Drabner, Birgit: Charakterisierung und Identifizierung von immundominanten Bereichen der L3-Chitinase von Onchocerca volvulus
Charakterisierung und Identifizierung von
immundominanten Bereichen der L3-Chitinase
von Onchocerca volvulus
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie

eingereicht an der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Dipl.-Biol. Birgit Drabner

,
05.08.1969 in Kiel

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin

Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

Prof. Dr. J. Rabe

Gutachter:
Gutachter: 1. Prof. Lucius
2.Prof. Schmidt
3. Prof. Schneider-Mergener

Abgabe der Promotion: 04.01.2000

Datum der Promotion: 08.05.2000

Zusammenfassung

Da Filarieninfektionen noch immer chemotherapeutisch schwer bekämpfbar sind, ist die Aufklärung von potentiell protektiven Molekülen, die zur Impfstoffentwicklung von Nutzen sein könnten, von Bedeutung. Ein vielversprechendes Antigen stellt in diesem Zusammenhang die Chitinase von infektiösen Drittlarven von Onchocerca volvulus dar. In dieser Arbeit sollte deshalb dieses Protein immunologisch charakterisiert und immundominante Bereiche identifiziert werden. Dazu wurde die cDNA des gesamten Proteins (OvL3-Chitinase) und die cDNA der Domäne, die für die Chitin-Bindung verantwortlich ist (OvL3-CBD), in einen Expressionsvektor kloniert, in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Die aufgereinigte OvL3-Chitinase zeigte enzymatische Aktivität. Die OvL3-Chitinase und die OvL3-CBD wurden in Immunisierungsstudien im Tiermodel der Nagetierfilarie A. viteae und M. unguiculatus eingesetzt. Während die Immunisierung mit OvL3-CBD mit dem Adjuvans Alum zu keiner Reduzierung der Adultwurmlast führte, war nach Gabe der OvL3-Chitinase die Anzahl der Adultwürmer um 40 % bzw. um 17,7% reduziert.
Zusätzlich wurde die OvL3-Chitinase allein und in Kombination mit zwei verschiedenen Adjuvantien (STP und Alum) in Immunisierungsstudien von BALB/c-Mäusen eingesetzt, deren Immunantworten anschließend charakterisiert wurden. Durch diese Versuche konnte gezeigt werden, daß die Chitinase ohne zusätzliche Gabe eines Adjuvans unter den getesteten Bedingungen eine TH2-Immunantwort induziert. Dies wurde durch die Anwesenheit von Antikörpern der Subklasse IgG1 deutlich. Außerdem waren Milzzellen dieser Mäuse nicht in der Lage, nach Restimulation mit Chitinase mit Proliferation zu reagieren. Durch den Einsatz der Adjuvantien STP und Alum konnte eine Polarisation der Immunantworten erfolgen. Während die Immunisierung mit Chitinase und Alum zur deutlichen Bildung von IgG1-Antikörpern und zu einer leichten Erhöhung der Antikörper IgG2a und IgG2b führte, konnte nach Immunisierung mit Chitinase und STP neben Antikörpern der Subklasse IgG1 deutliche erhöhte OD-Werte von IgG2a und IgG2b gemessen werden. In beiden Gruppen reagierten Milzzellen nach Restimulation mit Chitinase, wobei die Proliferationswerte der STP/Chitinase-Gruppe über denen der Alum/Chitinase-Gruppe lagen.
