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2  Materialien und Methoden

Alle Experimente wurden mit neonatalen Rattenkardiomyozyten (Primärzellen) durchgeführt. Soweit nicht gesondert erwähnt, wurden alle Standardsubstanzen und Chemikalien von den Firmen Sigma und Merck bezogen.

2.1 Zellkultur und -präparation

2.1.1 Materialien

· CMF-HBSS Hanks balancierte Salzlösung ohne Kalzium und Magnesium

GibcoBRL Life Technologies

· L-15 (Leibovitz) Medium mit L-Glutamin und L-Aminosäuren

GibcoBRL Life Technologies

· M199 Medium mit 1,25 g/ l NaHCO3, L-Glutamin und L-Aminosäuren

GibcoBRL Life Technologies

· Cytosin-β-D-arabinofuranosid (Ara-C, 10 mM in PBS)

Sigma

· Serum neugeborener Kälber (NBCS), 30 min bei 56°C inaktiviert

GibcoBRL Life Technologies

· Trypsin-EDTA in HBSS ohne Ca2+/ Mg2+

GibcoBRL Life Technologies

· Trypsin-Inhibitor (Sojabohne, 2 mg/ ml in HBSS)

Cell Systems

· Worthington Kollagenase Typ 2 (215 U/ g), 70 mg in 50 ml L-15 Medium

Cell Systems

· Fibronektin (10 µg/ ml, gelöst in H2O mit 0,2% Gelatine)

Promocell

· Trypanblau, 0,4% in PBS

ICN Biochemicals

· Zellsieb, 70 µm, Nylon

Falcon

· Zentrifugenröhrchen, 50 ml

Falcon

· Zellkulturschale, 20 x 100 mm

Falcon

· Zellkulturflasche, 750 ml, 175 cm2

Falcon

· Zellkulturplatte, 6 Vertiefungen, Flachboden, 9,6 cm2 Wachstumsfläche

Falcon

· Wasserbad 1092

GFL

· Zentrifuge 5810R

Eppendorf

· Laminarbox LaminAir HBB 2448

Heraeus Instruments

· Function line CO2-Inkubator

Heraeus Instruments

· Mikroskop Axiovert 25

Zeiss

· Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS):

137 mM NaCl

2,7 mM KCl

4,3 mM Na2HPO41,4 mM KH2PO4pH 7,3 (HCl)

2.1.2 Zellkultur

Als Standardmedium diente Medium M199, dem 0,1 mg/ ml Penicillin-Streptomycin zugesetzt wurde. Grundsätzlich wurden die Zellen bei 37°C und 5% CO2-Begasung in Zellkulturplatten mit 6 Vertiefungen (wells) kultiviert. Um bakterielle Kontamination zu vermeiden, wurde an einer Werkbank mit laminarer Luftströmung gearbeitet.

