Infektionslarven (L3) zu ermitteln.
Die rekombinante OvL3-Chitinase wurde in Kombination mit dem Adjuvans STP verabreicht. In einem ersten Versuchsansatz konnte das rekombinante Protein eine Reduzierung der Adultwurmlast von 41,2% (n.s.) gegenüber der Kontrollgruppe STP erzielen (Abb. 11a). Dies zeigte sich auch in der Mikrofilarienlast nach 8 und nach 11 Wochen. Bei Chitinase immunisierten Tieren konnte eine mittlere Mf-Last/µl von 0,37 (8 Wochen) bzw. 4,1 Mf/µl (11 Wochen) gefunden werden. Die Kontrollgruppe, die nur das Adjuvans STP verabreicht bekam, enthielt durchschnittlich 1,19 Mf/µl nach 8 Wochen und 8,1 Mf/µl nach 11 Wochen. Die Länge der Würmer und die Verteilung der Geschlechter unterschieden sich nicht zwischen den Gruppen. Während die Weibchen bei der
immunisierten Gruppe eine Länge von 4,8 cm und die Männchen von 2,3 cm aufwiesen, betrug die Länge der Würmer aus der Kontrollgruppe bei Weibchen 4,4 cm und bei Männchen 2,1 cm.
Abb 11a und b:Mittlere Wurmlast+Standardabweichung von immunisierten Wüstenrennmäusen nach Belastungsinfektion mit 75 L3. In diesem Versuch wurden neben der Chitinase die rekombinanten Proteine A. viteae 17 (Av17) bzw. A. viteae Tropomyosin (AvTropo) gegen die Kontrollgruppe STP und PBS getestet.
Untersucht man die Antikörperantworten der einzelnen Wüstenrennmäuse in dem ersten Experiment, so konnte eine Erhöhung der Antikörper-Subklasse IgG3 beobachtet werden. Zum Zeitpunkt der Belastungsinfektion lag der OD Wert für die Subklasse IgG3 mit 0,62 deutlich über den Werten von IgG2a und IgG2b (OD 0,19; bzw. 0,16). Diese Unterschiede zwischen den Gruppen verringerten sich im Laufe der Infektion, doch auch zum Zeitpunkt der Sektion konnten die höchsten OD-Werte bei der Subklasse IgG3 gemessen werden (IgG3: 0,19; IgG2a: 0,14; IgG2b: 0,06).
Man konnte eine negative Korrelation zwischen der Wurmlast und dem IgG3-Gehalt im Serum dieser Tiere finden. Diese Korrelation wurde im Laufe der Infektion immer deutlicher. Zum Zeitpunkt der Belastungsinfektion lag der Korrelationskoeffizient bei r = -0,2. Nach 8 Wochen stieg die Korrelation auf einen Koeffizienten von r = -0,7 und zum Zeitpunkt der Sektion lag der Korrelationskoeffizient bei r = -0,8. Zum Zeitpunkt der Belastungsinfektion konnte bei allen anderen Antikörper-Subklassen ein Anstieg verzeichnet werden. Besonders deutlich war dies bei der Subklasse IgG1. Während die OD-Werte bei IgG2a bei 0,19 und bei IgG2b bei 0,16 lagen, konnten bei IgG1 ein OD-Wert von 0,43 gemessen werden. Danach verringerte sich der Gehalt von allen Antikörpern im Laufe der Infektion (2. und der 3. Blutabnahme) bis hin zur Sektion und die Werte von IgG2a, IgG2b und IgG1 glichen sich wieder an (Abb. 12a).
In einem weiteren Versuch führte die Immunisierung mit Chitinase nur zu einer Reduzierung der Wurmlast um 17,7% (n.s.) gegenüber der Kontrollgruppe (Abb.12b). Während sich die Wurmlänge
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der Weibchen und Männchen zwischen immunisierten Tieren und Kontrolltieren nicht unterschied, konnten bei der Mikrofilarienlast nach 8 Wochen deutliche Unterschiede gefunden werden. Tiere, die mit Chitinase immunisiert wurden, enthielten 2,7 Mf/µl, während die Kontrollgruppe eine durchschnittliche Mikrofilarienlast von 4,8 Mf/µl aufwies. Diese Werte glichen sich jedoch im Laufe der Infektion an. Nach 11 Wochen enthielt die Kontrollgruppe 24,7 Mf/µl und immunisierte Gruppe 22,9 Mf/µl.Abb. 12a und b: Antikörperantworten der mit OvL3-Chitinase immunisierten M. unguiculatus. Dargestellt sind die OD-Werte von IgG, den IgG-Subklassen und IgM (Versuch a) gegen Chitinase während des Infektionsverlaufes.
Untersucht man hier die Wurmbürde im Zusammenhang mit den IgG3-Antikörpern zu den verschiedenen Zeitpunkten, so können die Ergebnisse des ersten Versuches nicht bestätigt werden. Lag der Korrelationskoeffizient zum Zeitpunkt der Belastungsinfektion noch bei r = -0,62, so fiel dieser Wert im Laufe der Infektion immer weiter ab. Nach 8 Wochen lag dieser Wert bei r = -0,42 und nach 11 Wochen war keine Korrelation mehr zu finden (r = -0,07). Bei diesem Versuch zeigte die Antikörper-Subklasse IgG1 die höchsten OD-Werte. Zum Zeitpunkt der Belastungsinfektion konnten bei IgG1 ein OD-Wert von 0,52 gemessen werden. Die Subklasse IgG3 lag mit einer OD von 0,37 deutlich unter dem Wert von IgG1, jedoch über den Werten von IgG2a (0,17) und IgG2b (0,29). Im Laufe der Infektion senkte sich der Gehalt aller Antikörpern, dennoch blieb IgG1 die stärkste Subklasse mit 0,24 gegenüber IgG3 mit 0,17, IgG2a und IgG2b mit je 0, 1.
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In einem weiteren Versuch wurde die rekombinante O. volvulus-L3-CBD mit dem Adjuvans Alum verabreicht. Die Belastungsinfektion erfolgte bei diesem Versuch mit 70 L3. In diesem Versuch konnte kein Schutz gegen eine Belastungsinfektion erzielt werden. Die Rückfindungsrate der Würmer lag bei der Gruppe, die OvL3-CBD in Kombination mit Alum erhielten, bei 45. Bei Tieren, die nur Alum verabreicht bekamen, konnten durchschnittlich 42 Würmer wiedergefunden werden. Die Wurmlänge und Mikrofilarienlast zeigten vergleichbare Werte in den Gruppen. Während die Wurmlängen der Gruppen identisch war (Weibchen: 4,6 cm, Männchen 2,2 cm), wiesen die Tiere, die mit OvL3-CBD und Alum immunisiert wurden, eine leicht erhöhte Mikrofilarienlast auf. Nach 8 Wochen konnten bei den Kontrolltieren 4,7 Mf/µl und nach 11 Wochen 19,5 Mf/µl gefunden werden.
