Drabner, Birgit: Charakterisierung und Identifizierung von immundominanten Bereichen der L3-Chitinase von Onchocerca volvulus

Kapitel 4. Diskussion

Die Bekämpfung der Onchozerkose erfolgt durch die Behandlung der Bevölkerung mit Ivermectin® und durch Vektorbekämpfung. Es kommt jedoch zu zunehmenden Pestizid-Resistenzen der Insektenstämme. Begleitet werden diese Schwierigkeiten von der Notwendigkeit einer jährlichen Anwendung von Ivermectin und der Tatsache, daß dieses Medikament nur mikrofilarizid wirkt. Adulte Würmer müssen durch Nodulektomien entfernt werden. Dabei entstehen hohe Kosten, die oft mit logistischen Problemen verbunden sind. Die Entwicklung einer Vakzine, die den Entwicklungszyklus unterbrechen würde, könnte eine wertvolle Ergänzung der bestehenden Maßnahmen darstellen. Durch zahlreiche Untersuchungen über die Mechanismen zur Entstehung von Immunität konnten einige

Antigene von Onchocerca volvulus identifiziert werden, denen eine entscheidende Rolle im Infektionsverlauf zugeschrieben wird (Taylor et al. 1995, Taylor et al. 1996, Jenkins et al. 1996). Eines dieser Antigene stellt die Chitinase von infektiösen Drittlarven dar, die als prominentes Antigen mit einer möglichen Rolle bei erworbener Immunität beschrieben wurde (Freedman et al. 1989, Lucius et al. 1991). Zudem konnten Chitinasen an essentiellen Punkten des Filarienzyklus lokalisiert werden (Justus und Ivey 1969, Ward und Fairbairin 1972, Gooday et al. 1988, Adam et al. 1996). Diese Ergebnisse lassen die OvL3-Chitinase als geeigneten Impfstoffkandidaten erscheinen und gaben den Anstoß für die molekulare Charakterisierung der OvL3-Chitinase.

4.1. Klonierung der Chitinase und der Chitin-Binde-Domäne

Die cDNA der OvL3-Chitinase wurde in einen prokaryotischen Expressionsvektor kloniert und durch Affinitätschromathographie aufgereinigt, so daß es für weitere Studien zur Verfügung stand. Zusätzlich wurde der C-terminale Abschnitt des Proteins, die Chitin-Binde-Domäne, kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Der Einsatz der Chitin-Binde-Domäne sollte Aufschluß über die Lokalisation möglicher T-Zell-Epitope und über das protektive Potential dieser Domäne geben.
Während sich die Chitin-Binde-Domäne ohne Probleme klonieren und aufreinigen ließ, gestaltete sich die Klonierung und Expression der Chitinase in E. coli schwierig und gelang erst nach zahlreichen Variationen des Versuchsprotokolls. Da Bakterien eine eigene Chitinase und eigenes Lysozym besitzen, das neben der Spaltung von N-acetylmuramin und N-Acetylglucosamin in der Lage ist, Chitin zu spalten (Stryer, 1997), führte die Überexpression der bakterienfremden Chitinase offensichtlich zu Stoffwechsel- und damit zu Wachstumsproblemen der Bakterien. Der verwendete E.coli-Stamm XL-1 blue besitzt eine Mutation im Lac-Iq-Gen, die zu einer hohen Expression des Lac-Repressors führt (QIAexpressionist, 1999). So konnte die Expression der für die Bakterien toxischen Chitinase bis zum Zeitpunkt des Expressionsstartes unterbunden werden. Nach einer kurzen Expressionsphase von 3 Stunden konnte die Chitinase aus den Bakterienkulturen isoliert werden.
Die aufgereinigte Chitinase wurde in einem Aktivitätstest auf ihre Fähigkeit, das Substrat MU-GlucNac-3 zu spalten, überprüft. Das rekombinante Protein (in einer Konzentration mit 8,2 nM) zeigte enzymatische Aktivität, was durch die Zunahme der Fluoreszenz verfolgt werden konnte. Bei der Positivkontrolle, eine käufliche Chitinase von Serratia marcescens, konnte ein ähnlicher Verlauf während des Aktivitätstests beobachtet werden. Die eingesetzte Konzentration lag jedoch mit 3,5 nM deutlich unter der Konzentration der OvL3-Chitinase. Obwohl beide Chitinasen von gram-negativen Bakterien produziert wurden, handelt es sich bei Chitinase von Serratia marcescens um ein natives Protein, während die OvL3-Chitinase rekombinant in diesem prokaryotischen System produziert

wurde. Die OvL3-Chitinase wird in den Bakterien nicht posttranslational modifiziert, so daß sie vermutlich nicht in der optimalen Proteinkonfiguration vorliegt. Diese Konfiguration könnte jedoch für eine optimale Aktivität notwendig sein.

4.2. Einsatz der Chitinase in Immunisierungsstudien

4.2.1. Einsatz der Chitinase und der Chitin-Binde-Domäne im A. viteae-Meriones-Modell

Da O. volvulus streng primatenspezifisch ist, müssen Untersuchungen über das protektive Potential einzelner Antigene im Tiermodell erfolgen. Dabei eignet sich das Labormodell der Nagetierfilarie A. viteae besonders gut, weil in diesem System der gesamte Nagetierfilarienzyklus von A. viteae unter definierten Bedingungen ablaufen kann. Der Zwischenwirt O. moubata wird über eine Membran mit Blut gefüttert, das eine definierte Menge an Mikrofilarien enthält. Nach ca. 6-8 Wochen werden die infektiösen Drittlarven aus den Zecken isoliert und eine definierte Anzahl (70 oder 75 L3) dem Endwirt verabreicht. Nach Gabe der L3 gibt die Rückfindungsrate adulter Würmer Aufschluß über die Wirkung einzelner Antigene. In diesem System wurde die Chitinase in Kombination mit STP und die Chitin-Binde-Domäne mit Alum getestet.
Die Immunisierung mit Chitinase und STP hatte die Reduzierung der Adultwurmlast von 40% und in einem 2. Versuch von 17,7 % zur Folge. Jedoch konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den immunisierten Gruppen und der Kontrollgruppe gefunden werden. Die Ursache hierfür liegt in den großen Streuungen der Wurmlasten der einzelnen Tiere. Obwohl alle Tiere aus einem Inzucht-Stamm stammten, scheinen einzelne Tiere die Infektion besser kontrollieren zu können. Dies spiegelte sich auch in der Antikörperantwort der Tiere wieder. Während alle Tiere IgG-Antikörper gegen Chitinase bildeten, war der Gehalt an IgG3-Antikörpern in dem ersten Versuch negativ korreliert mit der Anzahl der Würmer (r = -0,8). In dem zweiten Versuch konnte eine Korrelation zwischen dem IgG3- Gehalt und der Anzahl der Würmer nicht gefunden werden. Die Untersuchungen der Antikörperantworten des zweiten Versuches zeigten eine Erhöhung der Antikörper-Subklasse IgG1, gefolgt von IgG3-Antikörpern.
Während IgG3-Antikörper bei TH1-Immunantworten vorherrschend sind, können Antikörper der Subklasse IgG1 bei TH2-Antworten gefunden werden. Durch die unterschiedlichen Antikörperantworten der zwei Versuche ließen sich keine Rückschlüsse zwischen Protektion und der Ausprägung einer bestimmten Immunantwort ziehen. Bei intestinalen Nematoden kann die Ausprägung einer TH2-Antwort für die erfolgreiche Kontrolle der Infektion verantwortlich gemacht werden (Urban et al. 1992, Lokslay et al. 1994). So konnten

