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Einleitung

1.1  Hypertrophie

Der Begriff Hypertrophie bezeichnet eine zelluläre Anpassungsleistung, die durch Volumenzunahme der Zellen und Vermehrung der funktionellen Substanz bei konstanter Zellzahl gekennzeichnet ist und durch eine subletale Zellschädigung verursacht wird. Unterschieden werden zum einen die kompensatorische Hypertrophie, die durch eine vermehrte Arbeitsbelastung eines Organs ausgelöst wird (z. B. Myokardhypertrophie bei Aortenklappenstenose), und zum anderen die endokrine Hypertrophie, deren Ursache in einem erhöhten Hormonspiegel zu finden ist (z. B. Uterus in der Schwangerschaft). Der zugrunde liegende pathogenetische Mechanismus ist bei allen Hypertrophiearten gleich: auf einen funktionssteigernden Stimulus hin kommt es unter Vermittlung von Transkriptionsfaktoren und durch eine verstärkte Expression von Protoonkogenen zur Initiation einer anabolen Stoffwechsellage, welche mit verstärkter DNA-, RNA- und Proteinsynthese einhergeht. Darüber hinaus werden im Rahmen antikataboler Prozesse der Energieverbrauch, der autophagische Zellumbau und die intrazelluläre Proteolyse reduziert (Riede und Schaefer 1999).

1.1.1  Makroskopische Charakteristika kardialer Hypertrophie

Das Herz eines Gesunden wiegt zwischen 250-300 g (Frauen) bzw. 300-350 g (Männer). Ab einer Gewichtszunahme von 50 g spricht man von einer Hypertrophie. Die Hypertrophie des Herzens stellt als Adaptation an erhöhte Leistungsanforderungen ein sinnvolles physiologisches System dar. Dabei sind der Zunahme der funktionellen Substanz jedoch – insbesondere beim Herzen – Grenzen gesetzt, nach deren Überschreiten Hypertrophie Krankheitswert gewinnt.

Die wichtigsten Ursachen für die Ausbildung einer Hypertrophie des Herzens sind eine vermehrte Druck- oder Volumenbelastung. Während erstere zumeist die Folge von Stenosen der Herzklappen oder eines erhöhten Blutdrucks ist, entsteht letztere vor allem durch insuffiziente Klappen und Shuntvitien. Beide Formen gehen mit charakteristischen morphologischen Veränderungen sowohl auf [Seite 2↓]makroskopischer wie auf subzellulärer Ebene einher.

Beiden Fällen gemein ist eine durch die Überlastung ausgelöste Steigerung der Herzleistung durch eine vorübergehende Überfunktion der Myozyten. Diese Überfunktion bewirkt als chronische subletale Zellschädigung eine Zunahme der funktionellen Substanz mit konsekutiver, dauerhafter Leistungssteigerung des Herzens. Bei einer Druckbelastung führt die gesteigerte systolische Wandspannung zur Neubildung von Myofibrillen in paralleler Anordnung, was makroskopisch als Zunahme der Ventrikelwanddicke bei gleichbleibendem Innenvolumen imponiert; man spricht von einer konzentrischen Hypertrophie. Im Falle einer Volumenbelastung hingegen kommt es zur Steigerung der initialen diastolischen Wandspannung, was in einer Verlängerung des kontraktilen Apparats durch die Synthese neuer Sarkomere resultiert. Makroskopisch nehmen Ventrikelwanddicke und Ventrikelvolumen proportional zu; man spricht von einer exzentrischen Hypertrophie.

Der Anpassungsfähigkeit des Herzens sind jedoch Grenzen gesetzt. Kann eine persistierende Belastung nicht kompensiert werden und überschreitet das Herzgewicht die kritische Masse von 500 g, ist das Kapillarsystem nicht mehr in der Lage, das Myokard ausreichend mit Nährstoffen und Sauerstoff zu versorgen – es kommt zu Leistungsabfall und Herzinsuffizienz.