Abb. 13: IgG-Antikörperantwort der mit OvL3-CBD immunisierten M. unguiculatus. Dargestellt sind die OD Werte der IgG-Antikörper und die Standardabweichung während des Infektionsverlaufes.
Immunisierte Tiere hatten nach 8 Wochen durchschnittlich 5,34 Mf/µl und nach 11 Wochen 20,8 Mf/µl im Blut. Bei diesem Versuch wurde nur der Gehalt an IgG-Antikörpern und nicht der Subklassen bestimmt. Nach Belastungsinfektion konnte ein starker Anstieg von IgG-Antikörpern (OD405: 1,1) beobachtet werden, der sich im Laufe der Infektion (2. und 3. bleed) wieder absenkte. Zum Zeitpunkt der Sektion hingegen stieg der Gehalt an Antikörpern wieder an (3. bleed: 0,31; Sektion: 0,54) (Abb.13).
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Um die Immunantwort gegen die Chitinase näher zu untersuchen, wurden Immunisierungsstudien mit Chitinase und verschiedenen Adjuvantien im Mausmodell durchgeführt. Dazu wurden BALB/c-Mäuse verwendet, da für immunologische Untersuchungen von M. unguiculatus nicht ausreichend käufliche Reagenzien zu Verfügung stehen. Bei diesen Untersuchungen wurde neben der humoralen Immunantwort auch die zelluläre Reaktivität mittels T-Zell-Proliferationstests untersucht. Zudem sollte die Evaluierung der Zytokine IL-4, IL-10 und INF-
auf mRNA-Ebene Aufschluß über eine mögliche Polarisierung der T-Zell-Antwort geben.
In dieser Versuchsreihe wurden je 6 BALB/c-Mäuse jeweils 3 x im Abstand von je 10 Tagen mit den folgenden Adjuvantien immunisiert: Chitinase ohne Adjuvans, Chitinase mit STP, Chitinase mit Alum oder mit Salmonellen, die Chitinase exprimierten. Die Kontrollgruppen erhielten jeweils nur PBS/1M Harnstoff, STP, Alum oder Salmonellen mit dem Vektor ohne Fremd-DNA.
Die Milzen von je zwei Tieren pro Gruppe wurden 10 Tage nach der letzten Immunisierung entnommen, aufgearbeitet und die Milzzellen in T-Zell-Proliferationstests eingesetzt. Die Wiederholung des Versuches erfolgte 10 Tage später, jedoch konnte der Test wegen technischer Schwierigkeiten nicht ausgewertet werden.
Die höchsten (3000cpm) erzielten Milzzellen von Tieren, die Chitinase in Kombination mit STP verabreicht bekamen (Abb. 14). Die T-Zell-Reaktivität von Mäusen, denen Chitinase mit Alum appliziert wurde, lag mit 1500cpm knapp unter den Ergebnissen der Chitinase/STP-Gruppe, aber deutlich über den Werten der Kontrollgruppen. Milzzellen der Kontrolltiere zeigten nach Stimulation mit OvL3-Chitinase keinerlei Aktivität, so daß eine unspezifische Aktivierung von T-Zellen gegen Chitinase ausgeschlossen werden konnte.
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Abb 14. :T-Zell-Reaktivität von BALB/c-Mäusen, die mit Chitinase in Kombination mit verschiedenen Adjuvantien immunisiert wurden. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte der netto cpm + Standardabweichung
Die Immunisierung mit Salmonellen, die Chitinase exprimierten, erfolgte durch die orale Gabe von 5x107-20x109 CFU. In diesem Versuchsansatz wurde zweimal im Abstand von 10 Tagen immunisiert. Im Laufe des Versuches verstarben zwei Tiere aus der pTECH Gruppe und ein Tier aus der Chitinase/pTECH Gruppe. Bei diesen Tieren konnte deutliche Anzeichen einer systemischen Salmonelleninfektion beobachtet werden. Von den verbleibenden Tieren wurde fünf Tage lang Kot gesammelt, aufgearbeitet und mit Hilfe von Selektionsagar Salmonellen nachgewiesen. Zudem wurde je einem Tier pro Gruppe Milz und Leber entnommen, um in den Organen Salmonellen nachweisen zu können. Während bei den Tieren, die nur die Salmonellen mit dem Vektor pTECH erhielten, Salmonellen in Leber, Milz und im Kot nachgewiesen werden konnten, ließen sich Salmonellen, die Chitinase exprimierten, nur in der Leber des immunisierten Tieres finden. In dieser Gruppe konnten keine Salmonellen im Kot detektiert werden.
10 Tage nach der letzten Immunisierung erfolgte die Entnahme der Milzen von je 2 Tieren aus jeder Gruppe. Auffällig waren stark (bis 10 fach) vergrößerte Leber und Milzen dieser Tiere. Bei diesem Versuchsansatz konnte keine T-Zell-Reaktivität nach Stimulation mit Chitinase bei den immunisierten Tieren und den Tieren aus der Kontrollgruppe gefunden werden. Erst Tiere, denen 30 Tage nach der letzten Immunisierung die Milzen entnommen und Milzzellen isoliert worden waren, waren in der Lage, nach Stimulation mit Chitinase zu reagieren.
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Dabei konnte man ähnliche Werte wie nach Gabe von Chitinase/STP ermitteln. Hier konnten netto Proliferationswerte von 3700cpm gemessen werden. Tiere, die nur den Vektor pTECH erhalten hatten, reagieren nach Stimulation mit OvL3-Chitinase nicht mit einer Aktivierung und Teilung der Milzzellen (Abb. 15).
Abb 15: T-Zell-Reaktivität von mit Salmonellen immunisierten BALB/c-Mäusen nach Restimulation mit rekombinanter Chitinase. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte der netto cpm+ Standardabweichung.
Nach Immunisierung der Mäuse mit Chitinase ohne Adjuvans, Chitinase mit STP und Chitinase in Kombination mit Alum konnten bei allen Tieren IgG-Antikörper gemessen werden (Abb. 16). Untersucht man die Subklassen der einzelnen Gruppen, so konnten bei der Gruppe, die Chitinase ohne Adjuvans erhalten hatte, nur Antikörper der Subklasse IgG1 detektiert werden. Die OD450-Meßwerte der Subklassen IgG2a, IgG2b und IgG3 lagen mit 0,02-0,05 in dem selben Bereich wie die Werte der zugehörigen Kontrollgruppe PBS/Harnstoff.
Wurde den Mäusen Chitinase in Kombination mit STP appliziert (Gruppe 3), konnte neben IgG-Antikörpern Immunglobuline aller Subklassen ermittelt werden. Bei IgG1 lag die OD450 bei 0.746 während die Subklassen IgG2a mit OD450 von 0,4 und von 0,25 bei IgG2b gegenüber den anderen Gruppen erhöhte Werte aufwiesen.