BALB/c-Mäuse die Infektion mit Trichuris muris durch die Ausschüttung von TH2-Zytokinen erfolgreich kontrollieren. Dem gegenüber stehen Mäuse des Stammes AKR, die eine Infektion mit T. muris nicht bekämpfen können und bei denen Zytokine einer TH1-Antwort nachgewiesen werden konnten. Die Neutralisation von INF- gamma

führte bei den AKR-Mäusen zu einer erfolgreichen Ausheilung der Erkrankung, wohingegen die Blockierung von IL-4 bei BALB/c-Mäusen zum Ausbruch der Infektion führte.
Bei Filarieninfektionen kann die Zuordnung einer bestimmten Immunantwort für die erfolgreiche Bekämpfung der Erkrankung nicht erfolgen, da Untersuchungen über die Mechanismen zur Entstehung von Protektion zu gegensätzlichen Befunden führte. Lange et al. (1994) konnten in BALB/cBYJ-Mäusen, die mit strahlungsattenuierten L3 immunisiert wurden, eine erfolgreiche Abtötung der Larven, die in Diffusionskammern den Mäusen implantiert wurden, durch die Zytokine IL-4 und IL-5 nachweisen. Gegensätzliche Befunde zeigten Untersuchungen im Humansystem, wo Hinweise auf eine Beteiligung einer TH1-Immunantwort bei der Kontrolle der Infektion gefunden wurden. Patienten, die keine Krankheitssymtome aufweisen, sind im Gegensatz zu Onchozerkose-Patienten, durch eine verstärkte zelluläre Immunantwort gekennzeichnet (Finkelman et al. 1991; Elson et al. 1995). Die wiederholte Gabe von Ivermectin führt Onchozerkose-Patienten aus der zellulären Hyporeaktivität heraus, wobei sich die Immunreaktion in Richtung einer TH1-Antwort verschiebt (Soboslay et al. 1992). Zusätzlich konnte bei diesen Patienten ein hoher IgG3-Antikörper-Gehalt im Serum gefunden werden (Stewart et al. 1995). Offensichtlich spielt die Ausprägung einer TH1-Antwort eine entscheidende Rolle bei der Eliminierung der Erkrankung. Es wird angenommen, daß die Eliminierung der Parasiten zu einem sehr frühen Zeitpunkt erfolgt (Chandrashekar et al. 1985). Der hohe Gehalt an IgG3-Antikörpern läßt auf einen Abtötungsmechanismus schließen, der durch Komplementaktivierung und nachfolgende antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) in Gang gesetzt wird. Dabei könnte die Häutung von L3 zu L4 der mögliche Angriffspunkt dieser Antikörper sein (Brattig et al. 1991).

Die rekombinante Chitin-Binde-Domäne wurde den Wüstenrennmäusen in Kombination mit dem Adjuvans Alum verabreicht. Bei der anschließenden Sektion differierte die Anzahl der Würmer im Vergleich zu der Kontrollgruppe nur wenig. Da bei diesem Versuch nur die IgG-Antiköper-Antworten untersucht wurden, können keine Aussagen über eine Polarisation der Immunantwort gemacht werden. Untersuchungen über die Brugia malayi-Mf-Chitinase konnten durch den Einsatz eines verkürzten Proteins die wichtigsten protektiven Epitope auf der Chitin-Binde-Domäne lokalisieren (Venegas et al. 1996). Bei einem Einsatz dieser Domäne in Immunisierungsversuchen konnte die Mf-Last der immunisierten M. unguiculatus signifikant verringert werden (Wang et al. 1997). Vergleichbare

Ergebnisse konnten in dieser Studie mit der OvL3-CBD nicht erzielt werden. Nach Abschluß dieser Arbeit und Auswertung der Ergebnisse wird deutlich, daß die OvL3-Chitinase unter den getesteten Bedingungen eine TH2-Immunantwort induziert. Eine weitere Überprüfung der Chitin-Binde Domäne mit einem TH1-Adjuvans ist sinnvoll, um Aussagen über das protektive Potential dieser Domäne machen zu können.
Die Untersuchungen dieser Arbeit liefern Hinweise, daß die OvL3-Chitinase in Kombination mit einem geeigneten Adjuvans, welches die Verschiebung der Immunantwort in Richtung TH1 bewirkt, in der Lage ist, eine Filarieninfektion teilweise zu kontrollieren. Deshalb muß weiter nach geeigneten Applikationsformen und Vakzin-Carriern gesucht werden, die eine deutliche TH1 Antwort hervorrufen. Der Einsatz von Chitinase exprimierenden Salmonellen in diesem System könnte weitere entscheidende Hinweise auf die Wirkung und die Notwendigkeit von TH1-Antworten während einer Infektion geben. Ein weiterer denkbarer Ansatz könnte eine DNA-Vakzinierung (Lewis et al. 1999) oder die Gabe von Salmonellen als DNA-Vehikel sein. Diese Salmonellen tragen ein Plasmid, in dem die Fremd-DNA unter dem Einfluß eines eukaryotischen Promotors steht. Nach Invasion der Salmonellen in die Wirtszellen kommt es zu einer Produktion des Fremd-Proteins. Nach Prozessierung des Proteins und Präsentation der resultierenden Peptide kommt es zur Stimulation der Immunantwort und Ausprägung einer TH1-Antwort (Darji et al. 1997).

4.2.2. Untersuchungen im Mausmodell

Immunisierungsstudien mit geeigneten Impfstoffkandidaten zeigten, daß nicht nur das Antigen von entscheidender Bedeutung ist, sondern daß die Art des verwendeten Adjuvans, die Route und die Dosis der Immunisierung eine wichtige Rolle bei der Ausprägung der Immunantwort spielt (Comoy et al. 1998; Leclerc und Ronco 1998). Durch den Einsatz von geeigneten Adjuvantien ist es möglich, Immunantworten zu beeinflussen und in eine bestimmte TH-Richtung zu verschieben. In dieser Arbeit sollte deshalb nicht nur die Chitinase näher charakterisiert werden, sondern ein geeignetes Applikationsschema für dieses Protein entwickelt werden. Da im A. viteae-Meriones-Modell keine ausreichenden Immunreagentien zur Verfügung stehen, wurden diese Untersuchungen mit BALB/c-Mäusen durchgeführt. Es wurde das Co-Blockpolymer STP eingesetzt, das eine Polarisation der T-Helfer-Antworten in Richtung TH1 bewirken kann. Die Autoren Byars & Allison (1987) konnten zeigen, daß nach Gabe von Antigenen mit STP die zelluläre Reaktivität auf diese Antigene verstärkt werden konnte. Diese zelluläre Reaktivität wurde von starken Antikörperantworten begleitet.
Als zweites Adjuvans wurde Alum verwendet. Diese Substanz fördert die Antikörperantworten auf schwache Antigene, wobei die Subklassen IgG1 und IgG2b dominieren (Ada 1995). Außerdem konnte