1.1.2  Zelluläre Charakteristika kardialer Hypertrophie

Bei Kardiomyozyten handelt es sich um terminal ausdifferenzierte, irreversibel postmitotische Zellen. Daher scheidet Zellteilung, sprich: Hyperplasie, als Reaktion auf vermehrte Arbeitsbelastung aus; es kommt zur Hypertrophie. Diese ist gekennzeichnet durch eine Reihe charakteristischer Veränderungen. Hauptmerkmale sind dabei die Volumenzunahme um Faktor 2 bis 3 (Messerli et al. 1993) und der Anstieg des Proteingehalts. Jedoch kommt es nicht zu einem simplen „Mehr an allem“; vielmehr findet sich ein spezifisches Genexpressionsmuster mit konsekutiven Veränderungen des Phänotyps (Swynghedauw et al. 1990, van Bilsen und Chien 1993, Calderone et al. 1995). Dabei kommt es zunächst innerhalb von 30 [Seite 3↓]Minuten zur verstärkten Expression der Transkriptionsfaktoren egr-1, hsp70, c-fos, c-jun und c-myc. Die Aktivierung dieser so genannten „early response genes“ scheint dabei einer allgemeinen, unspezifischen Antwort ausdifferenzierter Zellen, die die Fähigkeit zur DNA-Replikation verloren haben, auf Wachstum induzierende Reize zu entsprechen (Izumo et al. 1988, Komuro, Kurabayashi et al. 1988, van Bilsen und Chien 1993). Eine spezifischere Reaktion auf hypertrophe Stimuli folgt innerhalb von 6 bis 12 Stunden in Form einer Reexpression fetaler Gene. Das so genannte „fetale Genmuster“ ist charakterisiert durch Expression des atrialen natriuretischen Faktors (ANF) sowie der Strukturproteine β-myosin heavy chain und α-skeletal actin (Calderone et al. 1995). Analog zum ANF kommt es ebenfalls zu einer Steigerung der Expression des mit ihm nahe verwandten BNP (B-type oder brain natriuretic peptide) (Hanford et al. 1994). Als weitere Reaktion auf eine Hypertophie induzierende Stimulation kommt es nach 12 bis 24 Stunden zur verstärkten Expression von Proteinen des kontraktilen Apparats wie ventricular myosin light chain 2 (Lee 1988) und α-cardiac actin (Long 1989).

Die bereits erwähnte Zunahme des Proteingehalts der Zellen wird vor allem durch einen Anstieg der allgemeinen Proteinsyntheserate verursacht (Sugden und Fuller 1991), während die Degradation der Proteine weitgehend unverändert bleibt (McDermott und Morgan 1989). Notwendig dafür ist eine Zunahme des Gehalts an Ribosomen, da bereits im nichthypertrophierten Zustand 90% der Ribosomen ausgelastet sind (Morgan et al. 1992, Hannan und Rothblum 1995).

1.1.2.1  Induktoren der kardialen Hypertrophie

In den letzten Jahren konnte eine Vielzahl von physiologischen und synthetischen Botenstoffen als Auslöser einer Hypertrophie kardialer Myozyten identifiziert werden. Bereits 1982 konnten Simpson und Savion, Pioniere auf dem Gebiet der Kultivierung kardialer Myozyten, zeigen, dass durch Behandlung mit Serum und/ oder Katecholaminen (Isoproterenol, Noradrenalin) Hypertrophie in der Zellkultur induzierbar ist (Simpson und Savion 1982). Als wichtigste hypertroph-wirkende Botenstoffe werden heute Endothelin-1, ein von Arterienendothelzellen gebildeter Vaso[Seite 4↓]konstriktor, und α1-adrenerge Agonisten wie zum Beispiel Phenylephrin betrachtet (Sugden und Bogoyevitch 1996, Fedida et al. 1993, Terzic et al. 1993, van Bilsen 1997). Als Kandidat wird Angiotensin II diskutiert. Dieses physiologische Peptidhormon des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems wirkt zwar eindeutig Hypertrophie-auslösend, jedoch möglicherweise nicht direkt sondern durch die Freisetzung parakriner Faktoren (Ito, Hirata et al. 1993, Kim et al. 1995). Weitere Induktoren kardialer Hypertrophie finden sich unter den Wachstumsfaktoren (z. B. Fibroblast growth factor [Parker et al. 1990], Insulin-like growth factor [Ito, Hiroe et al. 1993, Levandero et al. 1998]) und in der Gruppe der Zytokine (z. B. Interleukin-1β [Palmer et al. 1995], Cardiotrophin-1 [Wollert et al. 1996]). Als letztes sind noch das Schilddrüsenhormon Trijodthyronin (Schaub et al. 1997) und das Prostaglandin PGF2 α (Adams et al. 1996) zu nennen.