Die Gabe von Chitinase in Kombination mit Alum (Gruppe 5) bewirkte in Mäusen eine Antikörperantwort, die sich in einer starken IgG1-Antwort ausdrückte. Antikörper der Subklassen
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IgG2a, IgG2b und IgG3 zeigten im Vergleich der Kontrollgruppe nur leicht erhöhte OD-Werte von 0,01-0,05, die statistisch nicht signifikant waren.
Abb 16: Antikörperantworten von BALB/c-Mäusen, die mit Chitinase in Kombination mit verschiedenen Adjuvantien immunisiert wurden. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte + Standardabweichung von IgG und IgG-Subklassen.
Obwohl der Nachweis von Salmonellen in den Organen positiv ausfiel und eine Restimulierung mit Chitinase möglich war, konnten keine antigen-spezifischen Antikörper gefunden werden. Um zu überprüfen, ob die Immunisierung zu einer humoralen Immunantwort geführt hat, oder ob nur eine zellvermittelte Immunantwort erfolgte, wurde die Antikörperantwort gegen Salmonellen-LPS im ELISA überprüft.
Es konnten deutliche Unterschiede in der Reaktivität der einzelnen Tiere auf Salmonellen-LPS festgestellt werden (Abb. 17). Nur ein Tier, das mit dem Vektor pTECH immunisiert wurde, reagierte mit einer deutlichen IgG-Antikörperantwort (Tier 5: OD450 1,0). Auch bei der Gruppe die Chitinase/pTECH erhielten, zeigte ein Tier (Tier 1) einen erhöhten Gehalt an IgG-Antikörpern. Bei
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den übrigen Tieren ließen sich kaum IgG-Antikörper im Serum nachweisen. Antikörper der Subklassen IgG3 und IgG1 konnten im Serum der Tiere nicht nachgewiesen werden, so daß, bedingt durch die geringen Antikörperantworten auf die Testung von den Subklassen IgG2a und IgG2b verzichtet wurde.Abb.17 :Antikörperantworten der mit Salmonellen immunisierten BALB/c-Mäuse. Dargestellt sind die Mittelwerte + Standardabweichung von IgG-, IgG3- und IgG1- Antikörperantworten auf Salmonellen-LPS.
von Mäusen mittels RT-PCR Um das Zytokinmuster der immunisierten Mäuse zu untersuchen, wurden Milzzellen der Mäuse, die mit den oben beschriebenen Adjuvantien immunisiert wurden, gewonnen. Die Milzzellen wurden mit rekombinanter Chitinase und ohne Antigen inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten (8h, 24h, 48h und 96h) wurden die Überstände der Kultur verworfen und die Zellen in RNA-Isolierungsreagenz (Trisolv®, AGS) aufgenommen.
Nach Isolierung der RNA und Umschreibung in cDNA erfolgte die Amplifikation der cDNA von ß2-Mikroglobulin, um eine erfolgreiche Gewinnung der cDNA zu dokumentieren. Es wurden zuerst Zellen nach 48h Inkubation mit Chitinase bzw. ohne Antigen untersucht. Bei der Gruppe Chitinase/STP und STP wurden zudem noch Milzzellen untersucht, die 8h und 24h mit Chitinase stimuliert wurden.
Bei allen Proben konnte cDNA von ß2-Mikroglobulin amplifiziert werden. Anschließend wurden die Proben durch Titration der cDNA auf eine annähernd gleiche Bandenstärke nach erfolgter PCR eingestellt. Mit diesem Schritt sollten Unterschiede in der cDNA-Konzentration nach der
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Umschreibung ausgeglichen werden (Abb. 18a). Die ermittelte Menge an cDNA wurde in die anschließende PCR für die Amplifikation der Zytokine IL-4, IL-10 und INF- eingesetzt und das Amplifikat nach Auftrennung im Agarosegel mit dem E.A.S.Y. Programm der Firma Herolab ausgewertet (Abb. 18 b und c). Mit Hilfe dieses Programmes wurden zuerst die Intensitäten der Banden des Markers ausgemessen. Diese Intensität wurde den entsprechenden ng des Markers zugeordnet. An Hand dieser Werte wurde eine Standardkurve von dem Programm erstellt. Die Intensitäten der amplifizierten cDNA jeder Probe wurde ausgemessen und die zugehörige ng-Menge mit Hilfe der Standardkurve ermittelt. Die Ergebnisse wurden mit +/-, +, ++, +++ und ++++ in Tabellen dargestellt (Tab. 1 und 2).
Abb.18a. Amplifikation von ß2Mikroglobulin nach Reverser Transkription
Spur 1: Marker; Spur 2: Gruppe 1: ohne Restimulation; Spur 3: mit Chitinase restimuliert; Spur 4: Gruppe 2: ohne Restimulation, Spur 5: mit Chitinase restimuliert; Spur 6: Gruppe 3: ohne Restimulation; Spur 7: mit Chitinase restimuliert; Spur 8: Gruppe 4: ohne Restimulation; Spur 9: mit Chitinase restimuliert; Spur 10: Marker; Spur 11: Gruppe 5: ohne Restimulation; Spur 12: mit Chitinase restimuliert; Spur 13: Gruppe 6: ohne Restimulation Spur 14: mit Chitinase restimuliert; Spur 15: Positivkontrolle; Spur 16: Negativkontrolle
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Abb. 18b. Amplifikation der Zytokine IL-4 , IL-10 und INF- von unstimulierten Zellen (RPMI) nach 48h Inkubation.
Spur 1: Marker; Spur 2-6: Amplifikation von IL-4 von unstimulierten Zellen der Gruppe 1-6, Spur 7-12: Amplifikation von IL-10 von unstimulierten Zellen der Gruppe 1-6, Spur 13-18: Amplifikation von INF- von unstimulierten Zellen der Gruppe 1-6
Abb.18c.: Amplifikation der Zytokine IL-4 , IL-10 und INF- nach 48 h Stimulation mit rek. OvL3-Chitinase.