die Chitinase als Fusionsprotein mit dem atoxischen, aber hochimmunogenen Tetanusfragment TetC in einen Salmonellen-Carrier kloniert werden. Die orale Gabe von Salmonellen hat den Vorteil, daß neben einer humoralen und zellulären Immunantwort zusätzlich eine generalisierte sekretorische Immunantwort sowohl gegen das Fremdantigen als auch gegen den Salmonellenvektor erfolgt. Die Salmonellen werden im intestinalen Lumen von M-Zellen aufgenommen und zu Antigen präsentierenden Zellen (APC, dendritische Zellen, Makrophagen) transferiert, wo sie von diesen phagozytiert werden (Curtis et al. 1994). Dabei wird die Aufnahme in Makrophagen von den Salmonellen induziert. In den Makrophagen verhindern sie die Verschmelzung mit dem Phagolysosomen und verzögern die Übersäuerung des Zell-Kompartiments (Jones 1996; Comoy et al. 1997). Es kommt zur Präsentation der Fremdantigene bzw. der resultierenden Peptide in Verbindung mit dem MHC-I und MHC-II-Komplex (Svenson et al. 1997). Zusätzlich aktivieren intrazelluläre Bakterien natürliche Killerzellen (NK), die INF- gamma

produzieren. Durch die Ausschüttung von INF- gamma

und die IL-12 Produktion von aktivierten Makrophagen wird die Ausprägung einer TH1-Antwort induziert (Abbas et al. 1997).
Der Einsatz der Adjuvantien in dieser Immunisierungsstudie zeigte, daß Chitinase ohne die Gabe eines zusätzlichen Adjuvans nicht in der Lage war, eine zelluläre Immunantwort in immunisierten Mäusen hervorzurufen. Unterstützt wurden diese Ergebnisse durch die Analyse der Antikörperantworten. Die Untersuchung der Antikörper-Subklassen zeigte, daß nur Antikörper der Subklasse IgG1 gebildet wurden. Erfolgte hingegen die Gabe von Chitinase in Kombination mit dem Adjuvans STP, konnte die zelluläre Immunantwort deutlich verstärkt werden. Auch in der Antikörperantwort dieser Tiere konnten Unterschiede gefunden werden. Während die Applikation der Chitinase mit STP Antikörper aller Subklassen hervorrief, konnten in Seren von Mäusen, die Chitinase mit Alum verabreicht bekamen, IgG- und IgG1-Antikörper detektiert werden. Die gefundenen Ergebnisse lassen den Einfluß des STP auf das verabreichte Protein deutlich werden. Die verbesserte zelluläre Reaktion, verbunden mit Antikörpern der Subklassen IgG2a und IgG2b, deuten auf die Ausprägung einer TH1-Antwort hin, wenn gleich auch der Einfluß der Chitinase nicht vollständig aufgehoben werden konnte, was durch die Anwesenheit von IgG1-Antikörpern deutlich wird.
Durch die orale Gabe von Salmonellen, die Chitinase exprimierten, konnte in der vorliegenden Arbeit die zelluläre Immunantwort gesteigert werden. Es wird beschrieben, daß das atoxische TetC-Fragment des Salmonellenvektors pTECH als starkes Adjuvans wirkt (Kahn et al. 1994). Antigen-spezifische Antikörper ließen sich im ELISA nicht nachweisen, obwohl die T-Zell-Antwort gegen Chitinase und der durchgeführte Salmonellen Nachweis in den Organen auf eine erfolgreiche Immunisierung schließen lassen. Weiterhin konnten nur geringe Antikörperantworten gegen Salmonellen-LPS detektiert werden. Einige Arbeiten über Immunisierungen mit Salmonellen bestätigen die Abwesenheit antigen-spezifischer Antikörper trotz vorhandener Protektion bei einer Belastungsinfektion (Strugnell et al. 1992). Die Autoren vermuteten, daß die Protektion der Versuchstiere auf eine rein zelluläre Immunantwort zurückzuführen ist. Dies könnte eine Erklärung für die gefundenen Ergebnisse sein. Das Fehlen der Antikörperantworten könnte auch in einem Verlust des Plasmids oder einer verringerten Expression der Chitinase liegen. Es ließen sich jedoch in allen Salmonellen, die aus Kot und den Organen isoliert wurden, Plasmide nachweisen. In parallel durchgeführten Versuchen mit einem anderen Filarienprotein (A. viteae-Tropomyosin) konnten ebenfalls Plasmide aus den Salmonellen isoliert und Expressionsversuche erfolgreich durchgeführt werden (Kranich, pers. Mitteilung), so daß ein Verlust oder eine verringerte Expressionsfähigkeit als Erklärung für die fehlenden Antikörperantworten ausgeschlossen werden kann. Einen entscheidenden Einfluß auf die Invasivität und Adhärenz haben die Kulturbedingungen der Salmonellen. Es konnte gezeigt werden, daß ein Verlust der Invasivität der Salmonellen mit dem Erreichen der stationären Wachstumsphase einherging. Außerdem konnte ein geringer Sauerstoffgehalt (0%-1%) während des Wachstums die Invasivität und die Adhärenz der Salmonellen deutlich erhöhen (Lee et al. 1990). Daher sollte bei weiteren Versuchen eine genaue Wachstumskurve des jeweiligen Salmonellenstammes erstellt und die Sauerstoffzufuhr stark reduziert werden, um diese Punkte als mögliche Fehlerquelle auszuschließen.
Vielfach konnte die Immunisierung mit Salmonellen sehr gute Erfolge erzielen (Mukkur et al. 1987, Kahn et al. 1994, Toebe et al. 1997, Catmul et al. 1999). Auch bei der Verwendung von Salmonellen im A. viteae-Meriones-Modell konnten erste Erfolge erzielt werden. So hatte bei einem Versuch die orale Gabe von Salmonellen, die die homologe L3 Chitinase von A. viteae exprimierten, eine signifikante Reduzierung der Wurmlast um 49% zur Folge (Adam et al., pers. Mitteilung). Leider erwies sich der verwendete Salmonellenstamm (pZoosal®) als nicht stabil, so daß diese Werte nicht reproduziert werden konnten. Optimierungsversuche sind notwendig, um die Invasivität und die Virulenz der Salmonellen zu verbessern und so durch den Einsatz von Salmonellen, die OvL3-Chitinase exprimieren, die protektive Wirkung der OvL3-Chitinase und die Polarisierung von Immunantworten durch Salmonellen zu überprüfen.
Zusätzlich sollte das Zytokinmuster auf mRNA-Ebene untersucht werden, um weitere Hinweise für die Ausprägung einer bestimmten Immunantwort zu bekommen. Dabei wurden zuerst Milzzellen von immunisierten Tieren untersucht, die 48 Stunden sowohl mit als auch ohne Antigen kultiviert wurden. Da bei der Gruppe 3 (Chitinase/STP) deutliche Unterschiede auf zellulärer und humoraler Ebene gefunden wurden, erfolgte zusätzlich die Untersuchung von Milzzellen, die 8h und 24h mit Chitinase stimuliert wurden. Nach Restimulation mit Chitinase konnte bei allen Gruppen die mRNA von IL-10 gefunden werden. Zusätzlich wurde ein schwaches Transkript von INF- gamma