Obwohl alle genannten Botenstoffe die Kriterien für Hypertrophie induzierende Wirkstoffe, d. h. Zunahme der Zellgröße, der Myofibrillensynthese und Ausbildung eines typischen Genexpressionsmusters, erfüllen, können sie sich jedoch ansonsten sowohl in der intrazellulären Signaltransduktion wie auch im ausgelösten Genmuster unterscheiden. So induzieren z. B. α1-adrenerge Sympathomimetika und Endothelin-1 ein Expressionsmuster, das eher dem einer Hypertrophie aufgrund einer Druckbelastung ähnelt, während das von Cardiotrophin-1 ausgelöste Muster eher dem einer Volumenhypertrophie in vivo entspricht (Sugden und Clerk 1998).

Als weitere Mechanismen, mit denen Hypertrophie ausgelöst werden kann, konnten Dehnung (Komuro, Katoh et al. 1991), Hypoxie (Ito, Adachi et al. 1996) und Zell-Zell-Kontakt (Clark et al. 1998) identifiziert werden. Bei diesen Formen der Hypertrophieinduktion spielt vermutlich die para- und/ oder autokrine Sekretion von Endothelin-1 (Ito, Adachi et al. 1996, Yamazaki et al. 1996) und Angiotensin II (Sadoshima et al. 1993) eine entscheidende Rolle.

1.1.2.2  Intrazelluläre Signaltransduktion

Analog zur Vielzahl an Botenstoffen, die die Fähigkeit besitzen, Hypertrophie aus[Seite 5↓]zulösen, gibt es eine große Anzahl parallel wirkender, intrazellulärer Signalübertragungswege (Abbildung 1). Jede Gruppe von Hypertrophiemediatoren hat dabei präferierte Signalwege. Dies trägt zur Ausprägung unterschiedlicher Phänotypen in Abhängigkeit vom hypertrophen Stimulus bei. Gleichzeitig bestehen jedoch auf verschiedenen Ebenen Querverbindungen zwischen den einzelnen Signalwegen. Eine Ausnahmestellung besitzt dabei das Schilddrüsenhormon T3 , das durch einen energieverbrauchenden Transportmechanismus von der Zelle aufgenommen (Hefti et al. 1997) und anschließend von T 3 -bindenden Proteinen in den Zellkern transloziert wird, wo es über den nukleären T3-Rezeptor auf die Transkription wirkt (Ichikawa und Hashizume 1995). Am Anfang der übrigen Signalketten hingegen stehen zellmembranständige Rezeptoren, die nach Bindung des jeweiligen Botenstoffs eine oder mehrere Signaltransduktionskaskaden in Gang setzen. Unterschieden werden 3 Hauptgruppen von Rezeptoren: 1. die G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR), zu denen die Rezeptoren der Katecholamine und vasoaktiven Peptide (ET-1, AT II) gehören, 2. die Wachstumsfaktor-Rezeptoren mit Tyrosin- bzw. Threonin/ Serin-Kinase-Aktivität (RTK/ RSTK) und 3. die Zytokin-Rezeptoren (CR).

Bei GPCR handelt es sich um heptahelikale Transmembranrezeptoren, die mit den GTP bindenden, heterotrimeren G-Proteinen interagieren (Neer et al. 1995). Nach Ligandenbindung spaltet sich von diesen die α-Untereinheit ab und tauscht ein GDP- gegen ein GTP-Molekül aus. Das Dimer aus verbliebener β- und γ-Untereinheit ist nun in der Lage, die Phospholipase Cβ zu aktivieren. Dieses membranständige Enzym katalysiert die Hydrolyse von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) zu Diacylglycerin (DAG) und Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3). DAG aktiviert im folgenden die Proteinkinase C (Jaken 1996), während IP3 vor allem die intrazelluläre Ca2+-Freisetzung zu steigern vermag (Sugden und Bogoyevitch 1996). Die Wirkung der α-Untereinheiten ist abhängig von ihrer Zugehörigkeit zu einer der G-Protein-Subfamilien: sie können die Phospholipase Cβ aktivieren (Gq) und die Adenylatzyklase stimulieren (Gs) oder hemmen (Gi). Das von der Adenylatzyklase gebildete zyklische Adenosinmonophosphat wiederum aktiviert unter anderem die Proteinkinase A (Hefti et al. 1997).