Spur 1: Marker; Spur 2-6: Amplifikation von IL-4 von mit Chitinase restimulierten Zellen der Gruppe 1-6, Spur 7-12: Amplifikation von IL-10 von mit Chitinase restimulierten Zellen der Gruppe 1-6, Spur 13-18: Amplifikation von INF- von mit Chitinase restimulierten Zellen der Gruppe 1-6
Untersucht man Milzzellen von Mäusen, die nur mit Chitinase ohne Adjuvans immunisiert wurden, konnte nach 48h Restimulation mit Chitinase die mRNA von IL-10 nachgewiesen werden. Bei Milzzellen, die ohne Antigen inkubiert wurden, konnte die mRNA von IL-4 und INF- detektiert werden. Ähnliche Ergebnisse konnte auch bei Milzzellen der zugehörigen Kontrollgruppe gefunden werden. Tiere, die nur PBS/1M Harnstoff verabreicht bekamen, zeigten bei
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Untersuchungen auf mRNA-Ebene, daß nach Restimulation mit Chitinase nur IL-10 transkribiert wurde. Dagegen konnte im unstimulierten Ansatz nicht nur IL-10 und sondern auch noch INF- nachgewiesen werden. Interleukin 10 konnte nach Restimulation mit Chitinase in der Versuchsgruppe, die mit Chitinase in Kombination mit STP bzw. nur mit STP immunisiert wurden, gefunden werden. Zusätzlich ließ sich ein schwaches Transkript der mRNA von INF- bei Milzzellen der STP-Gruppe nachweisen. Ohne Restimulation konnte bei beiden Gruppen die mRNA der Zytokine IL-4, IL-10 und INF- nachgewiesen werden, wobei die Transkripte der Milzzellen, die von Chitinase /STP immunisierten Mäusen stammten, stärker waren als die, der zugehörigen Kontrollgruppe STP. Bei Mäusen, die mit Chitinase /Alum immunisiert wurden, konnten sowohl in den unstimulierten als auch in den mit Chitinase stimulierten Ansätzen Transkripte gleicher Stärke bei allen untersuchten Zytokine gefunden werden. Eine Ausnahme bildete INF-, dessen Amplifikat nach Restimulation mit Chitinase deutlich stärker war. Bei Milzzellen von Mäusen, die nur Alum verabreicht bekamen, ließ sich die mRNA von IL-10 nach Stimulation mit Chitinase nachweisen, während ohne Stimulation neben der mRNA von IL-10 noch die mRNA von INF- gefunden werden konnte (Tab.1+2).
Da diese Informationen wenig zusätzliche Informationen lieferten, wurde von der Chitinase/STP bzw. STP-Gruppe Milzzellen untersucht, die nur 8h bzw. 24h mit Chitinase bzw. ohne Antigen stimuliert wurden. Bei diesem Ansatz wurde zusätzlich das Zytokin TNF-
untersucht. Nach Stimulation mit Chitinase konnte neben der mRNA von IL-4 und IL-10 deutliche Transkripte von INF- und TNF- nachgewiesen werden. Wurde die Zellen ohne Antigen kultiviert, konnten schwache Transkripte von IL-10 und INF-, jedoch ähnlich starke Transkripte von TNF- wie nach Stimulation mit Chitinase gefunden werden. Nahezu identische Ergebnisse erhielt man, wenn man Zellen untersuchte, die von Mäusen stammten, die nur mit STP immunisiert wurden. Einziger Unterschied zu der Chitinase/STP-Gruppe lag in dem Nachweis von IL-4 mRNA bei Zellen, die ohne Antigen inkubiert wurden (Tab.1+2). Nach 24h Restimulation mit Chitinase konnte sowohl in der Gruppe, die mit Chitinase/STP als auch in der Gruppe, die nur STP verabreicht bekamen, Transkripte von IL-10, INF- und TNF- nachgewiesen werden. Ohne Restimulation mit Chitinase ließ sich die mRNA von INF- in der Chitinase /STP-Gruppe nachweisen, während bei der STP-Gruppe der Nachweis aller untersuchten Zytokine (IL-4, IL-10, INF- und TNF- erfolgreich war (Tab.1+2).
73
|
|
Chitinase 8 Stunden |
Chitinase 24 Stunden |
Chitinase 48 Stunden |
|||||||||
|
|
IL-4 |
IL-10 |
INF- |
TNF- |
IL-4 |
IL-10 |
INF- |
TNF- |
IL-4 |
IL-10 |
INF- |
TNF- |
|
G1 Chitinase |
|
|
|
|
|
|
|
|
- |
++ |
+ |
n.d. |
|
G2 PBS/1M Harnstoff |
|
|
|
|
|
|
|
|
- |
++ |
- |
n.d |
|
G3 CtG3Chit/STP |
++ |
++ |
+++ |
+++ |
- |
++ |
++ |
+++ |
- |
++ |
- |
n.d. |
|
G4 STP |
+ |
++ |
+++ |
+++ |
- |
++ |
++ |
+++ |
- |
++ |
+/- |
n.d. |
|
G5 Chit/Alum |
|
|
|
|
|
|
|
|
++ |
++ |
++ |
n.d. |
|
G6 Alum |
|
|
|
|
|
|
|
|
- |
++ |
- |
n.d- |
|
|
RPMI 8 Stunden |
RPMI 24 Stunden |
RPMI 48 Stunden |
|||||||||
|
|
IL-4 |
IL-10 |
INF- |
TNF- |
IL-4 |
IL-10 |
INF- |
TNF- |
IL-4 |
IL-10 |
INF- |
TNF- |
|
G1 Chitinase |
|
|
|
|
|
|
|
|
++ |
- |
+++ |
n.d. |
|
G2 PBS/1M Harnstoff |
|
|
|
|
|
|
|
|
- |
++ |
+++ |
n.d. |
|
G3 Chit/STP |
- |
+ |
+ |
+++ |
- |
- |
++ |
n.d. |
++ |
+++ |
+++ |
n.d. |
|
G4 STP |
+ |
+ |
+ |
+++ |
++ |
++ |
+++ |
+++ |
+/- |
+ |
++ |
n.d. |
|
G5 Chit/Alum |
|
|
|
|
|
|
|
|
++ |
++ |
+++ |
n.d. |
|
G6 Alum |
|
|
|
|
|
|
|
|
- |
+ |
++ |
n.d |
74
Um die zelluläre Immunantwort gegen Chitinase näher zu charakterisieren, wurden drei verschiedene Algorithmen angewendet, die innerhalb des Proteins T-Zell-Epitope identifizieren. Es wurde der Algorithmus von Rothbard und Taylor, die Vorhersage der MHC-Bindungs-Motive nach Rammensee und der Algorithmus von Humphreys angewendet. Zusätzlich gewährleisteten überlappende Peptide von 16 AS Länge, die die gesamte Chitinase umspannten (Pepscan), daß möglichst viele T-Zell-Epitope erkannt wurden. Zunächst wurden die vorhergesagten T-Zell-Epitope mit den tatsächlich gefundenen Epitopen aus dem Pepscan verglichen. Durch die Termini Sensitivität und Spezifität wurden die Algorithmen in ihrer Genauigkeit und Zuverlässigkeit beurteilt. Mit diesem Ansatz sollten nicht nur Epitope innerhalb der Chitinase identifiziert werden, sondern Rückschlüsse auf die Anwendbarkeit dieser Algorithmen auf große Datenbanken gezogen werden. Alle vorhergesagten Epitope wurden synthetisch mit einer Länge von 15 AS, bzw. die vorhergesagten Humphreys-Peptide gemäß der Vorhersage mit 13 AS hergestellt und anschließend in Proliferationsstudien eingesetzt. Dazu wurden Milzzellen von BALB/c-Mäuse verwendet, die 3x mit Chitinase/STP immunisiert wurden.