bei Milzzellen, die von STP

immunisierten Mäusen stammten, nachgewiesen. Bei Mäusen, die Chitinase/Alum erhielten, konnten neben der mRNA von IL-10 Transkripte von IL-4 und INF- gamma

nachgewiesen werden.
Auffällig war die Präsenz aller Zytokine auf mRNA-Ebene bei Milzzellen, die ohne Antigen kultiviert wurden. Während die mRNA von INF- gamma

bei allen untersuchten Gruppen zu finden war, ließ sich IL-4 nur bei der Gruppe 1 (Chitinase), Gruppe 3 (Chitinase/STP), Gruppe 4 (STP) und Gruppe 5 (Chitinase/Alum) nachweisen. Auch die mRNA von Interleukin 10 konnte, mit Ausnahme von Gruppe 1 (Chitinase), bei allen Gruppen gefunden werden. Durch das Vorhanden sein fast aller untersuchten Zytokine in den Ansätzen, die ohne Antigen kultiviert wurden, lieferten die gefundenen Ergebnissen keine weiteren Hinweise auf die Ausprägung einer bestimmten Immunantwort. Deshalb wurde bei den Untersuchungen der früheren Zeitpunkte (8h und 24h) zusätzlich das Zytokin TNF- alpha

untersucht. Auch diese Ergebnisse konnten die gefundenen Unterschiede der zellulären und humoralen Immunantwort zwischen den immunisierten Gruppen nicht bestätigen. In allen Proben konnten starke Transkripte von TNF- alpha

gefunden werden. TNF- alpha

wird vorwiegend durch LPS-aktivierte Makrophagen, aber auch von antigen-aktivierten T-Zellen und NK-Zellen gebildet. Durch TNF- alpha

kommt es zur verstärkten Ausschüttung von proinflamatorischen Zytokinen, wie INF- gamma

, IL-1 und IL-6 (Abbas et al. 1997). Bei humanen PBMC konnte gezeigt werden, daß nach LPS-Stimulation und Ausschüttung von TNF- alpha

nach ca. 24 Stunden die Hochregulation von IL-10 auf mRNA-Ebene erfolgt (Platzer et al. 1995). Da die rekombinante Chitinase aus E. coli aufgereinigt wurde und LPS-Werte im pg-Bereich im Zellkulturmedium nachgewiesen werden konnten (Hartmann et al., pers. Mitteilung) könnten die starken Transkripte von TNF- alpha

und die Anwesenheit von IL-10 in allen Gruppen auf den Einfluß von LPS zurückzuführen sein.
Eine weitere Ursache für die Unterschiede zwischen der zellulären Immunantwort und den Ergebnissen der RT-PCR könnte im Versuchsaufbau begründet sein. Viele in der Literatur beschriebene Untersuchungen der Zytokine auf mRNA-Ebene wurden als ex vivo-Experimente durchgeführt. Dabei werden Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung getötet, Milzzellen isoliert und die mRNA analysiert (Klimpel et al. 1995; Comoy et al. 1997; Liu et al. 1999). Dabei wurde die mRNA zu sehr frühen Zeitpunkten untersucht (3h, 6h, 8h), um die tatsächlichen Verhältnisse im Tier nach Immunisierung zu ermitteln. Dem gegenüber stehen einige wenige Arbeiten, in denen Lymphknotenzellen in vitro stimuliert wurden (von 6 bis 72 Stunden). Während die Autoren in diesem Versuchsansatz eine gute Korrelation zwischen den Ergebnisse des Zytokin-ELISA und den Ergebnissen der mRNA-Untersuchungen finden konnten (Warbrick al. 1998), konnte aus den hier gefundenen Ergebnissen der mRNA-Untersuchung keine weiteren Rückschlüsse auf die Verhältnisse während des T-Zell-Tests gezogen werden. Da die RT-PCR eine hochsensible Methode darstellt, können auch geringe Mengen an DNA nachgewiesen werden. Dadurch werden auch Transkripte von

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Zytokinen erfaßt, die durch unspezifische Stimulation (wie durch LPS), durch in vitro-Kultivierung oder durch eine konstitutive Expression dieser Zytokine hervorgerufen werden (Klimpel et al. 1995). Zudem benötigt die RT-PCR durch viele voneinander abhängige Versuchsschritte sehr viel Erfahrung und optimale Versuchsbedingungen. Neuere Methode, wie intrazelluläre Zytokin-Messungen im FACS-scan (Tayebi et al. 1999), oder die Quantifizierung der Zytokine mit Hilfe spezifischer Fluoreszenz-markierter Sonden, die an das PCR-Produkt binden und über die Fluoreszenz Aussagen über die Stärke des PCR-Produktes geben (Taq-man®, Perkin-Elmer), stellen zuverlässigere Methoden zum Nachweis von Zytokinen dar.

4.3. Identifizierung von T-Zell-Epitopen innerhalb der OvL3-Chitinase

4.3.1. Beurteilung der verwendeten Algorithmen

Zur Identifizierung von T-Zell-Epitopen innerhalb von Proteinen wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen Algorithmen entwickelt, die auf Grund von Strukturmerkmalen oder von empirisch ermittelten AS-Abfolgen Bindungsvorhersagen von Peptiden an den MHC-Komplex treffen. Mit Hilfe dieser Algorithmen ist es möglich, schnell und effizient potentielle T-Zell-Epitope innerhalb von Proteinen zu detektieren (Rothbard und Taylor 1988, Reyes et al. 1991). In der Literatur sind eine Vielzahl von Algorithmen beschrieben, doch eine Studie über die Zuverlässigkeit dieser Vorhersagen wies auf eine geringe Spezifität und Sensitivität vieler getesteter Algorithmen hin. In der Untersuchung von Deavin et al. (1996) zeigte sich, daß die Vorhersage von Rothbard und Taylor (1988) die einzige zuverlässige und exakte Vorhersage im Mausmodell ist. Im Humansystem lieferte der Algorithmus von Stille (1987) zuverlässige Vorhersagen. Auf Grund dieser Resultate wurden in dieser Arbeit diese beiden Algorithmen ausgewählt und auf die OvL3-Chitinase angewendet. Zusätzlich lieferte die Vorhersage der MHC-II-Bindungs-Motive aus der Arbeitsgruppe Rammensee (Universität Tübingen) weitere Informationen über mögliche T-Zell-Epitope innerhalb der Chitinase.
Bei diesem Ansatz sollten nicht nur T-Zell-Epitope innerhalb der Chitinase detektiert werden, sondern gleichzeitig die Algorithmen auf Zuverlässigkeit und Genauigkeit geprüft werden. Aus diesen Daten sollten Rückschlüsse gezogen werden, ob durch einzelne Algorithmen oder die Kombination von Algorithmen zuverlässig T-Zell-Epitope innerhalb von großen Datenbanken identifiziert werden können. Die vorhergesagten Epitope wurden als synthetische Peptide hergestellt und in Proliferationsassays auf ihre Fähigkeit getestet, Milzzellen von immunisierten Mäusen zur