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Abbildung 1: Die wichtigsten Signaltransduktionswege in der Hypertrophie (modifiziert nach Hefti et al. 1997).


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Die beiden Proteinkinasen A und C haben eine Vielzahl zytosolischer und nukleärer Substrate. So sind beispielsweise beide in der Lage, die Kaskade der mitogen activated protein kinases (MAPK, s. u.) zu starten (Kolch 1993, Denhardt 1996, Yamazaki et al. 1997). Die Gruppe der Wachstumsfaktorrezeptoren lässt sich in zwei Subfamilien mit unterschiedlicher Kinase-Aktivität einteilen. Diejenigen mit Tyrosin-Kinase-Aktivität wirken unter anderem auf die monomere GTPase Ras (p21) und aktivieren die Phosphatidyl-3-OH-Kinase (PI3K), während Rezeptoren mit Serin/ Threonin-Kinase-Aktivität vor allem über die Familie der Smad-Transkriptionsfaktoren auf nukleäre Substrate wirken.

Zytokin-Rezeptoren wiederum nehmen über die Januskinase (JAK) Einfluss auf Proteine der Ras-Familie (Rac1, cdc42) und via STAT (signal transducer and activator of transcription) auf nukleäre Transkriptionsfaktoren.

Eine zentrale Rolle in der Mediation hypertropher Signale spielt die monomere GTPase Ras. Sie wird sowohl durch Zytokine und Wachstumsfaktoren als auch durch die Agonisten der G-Protein gekoppelten Rezeptoren aktiviert. Ihre Aufgabe besteht unter anderem in der Aktivierung einer der wichtigsten Signaltransduktionskaskaden in der Hypertrophie: die der mitogen activated protein kinases (MAPK, Abbildung 2). Diese modulieren durch Phosphorylierung von Serin- und Threonin-Resten die Aktivität einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren, wie z. B. c-jun, c-fos, ATF2, ternary complex factors (Elk1, SAP1a) und MEF2C. Man unterscheidet dabei drei MAPK-Subfamilien: 1. die extracellular signal regulated protein kinases 1/2 (ERK 1/2, auch: extracellularly responsive kinase, MAPK p44/42), 2. die c-jun N-terminal kinase/ stress-activated protein kinase (JNK/ SAPK) und 3. die p38 MAPK. Während die Hauptaufgabe der JNK/ SAPK und p38 MAPK vor allem in der Vermittlung pathologischen Stresses liegt, spielt die Gruppe der ERK eine herausragende Rolle in der Mediation anaboler Prozesse wie Hypertrophie, Zellteilung und -differenzierung (Yue et al. 2000). Die Aktivierung der MAPK erfolgt durch Phosphorylierung an Threonin- und Tyrosin-Seitenketten (Thr-X-Tyr-Motiv) durch MAPK Kinasen (MAPKK), wie z. B. MEK 1/2 (mitogen activated ERK activating kinase) und SEK (SAPK Kinase), welche wiederum durch MAPKK Kinasen, wie MEKK und Raf, aktiviert werden.


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Durch die zahlreichen Querverbindungen, die zwischen den einzelnen Signaltransduktionskaskaden bestehen, kommt es zu einer erheblichen Signalamplifikation, -modulation und -integration, am Ende derer die Beeinflussung der Aktivität zahlreicher nukleärer Transkriptionsfaktoren steht. Diese modulieren über die Bindung an Promoter- bzw. Enhancer-Regionen die Transkription einer Vielzahl von Genen.

Abbildung 2: Die Kaskade der mitogen activated protein kinases (MAPK). Kursiv: noch nicht identifiziert (modifiziert nach Sugden und Clerk 1998).