2.1.3 Zellpräparation

Zur Gewinnung der neonatalen Rattenkardiomyozyten wurden 2-3 Tage alte Wistarratten durch Genickbruch getötet, mit 70% Ethanol desinfiziert und anschließend thorakotomiert. Nach Entnahme der Herzen, Abpräparation der Vorhöfe und einem Waschschritt in 40 ml eiskaltem HBSS wurden die Ventrikel in ca. 1 [Seite 19↓]mm3 große Stücken geschnitten. Diese wurden 18-20 Stunden mit 50 µg/ ml Trypsin (1 ml Trypsin-EDTA in 9 ml HBSS bei 10 Herzen) bei 4°C in einer Zellkulturschale inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion wurde 1 ml Trypsin-Inhibitor hinzugesetzt, die Schale 30 Sekunden geschwenkt und 5-7 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 5 ml Kollagenase wurde die Lösung 30-45 Minuten bei 37°C im Wasserbad geschwenkt. Nun wurden die angedauten Herzstückchen durch vorsichtiges Auf- und Niederpipettieren mit einer 10 ml-Pipette weiter verkleinert. Zum Absetzen der unverdauten Gewebereste wurde die Zellsuspension fünf Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann der Überstand abgenommen und mit dem zuvor mit 1 ml L-15 angefeuchteten 70 µm-Zellsieb filtriert. Die übrigen Gewebereste wurden in 5 ml L-15 Medium resuspendiert und auf- und niederpipettiert. Nach erneutem Absetzen der ungelösten Reste wurde der Überstand im Zellsieb filtriert. Im Anschluss wurde das Zellsieb mit 2 ml L-15 Medium gespült. Nach 20-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen 5 Minuten bei 83 x g (700 U/ min) zentrifugiert. Der entstandene Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 25 ml Medium M199 mit 10% NBCS, 10 µM Ara-C und Penicillin-Streptomycin resuspendiert. Um einen möglichst hohen Anteil an kardialen Myozyten zu erreichen, wurde die Zellsuspension eine Stunde in einer 750 ml-Zellkulturflasche (175 cm2) bei 37°C präplattiert. Dabei setzen sich andere Zelltypen wie zum Beispiel Fibroblasten deutlich schneller ab. Nach Abnahme und Durchmischen des Überstands wurden die Zellen in einer Neubauerkammer gezählt. Dafür wurde einem Aliquot Zellsuspension Trypanblau im Verhältnis 1:10 zugesetzt, um lebende von toten Zellen, die den Farbstoff inkorporieren, unterscheiden zu können. Daraufhin wurden die Zellen in Fibronektin-beschichteten Zellkulturschalen (sechs 35 mm-Vertiefungen, 9,6 cm2 Wachstumsfläche) mit einer Dichte von ~2000 Zellen/ mm2 (1,2-1,5 x 106/ well) ausplattiert. Das dem M199 hinzugefügte Spindelgift Ara-C hatte die Aufgabe, den Anteil teilungsfähiger Zellen weiter zu reduzieren. Nach 24 Stunden Inkubation unter Standardbedingungen wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und auf serum- und Ara-C-freies M199 umgestellt.


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2.2  Zellstimulation

2.2.1 Materialien

2.2.1.1 Agonisten

· Isoproterenol (10 mM in H2O)

Sigma

·Angiotensin II (100 mM in H2O)

Sigma

· Phenylephrin (100 mM in H2O)

Sigma

· Fetales Kälberserum (FCS)

Biochrom KG

2.2.1.2 Inhibitoren

· MG132 (Z-Leu-Leu-Leu-CHO, 10 mM in Dimethylsulfoxid)

Biomol

· MG262 (Z-Leu-Leu-Leu-B(OH)2, 10 mM in Dimethylsulfoxid)

Biomol

·ALLM (N-Ac-Leu-Leu-methional, 10 mM in Dimethylsulfoxid)

Calbiochem

2.2.2 Durchführung

24 Stunden nach dem Ausplattieren wurden die Zellen dreimal mit je 2 ml PBS/ well gewaschen, auf Standardmedium umgestellt und für weitere 24 Stunden inkubiert. Daraufhin wurden die Agonisten bzw. Inhibitoren entsprechend der jeweiligen Experimente hinzugegeben. Die Kontrollen wurden mit den entsprechenden Lösungsmitteln behandelt.

Als hypertrophe Stimuli wurden Isoproterenol, ein synthetisches β-Sympathomimetikum, Phenylephrin, ein synthetisches α-Sympathomimetikum, und Angiotensin II, ein physiologisches Peptidhormon des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems, verwendet. Des Weiteren wurde fetales Kälberserum (FCS), das zahlreiche Hypertrophie-induzierende Botenstoffe enthält, eingesetzt.

Zur Hemmung des Proteasoms wurden die selektiven, zellmembranpermeablen, reversiblen Proteasominhibitoren MG132 (Ki = 4 nM) und MG262 (Ki = 0,03 nM) [Seite 21↓]eingesetzt. Um zu zeigen, dass die beobachteten Effekte ihre Ursache in der spezifischen Hemmung des Proteasoms hatten, wurden zum Vergleich zytoplasmatische Proteasen (Kalpain I und II, Kathepsin B und L) mit dem zellpermeablen Inhibitor ALLM gehemmt.