Durch den Einsatz von Salmonellen, die Chitinase exprimierten, konnten die T-Zell-Antworten verstärkt werden. Es konnten jedoch keine antigen-spezifischen Antikörper gefunden werden. Mit Hilfe von drei verschiedenen T-Zell-Algorithmen (Algorithmus nach Rothbard und Taylor, nach Humphreys und die MHC-II-Bindungs-Motive nach Rammensee) wurden T-Zell-Epitope innerhalb der OvL3-Chitinase identifiziert. Alle vorhergesagten Epitope wurden als synthetische Peptide hergestellt und in T-Zell-Proliferationstests eingesetzt. Hierzu wurden Milzzellen von Mäusen verwendet, die dreimal mit rekombinanter Chitinase und dem Adjuvans STP immunisiert worden waren. Um möglichst viele T-Zell-Epitope innerhalb der Chitinase zu ermitteln, wurden überlappende Peptide (Pepscan), die die Gesamtheit der Chitinase umfaßten, in T-Zell-Tests eingesetzt. Die verwendeten Algorithmen wurde auf ihre Sensitivität und Spezifität überprüft, indem die vorhergesagten Epitope mit den ermittelten T-Zell-Epitopen des Pepscans verglichen wurden. Dabei konnte der Algorithmus von Rammensee den besten Index an Sensitivität (0,47) und Spezifität (0,7) erzielen. Eine Kombination der Algorithmen ergab, daß die Verknüpfung des Algorithmus nach Rothbard und Taylor mit den MHC-Bindungs-Motiven nach Rammensee die Sensitivität auf 0,67 erhöhen konnte, doch die Spezifität sank durch die hohe Anzahl der vorhergesagten Epitope auf 0,33. Die Anwendung der Algorithmen auf die Sequenz der OvL3-Chitinase führte zu der Identifizierung von fünf Bereichen, die von allen Algorithmen vorhergesagt wurden, und von denen vier in T-Zell-Proliferationstests deutliche Proliferationswerte erzielten.
Zusätzlich wurde die OvL3-Chitinase und die OvL3-CBD in Kamerun hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, PBMC von Onchozerkose-Patienten zu restimulieren, die aus einem hyperendemischen Onchozerkose-Gebiet stammten. Diese Untersuchungen bestätigten die Ergebnisse aus den Immunisierungsstudien mit BALB/c-Mäusen, in denen Chitinase eine TH2-Immunantwort hervorrief. Die PBMC der Onchozerkose-Patienten zeigten nur eine sehr geringe Proliferation nach Stimulation mit OvL3-Chitinase und OvL3-CBD. Begleitet wurde diese Proliferation von Ausschüttung typischer TH2-Zytokine wie IL-10 (Chitinase) bzw. IL-4, IL-5 und IL-10 (CBD). Die Untersuchung der Antikörperantworten der Onchozerkose-Patienten zeigte, daß bei 77% der untersuchten Patienten IgG4-Antikörper gegen die Chitinase und bei 20% gegen die OvL3-CBD im Serum nachgewiesen werden konnten.