1.2  Das Ubiquitin-Proteasom-System

Das Ubiquitin-Proteasom-System stellt den wichtigsten Abbauweg intrazellulärer Proteine dar; nahezu alle zum Abbau bestimmten Proteine werden über ihn degradiert (Rock et al. 1994). Dementsprechend sind Zellen ohne ein funktionierendes Ubiquitin-Proteasom-System nicht lebensfähig (Tanaka 1995). Abgebaut werden zum einen „altersschwache“ Proteine im Rahmen des physiologischen Proteinturnovers entsprechend der jeweiligen Proteinhalbwertszeit und zum anderen abnorme, durch Mutationen oder Synthesefehler entstandene Proteine. Des Weiteren spielt das Proteasom durch die schnelle Degradation geschwindigkeitsbestimmender Enzyme (z. B. Ornithin-Decarboxylase), Transkriptionsfaktoren (z. B. [Seite 9↓]c-jun) und regulatorischer Proteine (z. B. Zykline) eine wichtige Rolle in der Regulation von Stoffwechsel, Transkription und Zellzyklus (Coux et al. 1996).

1.2.1  Markierung der Proteasomsubstrate mit Ubiquitin

Um zu gewährleisten, dass das Proteasom nur die zum Abbau bestimmten Proteine degradiert, werden diese mit einer Kette aus mindestens vier Ubiquitinmolekülen markiert (Voges et al. 1999) (Abbildung 3).

Abbildung 3: Das Ubiquitin-Proteasom-System (nach Coux et al. 1996).

Diese Markierung wird von drei Enzymen katalysiert. Zunächst wird das Ubiquitin, ein hochkonserviertes 8 kDa schweres Polypeptid, durch das Enzym E1 in einem [Seite 10↓]ATP-abhängigen Prozess aktiviert und auf das Ubiquitin carrier protein E2 übertragen. Eine Protein-Ligase E3 bindet das zu degradierende Protein und überträgt das Ubiquitin auf einen Lysinrest des Substrats bzw. eines bereits ans Protein gebundenen Ubiquitins (Glickman und Ciechanover 2002). Eukaryontische Zellen enthalten dabei möglicherweise mehrere hundert E3-Ligasen, die charakteristische Degradations-Signale der Proteine erkennen und so die Spezifität des Markierungswegs ermöglichen (Kisselev und Goldberg 2001). Vor der Degradation der Proteine durch das Proteasom werden die Ubiquitinmoleküle abgespalten und können so wiederverwendet werden.

1.2.2  Struktur des Proteasoms

Beim Proteasom handelt es sich um eine multikatalytische Peptidase, die polyubiquitinierte Proteine rasch in kleine Oligopeptide spaltet. Durch Bindung regulatorischer Proteine wie PA28 und PA700 an die Enden des katalytischen Kerns, dem 20S Proteasom, entstehen verschiedene Unterformen, die sich in Aufbau und Funktion unterscheiden (Tabelle 1) (Tanahashi et al. 2000).

Tabelle 1: Relativer Anteil der einzelnen Proteasomunterformen und der endogenen Aktivatoren PA28 und PA700 im Zytosol von HeLa-Zellen (Tanahashi et al. 2000).

Komplex

Anteil [%]

20S Proteasom

31 ± 4

PA700

10 ± 1

PA28

15 ± 10

PA28 – 20S – PA28

15 ± 7

PA700 – 20S – PA28

18 ± 7

PA700 – 20S – PA700 (26S Proteasom)