2.3 Zelllyse und Proteinextraktion

2.3.1 Materialien

· RIPA-Puffer:

150 mM NaCl

1% NP40

0,5% Natriumdesoxychelat

0,1% Natriumdodezylsulfat (SDS)

50 mM Tris

pH 8 (HCl)

· Proteinextraktionspuffer:

4% complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche)

in RIPA

· ERK-Extraktionspuffer:

4% complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche)

10 mM NaF

1 mM Na3OV4

in RIPA

· Zentrifugenröhrchen, 12 ml

Falcon

· Zentrifugenröhrchen, 1,5 ml

Eppendorf

2.3.2 Durchführung

2.3.2.1 Zelllyse nach Langzeitstimulation

Die Zellen wurden dreimal mit 2 ml PBS/ well gewaschen. Zum Ablösen der Zellen von der Kulturschale wurden sie nach vollständigem Absaugen des PBS 5-7 min bei 37°C mit 400 µl Trypsin pro well inkubiert. Nun wurden 6 ml M199 mit 10% NBCS hinzugegeben und die Zellsuspension in 12 ml-Zentrifugenröhrchen über[Seite 22↓]führt. Nach zehn Minuten Zentrifugieren bei 119 x g (1000 U/ min) wurde der Überstand abgesaugt, das Pellet in 1 ml PBS resuspendiert, erneut zentrifugiert (10 min, 119 x g) und der Überstand abgesaugt. Das Pellet wurde nun in 50 µl Proteinextraktionspuffer resuspendiert und in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß überführt. Um Zelldebris zu pelletieren, wurde das Zelllysat nach 30 Minuten Inkubation bei 4°C mit 15.000 x g (14.000 U/ min) für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß überführt und bis zur weiteren Bearbeitung bei -70°C eingefroren.

2.3.2.2 Zelllyse nach Kurzzeitstimulation

Die Kurzzeitstimulationen dienten der Untersuchung des Aktivierungszustandes der zur Familie der mitogen activated protein kinases gehörenden extracellular signal regulated kinases 1/2 (ERK, MAPK p44/42). Diese Enzyme werden durch Phosphorylierung aktiviert. Da die inaktivierenden Phosphatasen der Zellen äußerst schnell arbeiten, musste die Lysezeit möglichst kurz gehalten werden. Darüber hinaus wurden dem Lysepuffer Phosphatase-Inhibitoren (NaF, Na3OV4) zugesetzt

Nach dem Ende der Inkubationszeit wurden die Zellen einmal mit 2 ml PBS pro well gewaschen, mit 150 µl ERK-Extraktionspuffer überschichtet und 20 Minuten auf Eis inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen abgeschabt, in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäße überführt und weitere 15 Minuten auf Eis stehen gelassen. Anschließend wurde das Zelllysat 20 Minuten bei 15.000 x g (14.000 U/ min) bei 4°C zentrifugiert. Der entstandene Überstand wurde in ein neues 1,5 ml-Eppendorfgefäß überführt und ebenfalls bei -70°C eingefroren.


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2.4  Bestimmung der Proteinkonzentration

2.4.1 Materialien

·Coomassie Plus Protein Assay Reagent

Pierce

· PS Microplatte 96 well

Greiner Labortechnik

· Bovines Serumalbumin (BSA)