Schlagwörter:
Chitinase, Filarien, T-Zell-Epitope, Adjuvantien

Abstract

Chemotherapeutic treatment of filarial infections has rendered difficult and still insufficient. Therefore, the identification of potentially protective molecules which can be used for vaccine development is desirable. The chitinase of larvae stage three of Onchocerca volvulus constitutes a promising antigen. Immunological characterization of this protein and the identification of immunodominat regions was performed in this study. The complete sequence (OvL3-chitinase) and the C-terminal end responsible for the binding of chitin (OvL3-CBD) were cloned in an expression vector, overexpressed in E. coli and subsequently purified. Recombinant chitinase was enzymatically active. The OvL3-chitinase and the OvL3-CBD were used for immunization studies using the rodent filaria A. viteae in the animal model M. unguiculatus. No decreased number of adult worms was observed after immunization with OvL3-CBD in the present of Alum as adjuvans, while chitinase together with STP resulted in the reduction the worm burden to 40 % (first trial) and to 17,7 % (second trial).
Additional immunization studies using BALB/c-mice were performed with OvL3-chitinase in the absence or the presence of two different adjuvans. Spleen cells isolated from mice immunized with chitinase in the absence of adjuvans were devoid of proliferative capacity after in vitro antigenic restimulation. Antigen-specific IgG1 antibodies were the only subtype detectable in sera from mice. These results suggested that a Th2 response was induced after immunization with chitinase under these conditions. Including STP or Alum in the immunization protocol a polarization of the obtained immune response was found. Immunization with chitinase together with Alum elicited strong IgG1 response followed by slightly increase of IgG2a and IgG2b. Co-administration of chitinase and STP evoked increased IgG2a and IgG2b antibodies in addition to the observed IgG1 response. Good proliferative responses were observed for spleen cells from mice immunized with chitinase in the present of both adjuvans after in vitro restimulation with chitinase. Furthermore stronger T-cell reactivity was found in the group immunized with chitinase/STP. Also chitinase was expressed in Salmonella and oral immunization of mice with this construct enforced the T-cell reactivity, however antigen specific antibodies were undetectable. To further characterize T cell reactivity against OvL3-chitinase T cell epitopes using the Rothbard and Taylor algorithm (1988), Humphreys prediction and the MHC-II-binding motifs from Rammmensee (1995) were identified. All predicted epitopes were synthesized and tested in T-cell proliferation assays. Additional synthetic L3-chitinase-derived overlapping peptides were also used in T-cell proliferation assays. The sensitivity and specificity of the algorithms was evaluated by comparing the predicted epitopes with the epitopes determined by overlapping peptides. Using this approach, prediction based on MHC-II-binding motifs showed the highest sensitivity (0,47) and specificity (0,7). A further increase of the predictive power was obtained by a combining MHC-II-binding motifs and Rothbard and Taylor algorithm, resulting in increased sensitivity (0,67) but lower specificity (0,33). Five immunodominant regions were identified by all algorithm and four of them were confirmed as T-cell epitopes in T-cell assays. PBMCs isolated from patients affected with Onchocerca volvulus from Cameroon were also tested for their reactivity against OvL3-chitinase and the OvL3 CBD in T-cell proliferation assays. After in vitro restimulation with OvL3-chitinase and CBD only marginal T-cell response was observed accompanied by release of Th2-like cytokines such as IL-10 when stimulated with chitinase and IL-4, IL-5 and IL-10 when stimulated with CBD. Strong antibody responses of the IgG4 isotype were detected in the serum of 77% of the patients against chitinase and only in 20% of the patients against CBD.