11 ± 2

Das 20S Proteasom ist ein zylinderförmiges, 700-750 kDa schweres Molekül mit [Seite 11↓]einem Durchmesser von 12 nm und einer Länge von 17 nm (Baumeister et al. 1988). Es besteht aus vier Ringen, die sich aus jeweils 7 Untereinheiten zusammensetzen (Zwickl et al. 1992). Dabei sind die beiden äußeren α-Ringe ebenso wie die beiden inneren β-Ringe identisch, so dass ein 20S-Proteasom aus zwei gleichen Hälften besteht (Kopp et al. 1993). Während die α-Untereinheiten eher eine strukturgebende Funktion erfüllen – nur sie können überhaupt Ringe formen – und des Weiteren eine physikalische Barriere für zytosolische Proteine bilden (Löwe et al. 1995), tragen jeweils drei Untereinheiten der β-Ringe die proteolytische Aktivität. Durch diese werden dem Proteasom zugeführte Proteine innerhalb von ein bis zwei Minuten in Oligopeptide von 7 bis 11 Aminosäuren Länge gespalten (Zwickl et al. 1994, Akopian et al. 1997). Dabei werden drei verschiedene Aktivitätstypen unterschieden: 1. die chymotrypsin-like Aktivität, die nach hydrophoben Residuen schneidet, 2. die trypsin-like Aktivität (nach basischen Residuen) und 3. die Postglutamylhydrolase-Aktivität (nach sauren Residuen, auch: caspase-like Aktivität) (Orlowski 1990, Rivett 1989). Weitere Aktivitätsarten werden diskutiert; so zum Beispiel eine BrAAP-Aktivität (branched-chain aminoacid) und eine SNAAP-Aktivität (small neutral amino acid) (Orlowski et al. 1993). Im Gegensatz zu anderen Proteasen benutzen dabei alle proteolytisch aktiven Zentren des Proteasoms N-terminale Threoninreste als Nukleophile. Die entstehenden Oligopeptide können in der Folge durch zytosolische Exopeptidasen weiter abgebaut werden. Die Zusammensetzung der Untereinheiten des Proteasoms ist gewebe- und entwicklungsabhängig und wird präzise reguliert. So bewirkt beispielsweise Interferon γ den Austausch von 3 β-Untereinheiten gegen LMP 2/7 (low molecular weight proteins) und MECL-1 (multicatalytic endopeptidase complex subunit) (Früh et al. 1994), die die proteasomale Aktivität zu Gunsten der Antigenpräsentation via MHC I – einer weiteren wichtigen Aufgabe des Proteasoms (Goldberg und Rock 1992) – verändern (Brown et al. 1993). Ebenso wie der Aufbau ist auch die Gesamtaktivität des Proteasoms einer genauen Regulierung unterworfen. So bewirken die endogenen Aktivatoren PA28 (Ma et al. 1992) und PA700 (auch: 19S-Regulatorprotein, Chu-Ping et al. 1994) eine Aktivitätserhöhung auf das 10- bis 50-fache. Als endogene Inhibitoren wirken dagegen die δ-Aminolävulinsäure-Dehydratase (Murakami und Etlinger 1986, Guo und Etlinger 1994), PI31 (Chu-[Seite 12↓]Ping et al. 1992) und das Hitzeschockprotein Hsp70 (Tsubuki et al. 1994).

Bindet an jeden der äußeren α-Ringe ein PA700-Molekül, entsteht das 2000-2500 kDa schwere, hantelförmige 26S Proteasom. PA700 besteht aus 2 Subkomplexen, der „base“ und dem „lid“. Während erstere die ATPase-Aktivität trägt und in der Lage ist, die Eintrittspforte der α-Ringe zu öffnen und die abzubauenden Proteine zu entfalten (man spricht von einer „reverse chaperone activitiy“), hat der „Deckel“ die Aufgabe, die Substrate und Polyubiquitinketten zu erkennen und – vermutlich mit Hilfe einer Isopeptidase-Aktivität – vom Substrat abzuspalten (zur Übersicht siehe Deveraux et al. 1994, van Nocker et al. 1996, Ferrell et al. 2000).

1.2.3  Aufgaben des Proteasoms

Neben seiner eigentlichen Hauptaufgabe, dem Abbau abnormer und altersschwacher Proteine, ist das Proteasom durch die schnelle Degradation von geschwindigkeitsbestimmenden Enzymen, Mediatorproteinen und Transkriptionsfaktoren in der Lage, regulatorisch auf eine Vielzahl zellulärer Prozesse einzuwirken (Tabelle 2).

So kann das Proteasom unter anderem aus inaktiven Vorläufer-Proteinen aktive Proteine schneiden, ohne diese komplett abzubauen (limitierte Proteolyse). Dies ist beispielsweise von großer Bedeutung bei der Synthese und Aktivitätsregulation des Transkriptionsfaktors NFκB, der einen erheblichen regulierenden Einfluss auf die Expression vieler für Entzündungsreaktionen wichtiger Mediatoren (TNFα, IL-1), Enzyme (Cyclooxygenase, NO-Synthetase) und Leukozyten Adhäsionsmoleküle (ICAM, VCAM) ausübt (Read et al. 1995, Pahl 1999). So entsteht die p50-Untereinheit von NFκB durch limitierte Proteolyse eines 105 kDa schweren Vorläufer-Proteins (Fan und Maniatis 1991). Auch an der Aktivierung von NFκB ist das Proteasom entscheidend beteiligt. Die inaktive Form des Transkriptionsfaktors liegt im Zytosol gebunden an das Inhibitorprotein IκB vor. Durch proinflammatorische Signale wie z. B. TNFα kommt es zum schnellen proteasomalen Abbau von IκB, woraufhin das nun aktive NFκB in den Zellkern transloziert wird (Palombella et al. 1994).