Sigma

·Photometer anthos htIII

anthos labtec instruments

·WinRead 2.0

anthos labtec instruments

2.4.2 Durchführung

Die Messung der Proteinkonzentration erfolgte nach der Bradford-Methode. Von den Proteinextrakten wurden 2 µl Aliquots abgenommen und in 18 µl Aqua bidest. gelöst. 10 µl dieser Lösung wurden zu 200 µl Coomassie-Reagenz in einer 96-Loch-Platte gegeben. Nach vorsichtigem Schwenken der Platte wurden die Proben zügig im Photoextinktiometer bei einer Wellenlänge von 595 nm gemessen. Das Messprinzip beruht auf einem Proteinkonzentrations-abhängigen Farbumschlag von dunkelgrün zu blau (Absorptionswechsel von 465 zu 595 nm), der durch Bildung von Coomassie-Protein-Komplexen entsteht. Gemessen wurde grundsätzlich in Doppelwerten; zur Ermittlung einer Eichkurve dienten Proteinstandards aus bovinem Serumalbumin in einer Konzentration von 0,1-0,7 µg/ µl. Als Leerwert wurde reines Coomassie verwendet. Die Auswertung der gewonnenen Extinktionswerte erfolgte mit der Software WinRead 2.0.

2.5 Western Blots

2.5.1 Materialien

·Acrylamid (aus Acrylamid und Bisacrylamid), Rotiphorese Gel 29:1 (40%)

Carl Roth GmbH & Co.

· Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

Serva Feinbiochemica

·N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin (TEMED)

Sigma

·Ammoniumperoxydisulfat (APS)

Sigma

· Proteinmarker, 6,5-175 kDa

New England Biolabs

· Tischmixer Vortex-Genie 2

Scientific Industries

·Tischzentrifuge 5415C

Eppendorf

· Elektrophoresekammern

Sigma-Aldrich Techware

· Elektrophorese Stromversorgungsgerät

EPS 600

Pharmacia Biotech

·Roti-Block

Carl Roth GmbH & Co.

· Blotkammer: Semi-Dry Transfer Cell Trans-Blot SD

Bio-Rad

·Thermomixer 5437

Eppendorf

·Wippe Biometra WT12

Biometra

·Enhanced Chemiluminescence Lösung

Amersham

· Film X-Omat Blue XB-1, 18 x 24 cm

Kodak

· Entwicklermaschine Hyperprocessor

Amersham

·Scanner ScanMaker 4

Microtek

· Densitometrie ImageMaster 1D Prime, Version 2.01, © 1996-97 Nonlinear Dynamics, Ltd.

Hoefer Pharmacia Biotech


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2.5.1.1  Lösungen

· Tris gepufferte Salzlösung (TBS):

50 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
150 mM NaCl
pH 7,4 HCl

·5x SDS-Probenpuffer:


60 mM Tris pH 6,8
25% Glycerol (Sigma)
5% β-Mercaptoethanol (Serva)
2% SDS
0,1 % Bromphenolblau (Serva)

·SDS-Laufpuffer:

2,5 mM Tris

19,2 mM Glycin

0,01% SDS

pH 8,8

·Transferpuffer:

20% Methanol

2 mM Tris

15 mM Glycin

·Waschpuffer:

0,02% Tween 20 (Aldrich) in TBS

·Blockpuffer:

5% Skim Milk (Difco)

0,01% Gelatine (Merck)

1% BSA (Sigma)

0,02% Tween 20 (Aldrich)

·Strip-Lösung:

0,2 M Glycin/ HCl pH 2,4

0,1% SDS

1% Tween 20

Tabelle 3: Erstantikörper

Antikörper, Eigenschaften

Verdünnung

eingesetzte

Proteinmenge

Hersteller

MHC

Maus, monoklonal, IgG1, Klon: A4.951

1:100

40 µg

Alexis Biochemicals

ERK 1/2 (p44/42 MAPK)

Kaninchen, monoklonal, Thr 202/ Tyr 204

1:1000

30 µg

Cell Signaling Technology, New England Biolabs Inc.

phospho-ERK 1/2

Maus, monoklonal, Thr 202/ Tyr 204, spezifisch für phosphorylierte ERK 1/2

1:1000

30 µg

Cell Signaling Technology, New England Biolabs Inc.