Keywords:
chitinase, filariae, T-cell epitopes, adjuvans


Seiten: [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [29] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] [105] [106] [107] [108] [109] [110] [111] [112] [113] [114] [115] [116] [117] [118] [119] [120] [121] [122] [123] [124] [125] [126]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteCharakterisierung und Identifizierung von immundominanten Bereichen der L3-Chitinase von Onchocerca volvulus
1 Einleitung
1.1.Die Immunantwort bei Filariosen
1.2.Die Nagetierfilarie Acanthocheilonema viteae
1.3.Rolle der Chitinase im Infektionsverlauf
1.4.L3-Chitinase als potentieller Impfstoffkandidat
1.5.Ziele der Arbeit
2 MATERIAL und METHODEN
2.1.Molekularbiologische Methoden
2.1.1.Polymerase Ketten Reaktion (PCR)
2.1.2.Klonierung der O. volvulus-L3-Chitinase und der O. volvulus-L3-Chitin-Binde-Domäne in den Expressionsvektor pQE 30
2.1.3.Expression der O. volvulus-L3-Chitinase und der Chitin-Binde-Domäne in E. coli
2.1.4.Aufreinigung der O. volvulus-L3 Chitinase aus E. coli-Lysat
2.1.5.Aufreinigung der O. volvulus-L3-Chitin-Binde-Domäne (CBD) aus E. coli-Lysat
2.1.6.Klonierung der O. volvulus-L3-Chitinase in den Salmonellenvektor pTECH
2.1.7.Expression der O. volvulus-L3-Chitinase in Salmonella typhimurium
2.1.8.Lebendkeimzahlbestimmung von Salmonella typhimurium
2.1.9.Nachweis von Salmonellen in Kot- und Organproben
2.1.10.Herstellung eines O. volvulus-Gesamtextraktes (OvAg)
2.1.11.Bestimmung des Proteingehalts von Lösungen
2.1.12.Auftrennung von Proteinen in der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page)
2.1.13.Herstellung transformationskompetenter E. coli
2.1.14.Lagerung und Kultivierung von Bakterien
2.1.15.Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
2.1.16.Dephosphorylierung von Vektor-DNA
2.1.17.Agarose-Gelelektrophorese
2.1.18.DNA-Elution aus Agarosegelen
2.1.19.Photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA und RNA
2.1.20.Ligation von DNA
2.1.21.Transformation von Plasmid-DNA in kompetente E. coli
2.1.22.Plasmidpräparation aus E. coli-Kulturen
2.2.Parasitologische Arbeitsmethoden
2.2.1.Versuchstiere
2.2.2.Experimenteller Lebenszyklus der Nagetierfilarie Acanthocheilonema viteae
2.2.3.Immunisierungsversuche mit O. volvulus-L3-Chitinase und O. volvulus-L3-Chitin-Binde-Domäne in Meriones unguiculatus
2.2.4.Gewinnung der L3 aus Ornithodoros moubata und Infektion der Meriones unguiculatus
2.2.5.Blutentnahmen
2.2.6.Bestimmung der Mikrofilariendichte im Blut A. viteae-infizierter Meriones unguiculatus
2.2.7.Sektion und Isolation von Adultwürmern
2.3.Immunologische Methoden
2.3.1.Immunisierungsstudien mit verschiedenen Adjuvantien im Mausmodell
2.3.2.Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit Salmonellen
2.3.3.Isolierung von Maus-Milzzellen
2.3.4.Immunblot
2.3.5.Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA) zur Bestimmung der O. volvulus-spezifischen IgG bei der Maus
2.3.6.Nachweis spezifischer mRNA mittels reverser Transkription (RT)
2.3.7.Isolierung von mRNA für RT-PCR
2.3.8.Umschreibung von mRNA in cDNA
2.3.9.Amplifikation von Maus-Zytokinen
2.4.Charakterisierung von T-Zell-Epitopen innerhalb der O. volvulus-L3-Chitinase
2.4.1.Algorithmus von Rothbard und Taylor
2.4.2.MHC-II-Bindungs-Motive nach der Vorhersage von Rammensee
2.4.3.Algorithmus nach Humphreys
2.4.4.Beurteilung der Sensitivität und Spezifität der Algorithmen
2.4.5.Herstellung der vorhergesagten T-Zell-Epitope als synthetische Peptide
2.5.Aktivitätstest der O. volvulus-L3-Chitinase