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Des Weiteren nimmt das Proteasom durch den Abbau von Zyklinen und Inhibitoren der cyclin dependent kinases (CDK) Einfluss auf den Zellzyklus (Koepp et al. 1999). Ferner ist es über den Abbau von Transkriptionsfaktoren wie c-jun, E2F-1 und β-catenin an der Regulation von Zellwachstum und Genexpression (Hershko und Ciechanover 1998) und durch Abbau aktivierter Proteinkinasen (z. B. src und Proteinkinase C) an der Beendigung von Signalkaskaden beteiligt (Harris et al. 1999, Lu et al. 1998). Tumorgenese (Hershko und Ciechanover 1998, Pagano et al. 1995), Antigenpräsentation via MHC I (Rock und Goldberg 1999) und Muskelatrophie (Mitch und Goldberg 1996) sind weitere zelluläre Prozesse, in denen das Proteasom eine wichtige Rolle spielt.

Tabelle 2: Physiologische Funktionen und wichtige Substrate des Proteasoms (modifiziert nach Kisselev und Goldberg 2001).

Funktion

Substrat

Zellzyklusprogression

p27Kip1, p21, Zykline

Onkogenese

p53, p27Kip1, bax, IκB

Apoptose

Bcl-2, cIAP, XIAP

Regulation der Genexpression

c-jun, E2F1, IκB, β-catenin

Entzündung

IκB, p105-Vorläufer von NFκB

Langzeitgedächtnis

Proteinkinase A (regulatorische Untereinheit)

MHC I-Präsentation

die meisten intrazellulären Proteine

Proteinqualitätskontrolle

CFTRΔF508, α1-Antitrypsin, Calmodulin

1.2.4 Selektive Proteasominhibitoren

Als große Hilfe in der Aufklärung der Funktion des Proteasoms erwiesen sich in den letzten Jahren synthetisch hergestellte, selektive Proteasominhibitoren.

Da bereits die Inhibition der chymotrypsin-like Aktivität genügt, um einen Großteil des Proteinabbaus zu hemmen (Rock et al. 1994), und die Hemmung der trypsin-like und der Postglutamylhydrolase-Aktivität keinen großen Einfluss auf die Ge[Seite 14↓]samtproteolyse hat (Kisselev et al. 1999), interferieren die meisten Proteasominhibitoren vor allem mit der chymotrypsin-like Aktivität (Kisselev und Goldberg 2001).

Unterteilen lassen sich die synthetischen Proteasominhibitoren in Peptidaldehyde,
-boronate, -vinylsulfone, -epoxyketone und Nicht-Peptide (z. B. Lactacystin).

Die ersten synthetisch hergestellten Proteasominhibitoren waren Peptidaldehyde (Rock et al. 1994). Sie sind gekennzeichnet durch eine hohe Zellpermeabilität und schnellen zellulären Abbau (Vinitsky et al. 1992). Ihr Wirkprinzip beruht auf der Ausbildung einer reversiblen Hemiacetalbindung mit der Hydroxylgruppe des N-terminalen Threonins der die Aktivität tragenden β-Untereinheit. Sie sind imstande, alle Aktivitätstypen zu inhibieren, wirken jedoch am stärksten an der chymotrypsin-like Aktivität. Aufgrund seiner Potenz und der hohen Selektivität für das Proteasom – Kalpaine und Kathepsine werden erst bei mindestens 10fach höherer Dosierung inhibiert (Tsubuki et al. 1996) – erwies sich das auch in dieser Arbeit verwendete MG132 (Z-Leu-Leu-Leu-CHO, Abbildung 4) als günstigster Vertreter der Peptidaldehyde (Kisselev und Goldberg 2001). Die Mitglieder der Gruppe der Peptidboronate, wie z. B. MG262 (Z-Leu-Leu-Leu-B(OH)2, Abbildung 4) zeichnen sich gegenüber den Aldehyden durch eine höhere Spezifität für das Proteasom und eine deutlich höhere Potenz aus. Als die Gruppe mit der höchsten Spezifität für das Proteasom gelten die Epoxyketone (z. B. Epoxomicin).

Abbildung 4: Strukturformeln der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Proteasominhibitoren. a: MG132, b: MG262.