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Proliferation anzuregen. Zusätzlich gewährleisteten überlappende Peptide, die die Gesamtheit des Proteins umfaßten, daß eine möglichst große Anzahl von T-Zell-Epitopen detektiert wurde.
Durch den Einsatz dieser überlappenden Peptide konnten 14 T-Zell-Epitope innerhalb des Proteins ermittelt werden. Die Vorhersage von Rothbard und Taylor ermittelte 24 vermutliche T-Zell-Epitope, von denen acht mit den 14 tatsächlichen T-Zell-Epitopen übereinstimmten. Durch die hohe Anzahl der vorhergesagten Epitope konnte dieser Algorithmus eine hohe Sensitivität erzielen (0,54), doch die vielen falsch positiven Vorhersagen senkten die Spezifität auf 0,33. Ähnliche Ergebnisse konnten Reyes et al. 1990 finden, als sie den Algorithmus von Rothbard und Taylor auf verschiedene Antigene anwandten und mit bekannten Epitopen innerhalb der Proteine verglichen. In diesen Untersuchungen erzielte die Rothbard und Taylor-Vorhersage einen Index von 0,4 bei Sensitivität und Spezifität. Im Gegensatz dazu standen die Ergebnisse von Deavin et al. 1996, die bei einem Vergleich verschiedener Algorithmen darlegten, daß die Vorhersage von Rothbard und Taylor die einzige war, die murine T-Zell-Epitope mit Signifikanz vorhersagte.
Der Algorithmus von Humphreys basiert auf der Vorhersage nach Stille (1987), die amphiphatische Abschnitte innerhalb des Proteins identifiziert. Von den 13 vorhergesagten Epitopen zeigten jedoch nur 4 korrespondierende Pepscan-Peptide Reaktionen in Proliferationsassays. Damit konnte dieser Algorithmus nur eine Spezifität von 0,3 und Sensitivität von 0,28 erzielen. Bei der vergleichenden Studie von Deavin (1996) konnten ähnliche Ergebnisse im Mausmodell gefunden werden. Hier lag der Index für Spezifität bei 0,38 und der für Sensitivität bei 0,08. Im Humansystem konnten diese Werte verbessert werden. Die Spezifität lag bei 0,43, während die Sensitivität 0,1 erzielte. Dem gegenüber stehen Untersuchungen von Reyes (1990), die diesen Algorithmus mit einer Spezifität von 0,47 und einer Sensitivität von 0,57 auswiesen.
Von den vorhergesagten MHC-II-Bindung-Motive von Rammensee für den genetischen Hintergrund H2-Ed der BALB/c- Mäuse konnten sieben der zehn vorhergesagten T-Zell-Epitope durch die Reaktion der Pepscan-Peptide bestätigt werden. Dies drückte sich durch eine hohe Spezifität (0,7) und hohe Sensitivität (0,47) aus. Bei einer kombinierten Anwendung aller Algorithmen konnte die Sensitivität auf 0,67 erhöht werden. Doch durch die große Anzahl der vorhergesagten T-Zell-Epitope sank die Spezifität auf 0,21. Bei der Verwendung zweier Algorithmen zeigte die Kombination der Rammensee- und der Rothbard und Taylor-Vorhersage die besten Werte. Die Sensitivität blieb mit 0,67 gleich hoch wie bei der Kombination aller Algorithmen, während sich die Spezifität von 0,21 auf 0,33 erhöhte. Der zusätzliche Einsatz des Humphreys-Algorithmus ergab keine Hinweise auf neue Epitope, sondern verringerte die Spezifität durch die gestiegene Anzahl der vorhergesagten Epitope.

Ursache für die unterschiedlichen Ergebnisse der Vorhersagen könnten in den verschiedenen Grundlagen der einzelnen Algorithmen liegen. Während sich die Vorhersage von Rothbard und Taylor

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und der Algorithmus von Humphreys auf sekundäre Strukturen oder Sequenz-Charakteristika stützen, wurden die MHC-Bindung-Motive von endogen prozessierten Protein-Antigenen bzw. die Präsentation der resultierenden Peptide durch den MHC-II-Komplex ermittelt. Von einigen Arbeitsgruppen (Takahashi et al. 1989, Berzofski et al. 1991) wurde diskutiert, daß die natürliche Prozessierung von Antigenen der essentielle Schritt bei der Generation von T-Zell-Epitopen darstellt. Die Prozessierung von Antigenen geschieht in Endosomen/Lysosomen von APC, wo Cathepsin B als Protease wirkt. Die Inhibition des Cathepsin B führte zum Verlust von Epitopen, die nach natürlicher Prozessierung bei dem Modell-Antigen Myoglobin entstanden. Auf Grund dieser Ergebnisse schlossen die Autoren, daß Cathepsin B notwendig und ausreichend für die Generation und Präsentation von Peptiden ist. Die Rammensee-Vorhersage wurde auf der Basis von natürlich prozessierten Antigenen erstellt. Damit wurden auch tatsächliche Schnittstellen von Proteasen berücksichtigt, so daß dies ein Grund für die guten Resultate der Rammensee-Vorhersage sein könnte. Der Nachteil dieser Vorhersage besteht in der Restriktion durch den MHC-Haplotyp. Jede Vorhersage muß gesondert für den jeweiligen MHC-II-Haplotyp erfolgen. Deshalb ist die Identifikation von sogenannten promiskuitiven Epitopen, die von einem breiten Spektrum von MHC-Haplotypen erkannt werden, wichtig. Derzeit gibt es noch keinen Algorithmus, der eine Erkennung der Epitope in großen Populationen gewährleistet, so daß die Prüfung von ermittelten Epitopen in großen Populationen von Individuen erforderlich ist. Eine weitere Schwierigkeit besteht in der eingeschränkten Übertragbarkeit der gefundenen Ergebnisse vom Maussystem auf das Humansystem. Die theoretischen Vorhersagen von MHC-Bindungs-Motiven innerhalb der OvL3-Chitinase für den genetischen Hintergrund von zwei verschiedenen Maus- und drei verschiedenen humanen MHC-Haplotypen zeigten deutliche Unterschiede in der Lokalisation von potentiellen T-Zell-Epitopen.
Das schlechte Abschneiden der Humphreys-Vorhersage könnte in der Anwendung der Vorhersage im Maussystem begründet sein. Die vergleichenden Studien von Deavin wiesen den Algorithmus von Stille als einen sehr effizienten Algorithmus im Humansystem aus. Die Modifikation dieses Algorithmus erfolgte durch den Mit-Autor der Stille-Publikation Humphreys, der die Anwendbarkeit des Algorithmus auf das Maussystem zusicherte. Auf Grund der erzielten Ergebnisse dieser Arbeit scheint eine Überarbeitung dieses Algorithmus für die erfolgreiche Anwendung in Maussystem notwendig.
In dieser Arbeit konnte deutlich gemacht werden, daß die Identifizierung und Charakterisierung von T-Zell-Epitopen durch die Anwendung von verschiedenen Algorithmen innerhalb der OvL3-Chitinase erfolgen konnte. Dabei zeigte sich, daß sich durch eine kombinierte Anwendung des Algorithmus von Rothbard und Taylor und Rammensee die Anzahl der zu synthetisierenden Peptide von 122 Stück (Pepscan) auf 30 Peptide senken läßt. Durch die 30 vorhergesagten T-Zell-Epitope konnten 71% der