-smooth muscle actin
Maus, monoklonal, IgG2a

1:500

20 µg

Sigma

-sarcomeric actin
Maus, monoklonal, Klon: 5C5

1:500

10 µg

Sigma

Ubiquitin

Kaninchen

1:1000

40 µg

Dako

Tabelle 4: Zweitantikörper

Antikörper

Eigenschaften

Verdünnung

Hersteller

anti-Maus

Esel, IgG

Meerrettich-Peroxidase konjugiert

1:10.000

Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., via Dianova

anti-Kaninchen

Esel

Meerrettich-Peroxidase konjugiert

1:10.000

Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., via Dianova

2.5.2 Durchführung

Western Blots ermöglichen den quantitativen Nachweis spezifischer Proteine. Dafür werden diese zunächst durch Aufkochen und Zugabe von Natriumdodezylsulfat (SDS) denaturiert. Das negativ geladene SDS, welches sich proportional zum Mo[Seite 27↓]lekulargewicht der Proteine an diese bindet, verleiht den Proteinen eine negative Außenladung. Dies ermöglicht das Auftrennen der Proteine nach ihrer Größe in einer Gelelektrophorese nach Laemmli, bei welcher die Proteine in einem elektrischen Feld wandern. Anschließend werden die Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid-Membran (PVDF) übertragen („geblottet“) und mit Hilfe spezifischer Antikörper nachgewiesen.

2.5.2.1 Präparation der Polyacrylamidgele

Da die eingesetzte Acrylamidkonzentration den Vernetzungsgrad der Gele und somit die Laufeigenschaften der Proteine beeinflusst, wurde sie an die Größe der nachzuweisenden Proteine angepasst. Für Western Blots Analysen von ERK 1/2 wurden 12%-Gele verwendet. Die Quantifizierung von β-myosin heavy chain, α-sarcomeric actin, α-smooth muscle actin und Ubiquitin erfolgte unter Einsatz von 8%-Gelen. Tabelle 5 gibt hierzu die Zusammensetzung der jeweiligen Gele wider.

Tabelle 5: Zusammensetzung der Polyacrylamidgele

 

8%-Trenngel

12%-Trenngel

Sammelgel

40% Acrylamid

5 ml

7,5 ml

2,5 ml

1,5 M Tris pH 8,8

6,25 ml

6,25 ml

1 M Tris pH 6,8

2,5 ml

H2O

13,25 ml

10,8 ml

14,6 ml

10% SDS

0,25 ml

0,25 ml

0,2 ml

APS

0,2 ml

0,2 ml

0,2 ml

TEMED

12 µl

8 µl

20 µl

2.5.2.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Eine vom nachzuweisenden Protein abhängende Proteinmenge wurde ad 20 µl in RIPA gelöst und mit 5 µl 5x SDS-Probenpuffer versetzt. Nach fünfminütigem Erhit[Seite 28↓]zen bei 95°C im Thermocycler wurden die Proben kurz anzentrifugiert, abgekühlt und in die Geltaschen pipettiert. Nun wurde die Elektrophorese bei 20 mA/ Gel gestartet. Je nach Proteingröße und Geltyp dauerte die Proteinauftrennung eine bis anderthalb Stunden. Daraufhin wurden die Gele aus den Kammern entnommen, zurechtgeschnitten und mit Blotpuffer inkubiert.

2.5.2.3 Blotten

Hierbei wurden die im Gel aufgetrennten Proteine mit Hilfe eines elektrischen Feldes auf eine Polyvinylidenfluoridmembran (PVDF) übertragen. Dazu wurden eine PVDF-Membran und sechs Whatman-Papiere auf etwa Gelgröße zurechtgeschnitten. Zur Aktivierung wurde die PVDF-Membran eine Minute in Methanol, zwei Minuten in Aqua bidest. und fünf Minuten in Blotpuffer geschwenkt. Die Whatmanpapiere wurden ebenfalls mit Blotpuffer angefeuchtet.