Aus dem verminderten Proteinabbau ergeben sich zahlreiche Konsequenzen. So kommt es innerhalb von kurzer Zeit zu einer Anhäufung kurzlebiger, polyubiquiti[Seite 15↓]nierter Proteine (Vinitsky et al. 1994). Des Weiteren akkumulieren fehlgefaltete und beschädigte Proteine, die bis zu einem Drittel aller neusynthetisierten Proteine ausmachen können (Schubert et al. 2000). Diese Anhäufung induziert vermutlich die Expression von Hitzeschock- und Stressproteinen des endoplasmatischen Retikulums (Bush et al. 1997). Des Weiteren kommt es zu Veränderung der Expression zahlreicher Gene, die u. a. Proteasomuntereinheiten und Enzyme des Aminosäurestoffwechsels codieren (Zimmermann et al. 2000). Durch Expressionsanalysen des gesamten Genoms von Saccharomyces cerevisiae nach Behandlung mit PS-341 konnte eine Vielzahl weiterer durch die Inhibition des Proteasoms beeinflusster Gene identifiziert werden. Es zeigte sich eine Steigerung der Expression von Genen, die Untereinheiten des Proteasoms codieren und die bei der Substrat-Ubiquitinierung, der Proteinfaltung, der Reaktion auf Zellstress, im Kohlenhydratstoffwechsel und in der DNA-Reparatur eine wichtige Rolle spielen. Demgegenüber verringerte sich die Transkription von Genen des Aminosäurestoffwechsels, der Proteinsynthese, der Fettsäuresynthese und des Transportsystems für kleine Moleküle (Fleming et al. 2002).

Bei längerer Inkubation induzieren Proteasominhibitoren Apoptose, wobei proliferierende Zellen empfindlicher zu reagieren scheinen als postmitotische (Kisselev und Goldberg 2001). Ursache für die Induktion von Apoptose könnte die Akkumulation kritischer Proteine wie des Tumorsuppressorproteins p53 (Lopes et al. 1997) und des cyclin dependent kinase inhibitors p27 (Pagano et al. 1995) sein. Weiterhin kann die Anhäufung fehlgefalteter Proteine die SAPK/ JNK-Kaskade, die ebenfalls in der Lage ist, Apoptose auszulösen, in Gang setzen (Meriin et al. 1998). Interessanterweise kann im Gegensatz dazu eine Inkubationsdauer von weniger als 16 Stunden nicht-proliferierende Thymozyten und neuronale Zellen vor Apoptose schützen. Dies könnte wiederum seine Ursache in der Stabilisierung von Inhibitoren der Apoptose wie bcl-2 haben (Kisselev und Goldberg 2001). Ein weiterer wichtiger Effekt der Proteasominhibitoren ist ihre antiinflammatorische Wirkung durch Stabilisierung des Inhibitorproteins IκB des Transkriptionsfaktors NFκB, der in der Mediation von Entzündungsreizen eine wichtige Rolle spielt (s. o.).


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1.3  Zielsetzung der Arbeit

In unserem Labor ist ein Hypertrophiemodell mit neonatalen Rattenkardiomyozyten etabliert: Behandlung mit hypertrophen Stimuli führt innerhalb von 48 Stunden zur Hypertrophie der Primärzellen. Dabei fiel zunächst auf, dass die gleichzeitige Behandlung mit Proteasominhibitoren das Wachstum der Zellen unterdrückt. Im folgenden durchgeführte Vorversuche, in denen mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion der verminderte Gehalt an mRNA von Hypertrophiemarkern gezeigt werden konnte, gaben weitere Hinweise auf eine supprimierte Induzierbarkeit der Hypertrophie kardialer Myozyten durch Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems.

Daraufhin galt es im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des Hypertrophie-Modells, sowohl die verringerte Flächenzunahme der Myozyten zu quantifizieren als auch die typischen Charakteristika der Hypertrophie auf subzellulärer Ebene, wie Gehalt an Markerproteinen, Genexpression und Protein- und RNA-Synthese, zu untersuchen. Des Weiteren wurden zur Aufklärung möglicher Mechanismen der Proteasomihibitor-vermittelten Hypertrophiesuppression Aktivitätsanalysen von MAP Kinasen und Transkriptionsfaktoren vorgenommen.


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27.11.2003