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im Pepscan gefundenen T-Zell-Epitope detektiert werden. Durch den Einsatz dieser synthetischen Peptide in Proliferationstests konnte eine Lokalisation der T-Zell-Epitope erfolgen. Zudem könnten diejenigen T-Zell-Epitope ausgewählt werden, die eine starke T-Zell-Reaktivität aufweisen und für die Entwicklung einer Vakzine verwendet werden.
Steht nicht so sehr die Identifikation und Charakterisierung immundominanter Bereiche eines einzelnen Proteins im Vordergrund, sondern die Anwendung der Algorithmen auf große Datenbanken, liefert die Kombination der Algorithmen von Rothbard und Taylor und von Rammensee ebenfalls zuverlässige Ergebnisse. Sollen innerhalb von Proteinen schnell und effizient T-Zell-Epitope identifiziert werden, können durch die kombinierte Anwendung der beiden Algorithmen diejenigen Epitope ausgewählt werden, die von beiden Algorithmen vorhergesagt werden. Dadurch kann die Anzahl der Peptide auf 7 reduziert werden, von denen 6 durch korrespondierende Pepscan-Peptide als reaktive T-Zell-Epitope bestätigt werden konnten.
Die Anwendungen beider Algorithmen auf weitere Antigene werden darüber Aufschluß gegeben, ob ähnliche Ergebnisse erzielt werden können.

4.3.2. T-Zell-Reaktivität der vorhergesagten Epitopen

Die vorhergesagten T-Zell-Epitope wurden in Form von synthetischen Peptiden hergestellt und in Proliferationsassays mit Milzzellen immunisierter Mäuse getestet. Während die Pepscan-Peptide als 16mere hergestellt wurden, wurden die Rammensee-Peptide mit einer Länge von 15 AS synthetisiert. Auch die vorhergesagten Epitope von Rothbard und Taylor wurden bis auf 3 Ausnahmen als 15mere hergestellt. Die Humphreys-Peptide wurden gemäß der Vorhersage synthetisiert und umfaßten 13 Aminosäuren. Es wurden BALB/c-Mäuse mit rekombinanter Chitinase in Kombination mit STP immunisiert und die isolierten Milzzellen mit den synthetischen Peptiden restimuliert.
Insgesamt waren die Proliferationswerte sehr niedrig, dennoch konnten reproduzierbare Aussagen über einzelne stimulierende Bereiche getroffen werden. Ähnlich geringe Proliferationswerte konnten auch in anderen Studien nach Stimulation mit Peptiden gefunden werden (Raulf-Heimsoth et al. 1998). Zusätzlich zeigt die #OvL3-Chitinase nur schwache Immunogentität. So konnten Milzzellen von Mäusen, die nur mit rekombinanter Chitinase ohne Adjuvans immunisiert wurden, nicht auf Restimulierung mit diesem Protein reagieren. Auch nach Immunisierung mit Chitinase und STP konnten nur Proliferationswerte bis 3000cpm gemessen werden.
Eine weitere Schwierigkeit trat während der Versuchsdurchführung auf. Bei Wiederholungen der Tests kam es zu immer schlechteren Proliferationswerten und nicht reproduzierbaren Ergebnissen. Erst die Analyse von Peptiden durch HPLC, die mehrfach aufgetaut und wieder eingefroren wurden und der

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Vergleich verschiedener Mikrotiterplatten konnte zeigen, daß es zur Degradation der Peptide und zur Adsorption der synthetischen Peptide an die Mikrotiterplatten kam. Das Aliquotieren der Peptide in Mikrotiterplatten, die dann jeweils für den entsprechenden Test aufgetaut und benutzt wurden, führte zu vergleichbaren Ergebnissen.
Vergleichende Studien über die Identifizierung von T-Zell-Epitopen arbeiteten überwiegend mit T-Zell-Linien. Durch die Verwendung von spezifischen T-Zell-Linien kommt es zu erhöhten Kontakt zwischen präsentiertem Peptid und T-Zell-Rezeptor, so daß eine starke Immunantwort die Folge ist. Deshalb können bei der Verwendung von T-Zell-Linien höhere Proliferationswerte (>14000cpm) erzielt werden (Amante et al. 1997). Eine andere Möglichkeit zur Verbesserung der T-Zell-Reaktivität ist die Verwendung von Lymphknoten immunisierter Tiere. Antigene werden zuerst in die nächstgelegenen Lymphknoten transportiert, wo sie durch dendritische Zellen und Makrophagen aufgenommen und prozessiert werden (Abbas et al. 1997). Deshalb führt der Einsatz von Lymphknoten durch die erhöhte Anzahl von Antigen präsentierenden Zellen zu verstärkten T-Zell-Antworten (> 23 000cpm; Kutubuddin et al. 1991).
Beide Versuchsansätze wurden in dieser Studie nicht verfolgt, obwohl sie zur Verbesserung und damit zu klareren Ergebnissen geführt hätten. In dieser Arbeit sollte die Verwendung von T-Zell-Algorithmen auf große Datenbanken überprüft werden. Das Ziel sollte die schnelle, effektive und kostengünstige Identifizierung von T-Zell-Epitopen sein, die sich in einfach durchzuführenden Systemen verifizieren lassen. Dafür schien der Einsatz von Milzzellen immunisierter Tiere geeignet, da die Generation von T-Zell-Linien für eine große Anzahl von Peptiden nicht durchführbar wäre. Zudem gewährleistete die Verwendung von Milzzellen im Gegensatz zu Lymphknotenzellen eine genügend hohe Zellzahl für den Einsatz vieler Peptide. Ob der Einsatz von Milzzellen zu zuverlässigen Ergebnissen führt, werden weitere Studien mit anderen Antigenen zeigen.
Auffällig waren unterschiedliche Reaktionen korrespondierender Peptide im Proliferations- bzw. im Pepscanassay. Der Bereich 79-81 zeigte diese Unterschiede besonders deutlich. In allen Peptiden war das vorhergesagte Rothbard und Taylor-Motiv KYLYKE enthalten, trotzdem reagierten die Peptide sehr unterschiedlich. Gute Resultate zeigte das Pepscan-Peptid 78 und das Rothbard-Peptid 79-81. Beide enthielten C-terminal neben dem vorhergesagten Motiv noch die Aminosäuren GKETI. Offensichtlich sind diese AS für eine Interaktion zwischen MHC-II-Peptid-Komplex und dem TCR notwendig. Die Arbeitsgruppe von Mougil et al. (1998) konnte zeigen, daß eine Reihe von Faktoren bei der Interaktion zwischen Peptid, MHC-Komplex und TCR eine Rolle spielen. Ein wesentlicher Einfluß auf das Bindungsverhalten und damit auch auf die T-Zell-Antworten haben flankierende Bereiche um die antigene Kern-Determinante. Durch den Austausch einer AS kann es zu veränderten Bindungsaffinitäten zum MHC-Komplex kommen. Durch konkurrierendes Bindungsverhalten