Der Algorithmus von Rothbard und Taylor konnte 24 Epitope innerhalb der O. volvulus-L3-Chitinase identifizieren (Abb. 20). Die meisten dieser Epitope befanden sich innerhalb der katalytischen Domäne. Weitere Cluster von Epitopen konnte dieser Algorithmus innerhalb der CBD detektieren. Die vorhergesagten Epitope wurden mit den tatsächlichen T-Zell-Epitopen, die mit Hilfe des Pepscans ermittelt wurden, verglichen. Dieser Algorithmus zeigte eine gut Sensitivität von 0,54, jedoch nur eine geringe Spezifität (0,33) (Abb. 19).
75
Abb. 19. Sensitivität und Spezifität der T-Zell Algorithmen.
Mit der Hilfe dieser Vorhersage konnten 10 MHC-Bindungs-Motive für BALB/c Mäuse mit dem genetischen Hintergrund 2H-Ed innerhalb der O. volvulus-L3-Chitinase aufgedeckt werden. Alle diese Epitope befanden sich innerhalb der katalytischen Domäne und beinhalteten mit einer Ausnahme mindestens ein Rothbard und Taylor Motiv (Abb. 19). Der Algorithmus von Rammensee erreichte einen hohen Spezifitäts- (0,7) und einen guten Sensitivitätsindex (0,47). Damit erwies sich diese Vorhersage als zuverlässigste der getesteten Algorithmen.
Eine Überprüfung der OvL3-Chitinase mit dem Algorithmus von Humphreys ergab, daß 13 Abschnitte die Anforderungen dieses Algorithmus erfüllen konnten. Dabei befand sich immer mindestens ein Rothbard und Taylor-Motiv innerhalb des Abschnittes. Übereinstimmende Epitope wurden zudem mit der Vorhersage der MHC-Bindungs-Motive nach Rammensee gefunden (Abb. 20). Dieser Algorithmus konnte jedoch nur eine Sensitivität von 0,28 und eine Spezifität von 0,3 erreichen.
76
Wurden alle Algorithmen auf die OvL3-Chitinase angewendet, so konnte der Sensitivitätsindex auf 0,67 erhöht werden. Jedoch sank durch die große Anzahl der vorhergesagten Epitope der Spezifitätsindex auf 0,21. Wurden nur zwei Algorithmen kombiniert, so konnte bei der Anwendung des Algorithmus von Rothbard und Taylor und der Vorhersage der MHC-Bindungs-Motive nach Rammensee die besten Ergebnisse erzielt werden. Die Sensitivität blieb bei 0,67, während sich der Spezifitätdindex auf 0,33 erhöhte.
Abb. 20: AS-Sequenz der O. volvulus-L3-Chitinase. Die vorhergesagten T-Zell-Epitope sind in die Sequenz eingetragen. Die Bereiche, die von dem Algorithmus nach Rothbard und Taylor vorhergesagt wurden, sind unterstrichen, während die Abschnitte der Rammensee-Vorhersage oberhalb der Sequenz eingetragen wurden. Mit Sternen oberhalb der Sequenz wurde die Vorhersage nach Humphreys gekennzeichnet. Mit einem hellgrauen Kasten versehen sind die T-Zell-Abschnitte, die von allen Algorithmen detektiert wurden, während das aktive Zentrum grau unterlegt wurde. Zusätzlich wurden die Signalsequenz und die Chitin-Binde-Domäne (CBD) eingezeichnet.
77
|
2a. |
Lokalisation AS |
Rothbard und Taylor-Peptide |
Korrespondierende Pepscan-Peptide |
Reaktivität im T-Zell-Tests |
Reaktivität im Pepscan-Tests |
|
|
28-43 |
1. AYGYVRGCYYTNWAQY |
4-7 |
++ |
- |
|
|
45-58 |
2.RQGEGKFLPEDIPKG |
8-10 |
++ |
++ |
|
|
53-67 |
3. EDIPKGLCTHILYAF |
11-13 |
++ |
- |
|
|
85-99 |
4. DTNWSKGMYSRVTKL |
19-21 |
- |
- |
|
|
102-116 |
5. NDPEMKILLSYGGYN |
23-25 |
++ |
++ |
|
|
128-143 |
6. RAEKRKHFIKSAIAFL |
29-31 |
+++ |
+ |
|
|
193-207 |
7. AVSAGKHTIDQSYNV |
46/47 |
- |
+ |
|
|
231-245 |
8. NVDLHAKLHPTKGETS |
55-57 |
+++ |
++ |
|
|
258-272 |
9. NYWLSKGMPKQKIII |
62-64 |
++ |
++ |
|
|
263-278 |
10. GMPKQKIIIGIPTYG |
63-65 |
+ |
+++ |
|
|
275-289 |
11. PTYGRGWTLRDSSKT |
66-68 |
- |
- |
|
|
284-297 |
12. LRDSSKTTIGAEGIS |
68-70 |
- |
- |
|
|
304-317 |
13. TNPAGGTAAYWEICK |
73-75 |
+ |
- |
|
|
313-327 |
14. YWEICKYLKEGGKET |
76-78 |
++ |
++ |
|
|
327-341 |
15. TIDEQGVGACMVQGS |
79-81 |
+++ |
- |
|
|
247-362 |
16. NEETIRMKMRWLKEK |
84-86 |
+++ |
+++ |
|
|
352-366 |
17. IRMKMRWLKEKGYGG |
85-87 |
++ |
+ |
|
|
357-371 |
18. RWLKEKGYGGAFIWT |
87-89 |
+ |
+ |
|
|
361-375 |
19. EKGYGGAFIWTLDFD |
88-90 |
++ |
++ |
|
|
404-428 |
20. TTRSLRTTITQSSTI |
98-100 |
+ |
- |
|
|
432-446 |
21. ITKNNKIKTTTIAVE |
105-107 |
+/ |
- |
|
|
465-479 |
22. HPNDCHLFIHCAHDH |
114-116 |
+/- |
- |
|
|
468-473 |
23. CHLFIHCAHDHPYVK |
114-116 |
+/- |
- |
|
|
478-503 |
24. TFFNDKIKVCDHFGE |
119-122 |
- |
- |
|
2b. |
Lokalisation AS |
Rammensee-Peptide |
Korrespondierende Pepscan-Peptide |
Reaktivität im T-Zell-Tests |
Reaktivität im Pepscan-Tests |
|
|
47-61 |
1. egkflpedipkglct |
9/10 |
- |
- |
|
|
122-146 |
2.ftairnraekrkhfi |
29 |
++ |
+ |
|
|
134-148 |
3. hfiksaiaflrknkf |
32 |
- |
++ |
|
|
171-185 |
4.emkvafveeakksds |
39/41 |
++ |
++ |
|
|
231-245 |
5. nvdlhaklhptkget |
56 |
++ |
++ |
|
|
257-273 |
6. anywlskgmpkqkii |
62 |
- |
- |
|
|
256-260 |
7. aanywlskgmpkqki |
62 |
++ |
+ |
|
|
278-292 |
8.grgwtlrdsskttig |
68 |
++ |
- |
|
|
310-334 |
9. taayweickylkegg |
76 |
- |
- |
|
|
349-363 |
10. eetirmkmrwlkekg |
86 |
++ |
++ |
78
|
2c. |
Lokalisation AS |
Humphreys-Peptide |
Korrespondierende Pepscan-Peptide |
Reaktivät im T-Zell-Tests |
Reaktivität im Pepscan-Tests |
|
|
47-60 |