Nun wurden drei Whatmanpapiere auf den als Anode dienenden Boden der Blotkammer gelegt, darauf die PVDF-Membran, darauf das Gel und abschließend kathodenseitig wieder drei Whatmanpapiere. Für das elektrische Feld wurde ein konstanter Strom von 350 mA über ein bis anderthalb Stunden gewählt.

2.5.2.4 Antikörperbindung

Um eine unspezifische Bindung der Antikörper an die PVDF-Membranen zu verhindern, wurden die Membranen zwei Stunden bei Raumtemperatur in 10 ml Western Blot Block Puffer (MAPK-Blots in Roti Block) geschwenkt. Dieser enthält eine hohe Konzentration unspezifischer Proteine, die die freien Bindungsstellen auf der PVDF-Membran besetzen. Daraufhin wurden die Membranen über Nacht bei 4°C mit den entsprechenden, in Blockpuffer gelösten Antikörpern (siehe Tabelle 3) unter leichtem Schwenken inkubiert.

Am Folgetag wurden die Membranen 40 Minuten mit 10 ml Western Blot Waschpuffer (viermaliger Pufferwechsel) gewaschen und danach zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einer Wippe mit dem Zweitantikörper inkubiert. Nach einer [Seite 29↓]weiteren Waschphase über 60 Minuten (viermaliger Pufferwechsel) wurden die Membranen eine Minute in der Enhanced Chemiluminescence Lösung (ECL) geschwenkt und kurz mit Western Waschpuffer gespült. Die am zweiten Antikörper gebundene Meerrettich-Peroxidase oxidiert das Luminol des ECL. Das durch die Oxidation angeregte Luminol fällt anschließend unter Lichtemission in den Grundzustand zurück. Das ausgesandte Licht wurde mittels Filmauflage registriert. Die entwickelten Filme wurden am Computer gescannt und mit der Software ImageMaster 1D densitometrisch ausgewertet.

2.5.2.5 Strippen der Western Blots

Bei Western Blot Analysen des Aktivierungszustands der ERK 1/2 wurde zunächst die Menge der phosphorylierten Enzyme bestimmt. Im Anschluss wurden die Membranen „gestrippt“, d. h. die Antikörperbindungen wurden wieder gelöst, so dass durch Inkubation mit dem Erstantikörper gegen nicht-phosphorylierte ERK deren Menge zum späteren Abgleich quantifiziert werden konnte. Dazu wurden die Membranen eine Stunde in Strip-Lösung geschwenkt und anschließend zweimal für 5 Minuten mit Western Blot Waschpuffer gewaschen. Im Weiteren konnte das oben beschriebene Protokoll (ab Blockieren in Blockpuffer) angewendet werden.

2.6 Morphometrie

2.6.1 Materialien

·Phalloidin, FITC- oder TRITC-konjugiert (1 µg/ µl in Methanol)

Sigma

· Paraformaldehyd (PFA, 4% in PBS)

Sigma

· Fluoreszenzmikroskop Axiovert S100

Zeiss

· Filter: G 365 FT 395 LP 420; I 450-490 FT 510 515-565; III BP 546 FT 580 LP 590

Zeiss

· Kamera: Sony MC-3254

Sony

· Morphometrie-Software Scion Image Beta 4.0.2, © 2000, basierend auf NIH Image von Wayne Rasband

Scion Corporation

· Permeabilisierungspuffer:

1% t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton)