2.6.Charakterisierung der T-Zell-Reaktivität von rekombinanten Proteinen und Peptiden in Feldstudien in Kamerun
2.6.1.Lage des Projektgebietes
2.6.2.Parasitologische Untersuchungen des Patientenkollektives
2.6.3.Isolierung mononukleärer Blutzellen (PBMC) von Onchozerkose-Patienten
2.6.4.Zellkultur und Stimulierung von mononukleären Blutzellen
2.6.5.Zytokinproduktion von PBMC nach in vitro-Stimulation
2.6.6.Zytokinnachweis aus Kulturüberständen mononukleärer Blutzellen
2.6.7.ELISA zur Bestimmung der O. volvulus-spezifischen IgG beim Menschen
2.7.Datenverarbeitung
2.8.Material
2.8.1.Verwendete Tiere für parasitologische Arbeiten
2.8.2.Material für immunologische Arbeiten
2.8.3.Material für molekularbiologische Arbeiten
2.8.4.Kits und Enzyme
2.8.5.Verbrauchsmaterial
2.8.6.Laborgeräte
3 Ergebnisse
3.1.Klonierung, Expression und Aufreinigung von rekombinanten Proteinen
3.1.1.Klonierung der O. volvulus-L3-Chitinase in den prokaryotischen Expressionsvektor pQE 30
3.1.2.Expression der O. volvulus-L3-Chitinase in pQE30
3.1.3.Klonierung der Chitin-Binde-Domäne in den prokaryotischen Expressionsvektor pQE 30
3.1.4.Expression der O. volvulus-L3-Chitin-Binde-Domäne in pQE 30
3.1.5.Klonierung und Expression der O. volvulus-L3-Chitinase in Salmonella typhimurium
3.2.Strukturanalyse der O. volvulus-L3-Chitinase
3.3.Überprüfung der Aktivität der rekombinanten O. volvulus-L3-Chitinase
3.4.Immunisierungsstudien mit rekombinanten Proteinen
3.4.1.Studien zur protektiven Immunisierung im Tiermodell der Nagetierfilarie Achanthoceilonema viteae
3.5.Immunisierung von BALB/c-Mäusen zur Analyse von Immunantworten
3.5.1.T-Zell-Antworten gegen die rekombinante O. volvulus-L3-Chitinase in Kombination mit verschiedenen Adjuvantien
3.5.2.Antikörperantworten gegen die rekombinante O. volvulus-L3-Chitinase in Kombination mit verschiedenen Adjuvantien
3.5.3.Nachweis der Zytokine IL-4, IL-10 und INF-gamma von Mäusen mittels RT-PCR
3.6.Charakterisierung von T-Zell-Epitopen innerhalb der O. volvulus-L3-Chitinase
3.6.1.T-Zell-Epitope nach der Vorhersage von Rothbard und Taylor
3.6.2.Vorhersage der MHC-Bindungs-Motive nach Rammensee
3.6.3.T-Zell-Epitope nach der Vorhersage von Humphreys
3.6.4.Kombination der Algorithmen
3.6.5.Vergleich der vorhergesagten T-Zell-Epitope
3.7.Einsatz der vorhergesagten Epitope in T-Zell-Proliferationstests
3.7.1.T-Zell-Proliferationstests mit Rothbard und Taylor-Peptiden
3.7.2.T-Zell-Proliferationstests mit Rammensee-Peptiden
3.7.3.T-Zell-Proliferationstests mit Humphreys-Peptiden
3.7.4.Proliferationstests mit überlappenden Peptiden der O. volvulus-L3-Chitinase (Pepscan)
3.8.Einsatz der rekombinanten Proteine und Peptide in Feldstudien in Kamerun
3.8.1.Parasitologische Untersuchungen des Patientenkollektives
3.8.2.Antikörperantworten der Onchozerkose-Patienten
3.8.3.T-Zell-Reaktivität der Patienten gegen rekombinante Proteine und synthetische Peptide
3.8.4.Zytokinexpression nach Stimulation mit rekombinanter OvL3-Chitinase und OvL3-CBD
4 Diskussion
4.1.Klonierung der Chitinase und der Chitin-Binde-Domäne
4.2.Einsatz der Chitinase in Immunisierungsstudien
4.2.1.Einsatz der Chitinase und der Chitin-Binde-Domäne im A. viteae-Meriones-Modell
4.2.2.Untersuchungen im Mausmodell
4.3.Identifizierung von T-Zell-Epitopen innerhalb der OvL3-Chitinase
4.3.1.Beurteilung der verwendeten Algorithmen
4.3.2.T-Zell-Reaktivität der vorhergesagten Epitopen
4.4.Einsatz der rekombinanten Proteine und Peptide in Feldstudien in Kamerun
Bibliographie Literatur
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen
Selbständigkeitserklärung
Anhang A Tagungsbeiträge und Publikationen
Danksagung
Lebenslauf