1. GKFLPEDIPKGLC |
8-10 |
- |
++ |
|
|
85-97 |
2. DTNWSKGMYSRVT |
18-20 |
++ |
- |
|
|
89-103 |
3. KGMYSRVTKLKEN |
19-21 |
- |
- |
|
|
97-110 |
4. KLKENDPEMKILL |
22-23 |
+ |
++ |
|
|
227-240 |
5. WEMNVDLHAKLHP |
54-56 |
- |
++ |
|
|
233-245 |
6. DLHAKLHPTKGET |
56-57 |
+ |
++ |
|
|
253-265 |
7. TEFAANYWLSKGM |
61-62 |
+++ |
- |
|
|
268-281 |
8. KIIIGIPTYGRGW |
64-65 |
++ |
++ |
|
|
311-323 |
9. AAYWEICKYLKEG |
75-77 |
++ |
- |
|
|
350-362 |
10. ETIRMKMRWLKEK |
84-86 |
+++ |
++ |
|
|
429-441 |
11. ASEITKNNKIKTT |
104-106 |
++ |
- |
|
|
460-472 |
12. FGLFRHPNDCHLF |
112-114 |
++ |
- |
|
|
471-483 |
13. LFIHCAHDHPYVK |
114-116 |
++ |
- |
Vergleicht man die vorhergesagten Epitope der Algorithmen, so konnten 5 Bereiche von alle Vorhersagen als vermutliche T-Zell-Epitope identifiziert werden. Das erste Epitop befand sich in der katalytischen Domäne an Position bp 47-61. Während der Algorithmus von Rothbard und Taylor zwei nicht zusammen hängende Abschnitte innerhalb des Bereiches erkannte, konnte der gesamte Abschnitt konnte sowohl von der Vorhersage nach Rammensee als auch von dem Humphreys-Algorithmus als T-Zell-Epitop detektiert werden. An Position bp 231-245 war das zweite gemeinsame Epitop lokalisiert. Dieser Abschnitt entsprach den Anforderungen des Algorithmus nach Rothbard und Taylor und den MHC-II-Bindungs-Motiven nach Rammensee. Der Algorithmus nach Humphreys hingegen identifizierte zwei Sequenzabschnitte, die sich um acht AS überlappen (bp 227-240/233-245), aber insgesamt der Vorhersage der MHC-Bindungs-Motiven nach Rammensee entsprachen.
Das nächste Epitop befand sich an Position bp 257-273. Sowohl die Vorhersage von Rothbard und Taylor konnte diesen Abschnitt als vermutliches T-Zell Epitop identifizieren (bp 258-272), als auch die Vorhersage nach Rammensee. Der Algorithmus von Humphreys sagte zwei vermutliche T-Zell-
80
Epitope in diesem Abschnitt voraus (bp 253-265 und bp 268-281).
Der Algorithmus von Rothbard und Taylor identifizierte 24 Abschnitte innerhalb der O. volvulus-L3-Chitinase. Die vorhergesagten Bereiche wurden auf 15 AS entsprechend der Sequenz gleichmäßig nach beiden Seiten erweitert und als synthetische Peptide hergestellt. Diese Peptide wurden in T-Zell-Tests eingesetzt, bei denen Milzzellen von BALB/c-Mäusen verwendet wurden, die zuvor mit rekombinanter O. volvulus-L3-Chitinase (in Kombination mit STP) immunisiert wurden. Abbildungen 21 und 22b zeigen ein repräsentatives Experiment (von 4 Experimenten) der T-Zell-Antworten von immunisierten Mäusen gegen Rothbard und Taylor-Peptide. Drei Peptide waren in der Lage, Milzzellen zu stimulieren und Werte von mehr als 2000cpm (2000-3000cpm) hervorzurufen. Während Milzzellen gegen elf weitere Peptide mit Proliferationswerten von 1000-1500cpm reagierten, konnten die restlichen Peptide Milzzellen nicht zur Proliferation anregen.
81
Die Vorhersage der MHC-Bindungs-Motive von Rammensee sagte für die O. volvulus-L3-Chitinase bei BALB/c-Mäusen mit dem genetischen Hintergrund H2-Ed 10 T-Zell-Epitope vorher. Wurden die vorhergesagten Bereiche als synthetische Peptide mit 15 AS Länge in T-Zell-Tests eingesetzt, konnten zwei Peptide Milzzellen zur Stimulation mit Proliferationswerten zwischen 1500 und 2000cpm anregen. Während vier Peptide auf Milzzellen keinerlei Einfluß hatten, reagierten vier weitere Peptide mit mehr als 3000cpm (3000-6600cpm) (in Abb. 21 und 22c ist ein repräsentatives Experiment von 4 Experimenten dargestellt).
Die Vorhersage nach Humphreys konnte 13 Epitope innerhalb der O. volvulus-L3-Chitinase lokalisieren. Diese Peptide wurden gemäß der Vorhersage mit einer Länge von 13 AS synthetisch hergestellt. Während vier Peptide in der Lage waren, Milzzellen zur Proliferation mit Werten zwischen 1000 und 1500cpm anzuregen, konnten 5 weitere Pepitde Milzzellen zu Proliferationswerten von 2000-6000cpm anregen. Die restlichen vier Peptide riefen keine Reaktion bei den T-Zellen hervor (in Abb. 21 und 22d ist ein repräsentatives Experiment von 5 weiteren Experimenten dargestellt).
82
83
Abb.21a-d und 22 a-d: T-Zell-Reaktivität nach Stimulation mit den verschiedenen Peptiden. Dargestellt sind die netto cpm nach Abzug der spontanen Proliferation (RPMI) und die Standardabweichung. Mit dunklen Balken sind die Peptide dargestellt, die von allen Algorithmen vorhergesagt wurden.
Ein Set von 122 überlappenden 16mer Peptiden, die sich jeweils um 12 AS überschnitten und die gesamte Chitinase umspannten, wurden synthetisch hergestellt. Durch die unterschiedliche Länge der Pepscan-Peptide und der Peptide der Vorhersagen variierten die flankierenden Bereiche um die antigene Kern-Determinante, so daß keine identischen Peptide in diesen Experimenten verwendet wurden. Die Pepscan-Peptide wurden in T-Zell-Tests eingesetzt, bei denen Milzzellen von mit OvL3-Chitinase/STP immunisierten Mäusen verwendet wurden (dargestellt ist in Abb. 21a und 22a ein repräsentatives Experiment von 7 weiteren Experimenten).