50 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

150 mM NaCl

pH 7,4 HCl

2.6.2 Durchführung

2.6.2.1 Phalloidinfärbung

Um eine Computer-gestützte Morphometrie zu ermöglichen, wurden die Zellen mit Phalloidin gefärbt. Dabei handelt es sich um ein Gift des Pilzes Amanita phalloides, das in Muskelzellen an das F-Aktin bindet. An das verwendete Phalloidin war entweder der fluoreszierende Farbstoff FITC (Erregung bei 495 nm, Emission bei 513 nm) oder der ebenfalls fluoreszierende Farbstoff TRITC (Erregung bei 540-545 nm, Emission bei 570-573 nm) gebunden. Die Zellen wurden 48 Stunden nach Beginn der Stimulation zweimal mit 2 ml PBS pro well gewaschen und 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 1 ml Paraformaldehyd inkubiert. Nach zwei weiteren Waschschritten mit PBS wurden die Zellen 10 Minuten mit 1 ml Permeabilisierungspuffer pro well unter leichtem Schwenken bei Raumtemperatur behandelt. Im Anschluss wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und für 30 Minuten mit FCS (1% in PBS) blockiert. Nach Absaugen des Blotpuffers wurden die Zellen für eine Stunde bei 37°C mit 400 µl der Phalloidinlösung (1:200 in PBS verdünnt) inkubiert. Abschließend wurden die Zellen wiederum dreimal mit PBS gewaschen.

2.6.2.2 Ermittlung der Zellgröße

Mit dem Fluoreszenzmikroskop wurden unter Verwendung der 10er Optik pro Stimulation zehn zufällig ausgewählte Sichtfelder fotografiert und mit der Software [Seite 31↓]Scion Image morphometrisch ausgewertet. Das Programm berechnet dabei alle umschlossenen Flächen, die in einem bestimmten, vom Benutzer gewählten Farbbereich („Density Slice“) liegen und eine gewisse Mindestgröße, um Zellschrott auszuschließen, überschreiten (siehe Abbildung 5).

Abbildung 5: Mit FITC-konjugiertem Phalloidin gefärbte NRC (a) und mit Scion Image bestimmte Zellfläche (b).

2.7 Transiente Transfektionen mit Reportergenkonstrukten

2.7.1 Materialien

· FuGene 6 Transfection Reagent

Roche

· Lipofectin

GibcoBRL Life Technologies

· DOTAP Liposomales Transfektionsreagenz

Roche

· SuperFect

Qiagen

2.7.1.1 Plasmide

· pEGFP-N3

Clontech

· UbG76V-GFP

pEGFP-N3 modifiziert nach Stack et al. 2000

· pGL2 NFκB mu2 luc

 
 

NFκB-Bindungsstelle:

5’-TTC CCG GGA AAG AGG GGA CTT TCC GCT GGG ACT TTC CGA GCT AAG ATC TAG-3’

ProMega

· pGL2 AP1 luc

 
 

AP1-Bindungsstelle:

5’-TTC CCG GGA AAG AGT GAC TCA GCT TGA CTC AGA GCT AAG ATC TAG-3’

ProMega

· pGL3 hBNP luc

Konstrukt zur Verfügung gestellt von Dr. H. Bartsch (hBNP-Promoter nach Ogawa et al. 1995, pGL3 von ProMega)

2.7.2 Durchführung

Um die Kardiomyozyten effizient und schonend zu transfizieren, wurden liposomale Transfektionsreagenzien verwendet. Das dieser Methode zugrunde liegende Prinzip beruht auf der Ausbildung von Transfektionsreagenz-DNA-Komplexen, welche per Endozytose von den Zellen aufgenommen werden.

Da sich in der Literatur nur wenig Erfahrungen zum Einsatz von liposomalen Transfektionsreagenzien bei neonatalen Rattenkardiomyozyten fanden, wurden verschiedene Reagenzien unter wechselnden Bedingungen (siehe Tabelle 6) getestet. Transfiziert wurden die Zellen mit einem GFP-Konstrukt (pEGFP-N3, Clontech). Bei GFP handelt es sich um ein grün fluoreszierendes Protein (green fluorescent protein), welches ursprünglich aus Aequorea victoria, einer im Pazifik vorkommenden Quallenart, extrahiert wurde. Das Protein besteht aus 238 Aminosäuren und hat sein Absorptionsmaximum bei 395 nm und sein Emissionsmaximum bei 508 nm. Zur Abschätzung der Transfektionseffizienz wurde nach 48 Stunden der Anteil der fluoreszierenden Zellen pro Sichtfeld bestimmt. Dabei wurden pro Versuch zehn zufällig ausgewählte Sichtfelder ausgezählt.