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1:Entwicklungszyklus von Acanthocheilonema viteae (Zeichnung aus dem Archiv des Lehrstuhls für Molekulare Parasitologie)
Abb. 2.Amplifikation der O. volvulus-L3-Chitinase und Chitin-Binde-Domäne (CBD) mittels PCR und spezifischen Primern. Spur 1: DNA-Größenstandard in bp; Spur 2-3: Amplifikation der cDNA der CBD mit 200bp, Spur 4-7: Amplifikation der cDNA der Chitinase mit 1500bp; Spur 8-9: Negativkontrolle, Spur 10: Positivkontrolle
Abb. 3:Klonierung der OvL3-Chitinase und der OvL3-CBD in den bakteriellen Expressionsvektor pQE 30
Abb. 4.: SDS-Gel mit aufgereinigten Proteinfraktionen der OvL3-Chitinase. Spur 1: MG-Marker, Spur 2: ohne Induktion; Spur 3: nach Induktion mit 5mM IPTG, Spur 4-15: Aufreinigungsfraktionen
Abb 5.:Immunblot: Aufgereinigte Fraktionen der OvL3-Chitinase konnten mit Hilfe eines Mausserum gegen OvL3-Chitinase (Verdünnung1:100 in 3%RSA/TBS) bei 56 kDa detektiert werden.
Abb. 6: Aufreinigung der OvL3-CBD unter nativen Bedingungen. Spur 1: MG-Marker in bp, Spur 2: Low-Molekular-Weigt-Marker, Spur 3: ohne Induktion, Spur 4: nach Induktion mit 1mM IPTG, Spur 5-8: Aufreinigungsfraktionen
Abb. 7: Nachweis von aufgereinigten Proteinfraktionen der OvL3-CBD durch Immunblot mit einem Mausserum gegen OvL3-Chitinase. Neben den aufgereinigten Fraktionen bei 14 kDa erkannte das Serum noch Multimere der OvL3-CBD bei 30 kDa und 56 kDa.
Abb. 8. Klonierung der OvL3-Chitinase in den Salmonellen-Vektor pTECH.
Abb. 9.Nachweis der Expression der OvL3-Chitinase im Salmonellen-Vektor pTECH. Die OvL3-Chitinase konnten mit Hilfe eines Kanninchenserums gegen das TetC-Fragment detektiert werden. Es konnte sowohl das Fusionsprotein mit dem TetC-Fragment bei 96kDa, als auch Abbauprodukte der Chitinase mit dem Tet C-Anteil bei 56kDa und 38,5kDa nachgewiesen werden. Spur 1,2+4: Klon von SL3261 mit Chitinase/pTECH, Spur 3: Negativkontrolle: SL3261 ohne Insert
Abb. 10: Enzymatische Aktivität der O. volvulus-L3-Chitinase. Dargestellt ist die Zunahme des Chromogens 4-Methylumbellyferyl, das durch die Chitinase (0,5µg) vom Substrat GlucNac3 abgespalten wurde. Positivkontrolle: Chitinase von Serratia marcescens (0,2µg), Negativkontrolle: Cystatin von A. viteae mit 17kDa und PBS.
Abb 11a und b:Mittlere Wurmlast+Standardabweichung von immunisierten Wüstenrennmäusen nach Belastungsinfektion mit 75 L3. In diesem Versuch wurden neben der Chitinase die rekombinanten Proteine A. viteae 17 (Av17) bzw. A. viteae Tropomyosin (AvTropo) gegen die Kontrollgruppe STP und PBS getestet.
Abb. 12a und b: Antikörperantworten der mit OvL3-Chitinase immunisierten M. unguiculatus. Dargestellt sind die OD-Werte von IgG, den IgG-Subklassen und IgM (Versuch a) gegen Chitinase während des Infektionsverlaufes.
Abb. 13: IgG-Antikörperantwort der mit OvL3-CBD immunisierten M. unguiculatus. Dargestellt sind die OD Werte der IgG-Antikörper und die Standardabweichung während des Infektionsverlaufes.
Abb 14. :T-Zell-Reaktivität von BALB/c-Mäusen, die mit Chitinase in Kombination mit verschiedenen Adjuvantien immunisiert wurden. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte der netto cpm + Standardabweichung
Abb 15: T-Zell-Reaktivität von mit Salmonellen immunisierten BALB/c-Mäusen nach Restimulation mit rekombinanter Chitinase. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte der netto cpm+ Standardabweichung.