In dieser Arbeit wurde die OvL3-Chitinase ohne Signalsequenz kloniert, aufgereinigt und in Immunisierungsstudien eingesetzt, um die Expression in E. coli zu erleichtern. Deshalb konnte die am N-Terminus befindliche Signalsequenz von Milzzellen immunisierter Tiere nicht erkannt werden und reagierten nach Stimulation mit den Pepscan-Peptiden nicht mit Proliferation. An diesen Abschnitt schloß sich die katalytische Domäne an. Im vorderen Teil dieser Domäne konnte das Pepscan-Peptid 8 Milzzellen zur Proliferation von 2839cpm anregen (Abb. 21a). In diesem Bereich konnten alle drei Algorithmen T-Zell-Epitope identifizieren. Nur die Rothbard und Taylor-Peptide (8-10) stimulierten Milzzellen zwischen 1300 und 1700cpm (Abb. 21b und 21c), während die Peptide der anderen Vorhersagen keine Reaktion bei Milzzellen hervorriefen. Eine deutliche T-Zell Antwort konnte das Peptid 17 hervorrufen. Hier konnten Proliferationswerte von 1700cpm gemessen werden. Weder der Algorithmus von Rothbard und Taylor noch von Rammensee oder Humphreys konnten in diesem Abschnitt ein Epitop detektieren.
Das nächste Peptid, das in der Lage war, Milzzellen zur Proliferation anzuregen, war Peptid 23. Nach Stimulation mit diesem Peptid konnte in T-Zell-Tests Werte von 2484cpm gemessen werden. Dieses Epitop konnte nur von der Vorhersage von Rothbard und Taylor und von Humphreys identifiziert werden. Dabei erzielte das Rothbard und Taylor-Peptid mit 1465cpm ähnliche Ergebnissen wie das Humphreys-Peptid (1308cpm). Die Stimulation mit den Pepscan-Peptiden 28/29 konnte Milzzellen zur Proliferation mit 1000-1600cpm anregen (Abb. 21a). Während die Vorhersage nach Rothbard und Taylor und nach Rammensee dieses Epitop vorhersagte, entsprach dieser Bereich nicht den Anforderungen der Vorhersage nach Humphreys. Dabei erzielte der Einsatz der synthetischen Rothbard und Taylor-Peptide in T-Zell-Tests ähnliche Proliferationswerte wie die Pepscan-Peptide,
85
während das Rammensee-Peptid keinen Einfluß auf die Milzzellen hatte (Abb. 21b und 21c).86
Taylor und von Humphreys T-Zell-Epitope voraus, während Rammensee keine MHC-Bindungs-Motive finden konnte. Rothbard und Taylor vermutete in diesem Abschnitt fünf T-Zell-Epitope, jedoch konnte kein Peptid T-Zell-Antworten über 1000cpm erzielen. Dem gegenüber stehen die Epitope, die von der Vorhersage von Humphreys vorhergesagt wurden (Peptide 104-106 und 112-114 und 114-116). Diese Peptide riefen T-Zell-Antworten zwischen 2500cpm und 3200cpm hervor.Tab. 3. T-Zell-Reaktivität der vorhergesagten T-Zell-Epitope im Vergleich mit dem Pepscan. In der ersten Spalte sind die Peptide aufgeführt, die von Rothbard und Taylor identifiziert wurden. In der zweiten Spalte ist die T-Zell-Reaktivität der vorhergesagten Peptide dargestellt und die Stärke der Reaktion mit + (
1000cpm), ++ ( 1500cpm), +++ ( 2000cpm) oder ++++ ( 3000cpm) beurteilt. In der nächsten Spalte befinden sich die vorhergesagten Rammensee-Peptide, gefolgt von der Spalte mit der Reaktivität der Peptide in T-Zell-Tests. Die nächsten zwei Spalten enthalten die vorhergesagten Epitope nach Humphreys und ihre Reaktivität im Proliferationsassays. In der letzten Spalte ist die Bestätigung der vorhergesagten Epitope durch die korrespondierenden Pepscan-Peptide dargestellt.
87
|
Lokalisation der reaktiven Pepscan-Peptide |
Reaktivität der Pepscan-Peptide im T-Zell-Test |
T-Zell-Epitope nach Rothbard und Taylor |
Reaktivität der Peptide im T-Zell-Test |
T-Zell-Epitope nach Rammensee |
Reaktivität der Peptide im T-Zell-Test |
T-Zell-Epitope nach Humphreys |
Reaktivität der Peptide im T-Zell-Test |
|
|
- |
4-7 |
++ |
- |
- |
- |
- |
|
8 |
+++ |
8-10 |
++ |
9-10 |
- |
8-10 |
- |
|
|
- |
11-13 |
++ |
- |
- |
- |
- |
|
17 |
++ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
- |
19-21 |
- |
- |
- |
18-20 19-21 |
+ - |
|
23 |
+++ |
23-25 |
+ |
- |
- |
22-23 |
+ |
|
28/29 |
+ |
29-31 |
++ |
29 |
- |
- |
- |
|
32 |
+++ |
- |
|
32 |
++++ |
- |
|
|
38-48 |
+/++++ |
46/47 |
- |
39-41 |
++++ |
- |
- |
|
54-58 |
++++ |
55-57 |
+++ |
56 |
+++ |
54-56 56/57 |
- - |
|
63/64 |
++/+++ |
62-64 63-65 |
+ + |
61/62 62 |
- ++ |
61/62 64/65 |
+++ ++ |
|
|
+/- |
66-68 68-70 |
- - |
68 |
- |
- |
- |
|
|
+/- |
73-75 |
- |
- |
- |
- |
- |
|
77/78 |
+++ |
76-78 |
+ |
76 |
++++ |
75-77 |
+ |
|
|
+/- |
79-81 |
+++ |
- |
- |
- |
- |
|
85/91 |
++++/++++ |
84-86 85-87 87-89 88-90 |
+++ ++ + ++ |
85/86 |
++++ |
84-86 |
++++ |
|
|
- |
98-100 |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
- |
105-107 |
- |
- |
- |
104-106 |
++++ |
|
|
- |
114-116 (2x) |
- |
- |
- |
112-114; 114-116 |
++++ ++++ |
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|
- |
119-122 |
- |
- |
- |
- |
- |
88
Alle Patienten, die in die Studie aufgenommen wurden, wurden mit Alter, Geschlecht, Name, Herkunft und Krankengeschichte erfaßt. Um den Infektionsstatus der Patienten zu ermitteln, wurden Hautbiopsien und Serum von den Patienten gewonnen. Eine Stuhluntersuchung und ein Blutausstrich diente dazu, eventuelle parasitäre Begleitinfektionen zu detektieren.