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einzelner AS zum MHC-Komplex kann die Immunantwort beeinflußt und verändert werden. Zudem ermöglichen unterschiedliche flankierende Bereiche den Zugang unterschiedlicher Peptidasen. Damit erfolgt die Präsentation unterschiedlicher Peptide, die wiederum unterschiedliche T-Zell-Antworten hervorrufen. Ein weiterer Faktor ist die Konzentration der eingesetzten Peptide. Untersuchungen an MHC-Klasse-I-Peptid-Komplexen ergaben, daß dominante Peptide schon in geringen Konzentrationen zu einer T-Zell-Antwort führten. Bei subdominanten Epitopen war eine deutlich höhere Konzentration notwendig, um eine Stimulation bei T-Zellen hervorzurufen (Busch und Pamer 1998). Zusätzlich hat die Konzentration der Peptide einen großen Einfluß auf die Ausprägung der T-Helfer-Antwort (Murray 1998). In der vorliegenden Arbeit wurden die Peptide mit einer Konzentration von 10µg/Vertiefung in die Proliferationstests eingesetzt. Dieser Wert wurde aus Literaturangaben übernommen, und es erfolgte keine Titration zur Bestimmung der optimalen Konzentration der Peptide. Dies lag zum einem an der großen Anzahl der zu testenden Peptide, zum andern sollte die Vergleichbarkeit der Peptide in den einzelnen Tests gewährleistet sein. Trotz dieser Schwierigkeiten konnten fünf Bereiche gefunden werden, die von allen Algorithmen vorhergesagt und in T-Zell-Tests bestätigt werden konnten.
Obwohl Immunisierungen mit Peptiden mehrfach erfolgreich angewendet wurden (Takita-Sonoda et al. 1996), besitzen Peptide oft nur schwache Immunogenität (Auriault et al. 1988). Eine Methode zur Verbesserung des immunogenen Charakters ist die Kopplung der Peptide an Carrier-Moleküle. Hierfür eignen sich das Tetanus-Toxoid oder Ovalbumin (Auriault et al. 1988) oder die Inseration von Peptiden in Immunglobuline (Brumeanu et al. 1995). Eine andere Möglichkeit, die Immunogenität der Peptide zu erhöhen, ist die Herstellung von Konstrukten, bei denen verschiedene T-Zell-Epitope oder einzelne T-Zell-Epitope mehrfach aneinander gehängt werden (de Olivera et al. 1993, Godard et al. 1994, Kahn et al. 1994). Diese Strategie konnte erfolgreich bei der Schistosomiasis und der Toxoplasmose angewendet werden (Darcy et al. 1992, Wolowczuk et al. 1991, Godard et al. 1994), so daß eine dieser Möglichkeiten für den Einsatz der fünf Peptide im A.viteae-Meriones-Modell ausprobiert werden sollte.

4.4. Einsatz der rekombinanten Proteine und Peptide in Feldstudien in Kamerun

In einem hyperendemischen Onchozerkosegebiet in Kamerun sollte die humorale und zelluläre Reaktivität von Onchozerkose-Patienten gegen die rekombinante Chitinase, die Chitin-Binde-Domäne getestet werden. Zusätzlich wurden Peptide der Chitinase in T-Zell-Proliferationtests eingesetzt.
Es erfolgte eine gründliche Anamese der Patienten. Durch Hautbiopsien und Beurteilung der

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Krankheitssymtome wurde die Schwere der Erkrankung ermittelt, jedoch erfolgte keine Einteilung in generalisierte und lokalisierte Onchozerkose oder in vermeintlich Immune (PI). Die Mikrofilarienlast der Patienten lag bei durchschnittlich 26 Mf/mg, so daß unter Berücksichtigung der anderen Parameter bei den meisten Patienten auf eine generalisierte Onchozerkose geschlossen werden konnte. Dies spiegelte sich auch in der Immunantwort der Patienten wieder. Während die T-Zell-Reaktivität gegen Mitogen unbeeinflußt blieb, wurde die ausgeprägte Hyporeaktivität dieser Patienten durch Stimulation mit dem Gesamtextrakt von O. volvulus-Würmern (OvAg) sichtbar. Erst der Einsatz hoher Konzentrationen erzielte meßbare Stimulationswerte. Auch die Restimulation mit 18 parallel untersuchten rekombinanten A. viteae- und O. volvulus-Antigenen erwies sich als schwierig. Diese ausgeprägte Hyporeaktivität ist bei Patienten mit generalisierter Onchozerkose vielfach beschrieben worden (Nutman et al. 1987; Bradley et al. 1995). Dennoch konnte die T-Zell-Reaktivität gegen einige rekombinante Proteine bei Onchozerkose-Patienten erfolgreich getestet werden, wenngleich auch in diesen Arbeiten die T-Zell Reaktivität gegen die rekombinanten Proteine schwach ausfiel (Arasu et al. 1989; Seeber et al. 1993). In unser Studie reagierten nur vereinzelt Patienten nach Stimulation mit Chitinase, CBD oder Chitinase-Peptiden. Die Arbeiten dieser Studie haben gezeigt, daß die Chitinase unter den getesteten Bedingungen eine TH2-Immunantwort induziert. Selbst BALB/c-Mäuse, die keiner generalisierten Hyporeaktivität unterliegen, waren nach Immunisierung mit Chitinase nicht in der Lage, auf eine Restimulation mit Chitinase mit Proliferation zu reagieren. Warum jedoch einige Patienten in der Lage waren, auf diese Antigene zu reagieren, konnte nicht geklärt werden. Keiner der untersuchten Parameter (Mf-Last, IgG-Subklassen, Alter) korrelierte mit den gefundenen Ergebnissen aus den T-Zell-Proliferationstests. Eine mögliche Ursache könnte in einem geeigneten MHC-Klasse-II-Haplotyp dieser Patienten liegen (Meyer et al. 1994). Eine weitere Erklärung könnte die Tatsache sein, daß diese Patienten nicht einer generellen Hyporeaktivität unterliegen, sondern daß ihre zelluläre Reaktivität durch bestimmte Faktoren (z.B. die Einnahme von Ivermectin) verbessert wurde. Untersuchungen in einem Patientenkollektiv, bei dem die Einteilung in die verschiedenen Krankheitsbilder erfolgt wäre, hätte die Einordnung der gefundenen Ergebnisse erleichtert.