Abb 16: Antikörperantworten von BALB/c-Mäusen, die mit Chitinase in Kombination mit verschiedenen Adjuvantien immunisiert wurden. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte + Standardabweichung von IgG und IgG-Subklassen.
Abb.17 :Antikörperantworten der mit Salmonellen immunisierten BALB/c-Mäuse. Dargestellt sind die Mittelwerte + Standardabweichung von IgG-, IgG3- und IgG1- Antikörperantworten auf Salmonellen-LPS.
Abb.18a. Amplifikation von ß2Mikroglobulin nach Reverser Transkription
Spur 1: Marker; Spur 2: Gruppe 1: ohne Restimulation; Spur 3: mit Chitinase restimuliert; Spur 4: Gruppe 2: ohne Restimulation, Spur 5: mit Chitinase restimuliert; Spur 6: Gruppe 3: ohne Restimulation; Spur 7: mit Chitinase restimuliert; Spur 8: Gruppe 4: ohne Restimulation; Spur 9: mit Chitinase restimuliert; Spur 10: Marker; Spur 11: Gruppe 5: ohne Restimulation; Spur 12: mit Chitinase restimuliert; Spur 13: Gruppe 6: ohne Restimulation Spur 14: mit Chitinase restimuliert; Spur 15: Positivkontrolle; Spur 16: Negativkontrolle
Abb. 18b. Amplifikation der Zytokine IL-4 , IL-10 und INF-gamma von unstimulierten Zellen (RPMI) nach 48h Inkubation.
Spur 1: Marker; Spur 2-6: Amplifikation von IL-4 von unstimulierten Zellen der Gruppe 1-6, Spur 7-12: Amplifikation von IL-10 von unstimulierten Zellen der Gruppe 1-6, Spur 13-18: Amplifikation von INF-gamma von unstimulierten Zellen der Gruppe 1-6
Abb.18c.: Amplifikation der Zytokine IL-4 , IL-10 und INF-gamma nach 48 h Stimulation mit rek. OvL3-Chitinase.
Spur 1: Marker; Spur 2-6: Amplifikation von IL-4 von mit Chitinase restimulierten Zellen der Gruppe 1-6, Spur 7-12: Amplifikation von IL-10 von mit Chitinase restimulierten Zellen der Gruppe 1-6, Spur 13-18: Amplifikation von INF-gamma von mit Chitinase restimulierten Zellen der Gruppe 1-6
Abb. 19. Sensitivität und Spezifität der T-Zell Algorithmen.
Abb. 20: AS-Sequenz der O. volvulus-L3-Chitinase. Die vorhergesagten T-Zell-Epitope sind in die Sequenz eingetragen. Die Bereiche, die von dem Algorithmus nach Rothbard und Taylor vorhergesagt wurden, sind unterstrichen, während die Abschnitte der Rammensee-Vorhersage oberhalb der Sequenz eingetragen wurden. Mit Sternen oberhalb der Sequenz wurde die Vorhersage nach Humphreys gekennzeichnet. Mit einem hellgrauen Kasten versehen sind die T-Zell-Abschnitte, die von allen Algorithmen detektiert wurden, während das aktive Zentrum grau unterlegt wurde. Zusätzlich wurden die Signalsequenz und die Chitin-Binde-Domäne (CBD) eingezeichnet.
Abb.21a-d und 22 a-d: T-Zell-Reaktivität nach Stimulation mit den verschiedenen Peptiden. Dargestellt sind die netto cpm nach Abzug der spontanen Proliferation (RPMI) und die Standardabweichung. Mit dunklen Balken sind die Peptide dargestellt, die von allen Algorithmen vorhergesagt wurden.
Abb. 23 a-d: Antikörperantworten der Onchozerkose Patienten (n=61) gegen Gesamtantigen (OvAg), Chitinase und CBD. Dargestellt sind die Einzelwerte der Antikörper IgG, IgG1, IgG3 und IgG4
Abb. 24: T-Zell-Proliferationswerte der PBMC der Onchozerkose-Patienten auf verschiedene Antigene. Die Werte sind als Stimulationsindizes angegeben, wobei die Proliferationswerte nach Stimulation durch die Werte ohne Stimulation geteilt wurden.

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