In die Studie wurden 49 männliche und 12 weibliche Personen aufgenommen. Das durchschnittliche Alter lag bei 31 Jahren. Bei 33% der Patienten konnte intestitale Parasiten wie Ascaris lumbricuides, Trichuris trichuris, Gardia lamblia, Enterobius vermicularis oder Entamöba spp. detektiert werden. 90% der untersuchten Patienten wiesen eine starke Eosinophilie (5-37% Eosinophile) im Blutausstrich auf. Die endemische Kontrollgruppe bestand aus 19 Personen, die alle aus der Hauptstadt Yaoundé stammten und in Durchschnitt 23 Jahren alt waren. In dieser Gruppe konnten nur bei zwei Individuen parasitäre Begleitinfektionen und eine leicht erhöhte Eosinophilie nachgewiesen werden (Tab. 4).
Bei 49 Patienten konnten Mikrofilarien mittels Hautbiopsien nachgewiesen werden. Dabei lag die mittlere Mikrofilarienlast pro mg Haut bei 26 (0,1-174 Mf/mg). Da die Proben erst nachträglich in Berlin gewogen werden konnten, muß bei den Ergebnissen durch Transport und Austrocknung mit Schwankungen gerechnet werden.
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Onchozerkose-Patienten n=61 |
Endemische Kontrollpersonen n=19 |
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Alter in Jahren |
31 |
23 |
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Mf-Last |
26Mf/mg |
- |
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IgG-/IgG4-Antikörper gegen OvAg |
100%/46% |
- |
|
IgG-/IgG4-Antikörper gegen Chitinase |
61%/77% |
- |
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IgG-/IgG4-Antikörper gegen CBD |
43%/20% |
- |
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Onchozerkome |
71% |
- |
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Eosinophilie |
90% mit durchschnittlich 14 Eosinophilen |
- |
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Intestinale Begleiterkrankungen |
Ascaris lumbricuides 8% Trichuris trichuris 16% Entamöba spp. 36% Gardia lamblia 10% Enterobius vermicularis 7% |
|
Untersucht wurden die Antikörperantworten auf O. volvulus Gesamtantigen (OvAg), O. volvulus-L3-Chitinase und der Chitin-Binde-Domäne. Im Gegensatz zu der afrikanischen Kontrollgruppe konnten bei allen Patienten IgG-Antikörper gegen OvAg detektiert werden (OD405 = 0,38). Ähnliche Werte erzielte auch die Messung der IgG4-Antikörper (OD405 = 0,40), die jedoch nur bei 28 von 61 Patienten im Serum gefunden werden konnten. Auf die rekombinante Chitinase zeigten 37 Patienten IgG-Antikörper, während sich im Serum von 48 Patienten IgG4-Antikörper gegen Chitinase befanden. Bei 26 Patienten konnten IgG-Antikörper gegen die OvL3-CBD nachgewiesen werden, jedoch enthielten nur 12 Seren Antikörper der Klasse IgG4 (Abb. 23).
90
Auffällig war ein Serum in der Kontrollgruppe, das sowohl Antikörper gegen OvAg als auch gegen OvL3-Chitinase und OvL3-CBD enthielt. Auf Grund dieser Daten wurde das Serum aus der Kontrollgruppe ausgeschlossen.
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OD 405 |
IgGgesamt |
IgG4 |
IgG3 |
IgG1 |
|
OvAg |
0,395 |
0,409 |
0,157 |
0,129 |
|
OvL3-Chit |
0,061 |
0,053 |
0,026 |
0,004 |
|
OvL3-CBD |
0,084 |
0,030 |
0,048 |
0,007 |
91
Abb. 23 a-d: Antikörperantworten der Onchozerkose Patienten (n=61) gegen Gesamtantigen (OvAg), Chitinase und CBD. Dargestellt sind die Einzelwerte der Antikörper IgG, IgG1, IgG3 und IgG4
Bei 49 Patienten, die in die Studie aufgenommen wurden, wurden die PBMC isoliert und in T-Zell-Proliferationstests eingesetzt. Dabei wurde zuerst die Fähigkeit der Zellen geprüft, auf Mitogen zu reagieren, bevor eine Stimulation mit rekombinanten Proteinen erfolgte. Auf Grund von technischen Schwierigkeiten konnten nur Proliferationsdaten von 30 Patienten und 9 Kontrollen ausgewertet werden. Sowohl endemische Kontrollen als auch die Onchozerkose-Patienten reagierten nach Stimulation mit PHA mit hohen Stimulationsindices von 158 (42-343, end. Kontrollen) bzw. 159 (24-547 Patienten). Nach Stimulation mit Con A zeigten die PBMC der Patienten deutlich geringere SI (SI
92
68 (9-232)) als die endemischen Kontrollen (SI 123 (44-283). Die Stimulationsfähigkeit mit ubiquitären Antigen wurde durch den Einsatz von Streptococcus pyrogenes (SL-O) getestet. Dieses Antigen mußte in hoher Konzentration eingesetzt werden (unverdünnt), damit sich sowohl die Zellen der endemischen Kontrollen als auch die Zellen der Patienten stimulieren ließen (SI 24,6 (1,2-160)). Die T-Zell-Reaktivität der Patienten auf spezifisches Antigen (OvAg) fiel bei Onchozerkose-Patienten mit durchschnittlichen SI von 2,5 (0,4-9,8) deutlich geringer aus als auf SL-O.Abb. 24: T-Zell-Proliferationswerte der PBMC der Onchozerkose-Patienten auf verschiedene Antigene. Die Werte sind als Stimulationsindizes angegeben, wobei die Proliferationswerte nach Stimulation durch die Werte ohne Stimulation geteilt wurden.
93
Da nur einige Patienten in der Lage waren, auf Stimulation mit Chitinase bzw. CBD mit Proliferation zu reagieren, wurde eine kleine Auswahl von PBMC auf Produktion der Zytokine IL-4, IL-5, INF- (je n=14) und IL-10 (n=5) hin untersucht. Die Auswahl der PBMC wurde an Hand der erhaltenen Proliferationsdaten getroffen. Dabei wurden überwiegend PBMC ausgewählt, die auf Chitinase, CBD oder Peptide mit Proliferation reagieren konnten. Zudem wurden einige PBMC ausgewählt, die keine T-Zell-Reaktivität aufwiesen.
Auch hier reagierten nur wenige Zellen mit Zytokinausschüttung, so daß die gebildeten Mittelwerte starke Streuungen aufweisen. An Hand dieser wenigen Daten konnte nur ein Trend abgelesen werden, wobei PBMC von Onchozerkose-Patienten auf rekombinante Chitinase und CBD mit vermehrter Ausschüttung von TH2-Zytokinen reagierten (Tab. 6).
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|
IL-4 pg/ml |
IL-5 pg/ml |
IL-10 pg/ml |
INF- |
|
Chitinase (n =14) |
26,5 |
16,7 |
72,3 |
6,8 |
|
CBD (n =14) |
60,1 |
22,0 |
65,5 |
224 |
|
Spontane Freisetzung |
37,4 |
21,1 |
4,2 |
76,7 |
|
Lit.: TH1/TH2 |
92/179 |
nd/4,7 |
80/165 |
3200/2400 |
|
Spontane Freisetzung |
78 |
<1 |
120 |
1960 |
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