Während bei allen untersuchten Patienten IgG-Antikörper gegen OvAg im Serum nachgewiesen werden konnten, enthielten 61% der Patienten IgG-Antikörper im Serum gegen die Chitinase bzw. 43% gegen die OvL3-CBD. Bei einem höheren Prozentsatz von Patienten konnten alpha -Chitinase-IgG4-spezifische Antikörper im Serum gefunden werden. Diese Differenzen lassen sich auf eine unterschiedliche Sensitivität im ELISA zurückführen, die durch die jeweilige Konjugatverdünnung bedingt wird. Die Antikörperantwort gegen die OvL3-CBD zeigte einen erhöhten Anteil an IgG3-Antikörpern. Mit Hilfe des Algorithmus von Kolaskar (1990) konnten auf dieser Domäne sehr viele

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potentielle B-Zell-Epitope lokalisiert werden (Daten nicht gezeigt). Offensichtlich scheint die OvL3-CBD eine wichtige Rolle bei der Ausprägung von TH1-Immunantworten zu spielen.
Der hohe Anteil an Chitinase-spezifischen Antikörpern in diesem Patientenkollektiv steht dem Befunde von Freedman et al. (1989) gegenüber. Diese Arbeitsgruppe konnte nur bei putativ Immunen Antikörper gegen Chitinase nachweisen. Eine mögliche Erklärung könnte die Behandlung mit Ivermectin sein. Ivermectin wirkt, ähnlich wie Dethylcarbamazine (DEC), mikrofilarizid. Durch die Behandlung mit DEC kommt es zur Erhöhung von Eosinophilen (Francis et al. 1985). Zusätzlich kann drei Tage nach Behandlung ein kurzfristiger Anstieg von Phosphorylcholin beobachtet werden, dem, nach Abfall der Phosphorylcholinkonzentration, ein Anstieg von anti-Phosphorylcholin-Antikörpern (IgM und IgG) folgt (Lal et al. 1989). Erst kürzlich haben Untersuchungen gezeigt, daß das sekretierte Antigen ES-62 von adulten A. viteae aus Phosphorylcholin-Molekülen besteht, die mit N-Acetyl-Glucosamin-Molekülen, den Bausteinen der Chitinase, verknüpft sind. Phosphorylcholin-Epitope konnten aber nicht nur bei Adulten, sondern auch bei mf von Brugia malayi nachgewiesen werden (Wenger et al. 1988). Eine Abtötung der Mikrofilarien könnte eine Freisetzung von Phosphorylcholin und damit auch Acetyl-Glucosamin bewirken, auf die der Wirtsorganismus mit der Produktion von Antikörpern reagieren könnte.
Die Untersuchung der Zytokine von T-Zellen der Patienten unterstützten die Befunde der Proliferationstests. Sowohl nach Stimulation mit Chitinase als auch mit OvL3-CBD reagierten PBMC von Onchozerkose-Patienten mit der Ausschüttung von TH2-Zytokinen. Während nach Stimulation mit Chitinase nur eine vermehrte Ausschüttung von IL-10 zu beobachten war, konnte nach Stimulation mit OvL3-CBD neben IL-10 auch IL-4 und INF- gamma

nachgewiesen werden. Obwohl die gemessenen INF- gamma

-Werte in einem Bereich liegen, der in der Literatur für Antigene beschrieben wird, die eine TH2-Antwort induzieren (McHugh et al. 1996), konnte eine leicht verstärkte Reaktivität auf zellulärer und humoraler Ebene nach Stimulation mit OvCBD gefunden werden. PBMC von 7 Patienten generierten Stimulationindizes von

2 nach Stimulation mit OvL3-CBD. Außerdem konnte ein erhöhter Anteil von alpha

-CBD-IgG3-Antikörpern in den Seren der Patienten gefunden werden. Diese Domäne scheint wichtige Komponenten zu besitzen, die für die Ausprägung einer TH1-Antwort wichtig sind. Weitere Untersuchungen im A. viteae-Meriones-Modell mit TH1-induzierenden Adjuvantien werden wichtige Hinweise auf das protektive Potential dieser Domäne geben.
Die im Humansystem gefundenen Ergebnisse unterstützen die Befunde aus den Immunisierungsstudien in BALB/c-Mäusen. Die OvL3-Chitinase scheint unter den getesteten Bedingungen eine TH2-Antwort auszulösen, die durch geringe T-Zell-Reaktivität und von IgG1-Antikörpern bei der Maus begleitet ist. Die Chitinase tritt an essentiellen Punkten des Filarienzyklus auf, während des Eischlupfes und der Häutung von L3 zu L4. Diese sensiblen Punkte im

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Entwicklungszyklus des Parasiten bilden Angriffspunkte der Immunantwort, so daß eine TH2-Antwort für das Überleben der Würmer wichtig ist. Durch die Induktion von TH2-Zytokinen entzieht sich der Wurm der Immunantwort. Eine TH1-Antwort auf die Chitinase würde eine starke T-Zell-Reaktivität, eine hohe INF- gamma

-Produktion und damit proinflammatorische Reaktionen hervorrufen. Zusätzlich würden die induzierten IgG3-Antiköper für die Aktivierung von Komplement sorgen, was zur Rekrutierung von Eosinophilen und zur antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität führt. Mit dieser Immunantwort könnte es zu einer Abtötung der L3 kommen, so daß der Entwicklungszyklus unterbrochen wäre.
Die Chitinase ist nach wie vor einer der vielversprechendsten Impfstoffkandidaten. Weitere Versuche mit geeigneten Adjuvantien, die eine starke TH1-Antwort hervorrufen, sind notwendig, um die gefundenen Ergebnisse zu bestätigen. Eine Möglichkeit wäre die Immunisierung mit DNA, die in vielen Studien erfolgreich eingesetzt werden konnte (Lewis et al. 1999). Eignen würde sich ebenso die Verwendung von Salmonellen, die Fremdproteine exprimieren (Kahn et al. 1994) oder die als Vehikel für eine DNA-Vakzinierung benutzt werden (Darji et al. 1997). Durch den Einsatz von eukaryotisch exprimierten Protein in Immunisierungsstudien könnte geprüft werden, ob posttranslationale Modifikationen Einfluß auf das protektive Potential der Chitinase haben. Die ideale rekombinante Subvakzine sollte sicher, billig, Hitze-stabil, leicht zu verabreichen sein und mit einer einzigen Dosis eine lange andauernde Immunität erzeugen (Liljeqvist et al. 1999). Dazu eignet sich besonders die Verwendung von synthetischen Peptiden, die aus T- und B-Zell-Epitopen bestehen. Die hier gefundenen T-Zell-Epitope könnten mit vorhergesagten B-Zell-Epitopen verknüpft werden und in Immunisierungsstudien eingesetzt werden.

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Tue Jun 13 12:06:57 2000