Die Protokolle der einzelnen Transfektionsreagenzien unterschieden sich nur geringfügig. Allen gemein war die erforderliche Dichte der Zellen von etwa 60-80% [Seite 33↓]Konfluenz, der Beginn der Transfektion 24 Stunden nach dem Ausplattieren und ein Inkubationsschritt bei Raumtemperatur nach Zusammenbringen von DNA und Reagenz. Dieser Schritt ist notwendig, um die Ausbildung der DNA-Reagenz-Komplexe zu ermöglichen.

Die Transfektionsprotokolle der einzelnen Substanzen lauten wie folgt:

  1. DOTAP
    Die benötigte Menge DNA wurde in PBS zu einer Endkonzentration von 0,1 µg DNA/ µl verdünnt. Die eingesetzte Menge DOTAP wurde ad 100 µl in PBS gelöst. Beide Lösungen wurden zusammengebracht, vorsichtig durchmischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gemisch wurde nun zum serumfreien Medium hinzugegeben und die Zellen 6 Stunden inkubiert.
  2. SuperFect
    Die eingesetzte Menge DNA wurde ad 100 µl in PBS verdünnt. Nach kurzem Anzentrifugieren wurde SuperFect hinzugegeben und die Mischung nach 10 Minuten Inkubation in 600 µl serumhaltigen Medium (10% NBCS) gelöst. Die Kardiomyozyten wurden nun drei Stunden mit dem fertigen Mix inkubiert.
  3. FuGene
    Die verwendete Menge FuGene wurde ad 100 µl in PBS verdünnt. Anschließend wurde die DNA hinzugegeben und die Lösung vorsichtig durchmischt. Nach 15-minütiger Inkubation wurde das Gemisch tropfenweise zu den Zellen gegeben. Im Gegensatz zu allen anderen Transfektionsreagenzien gab es beim Einsatz von FuGene keine festen Inkubationszeiten, vielmehr konnten die FuGene-DNA-Komplexe für den gesamten Versuchszeitraum im Medium belassen werden.
  4. Lipofectin
    DNA und Lipofectin wurden jeweils ad 100 µl in PBS verdünnt. Nach 45-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden beide Lösungen vereinigt, vorsichtig durchmischt und für weitere 15 Minuten inkubiert. Nach Hinzufügen von 800 µl serum- und antibiotikafreien Mediums wurde der DNA-Lipofectin-Mix zu den Zellen gegeben. Die sich anschließende Inkubation betrug 6 Stunden.

Nach den jeweiligen Inkubationszeiten wurden die Zellen einmal mit 2 ml PBS pro well gewaschen (Ausnahme: FuGene) und mit 10% NBCS enthaltendem Medium behandelt. 48 Stunden nach Beginn der Transfektion wurde die Transfektionseffizienz wie oben bereits beschrieben bestimmt.

Tabelle 6: Effizienz der getesteten Transfektionsreagenzien

Reagenz

DNA-Menge

[µg/ ml Medium]

Reagenzmenge

[µl/ ml Medium]

Anteil fluoreszierender Zellen nach 48h [%]

DOTAP

1,25

10

10

 

3

15

10

 

4

20

10

SuperFect

2,9

14,3

1

 

1,4

7,1

<1

FuGene

1

1,5

10

 

0,5

3

12

 

0,5

1,5

8

 

1

5

10

 

1

3

3

Lipofectin

1

5

3

 

2

10

27

 

2

20

3

Wie der Tabelle 6 zu entnehmen ist, erwies sich Lipofectin bei diesen Vorversuchen als das effizienteste Transfektionsreagenz, so dass alle weiteren Transfektionsexperimente mit dieser Substanz durchgeführt wurden. Dabei wurden jedoch in Abhängigkeit vom zu transfizierenden Plasmid einige Parameter des ursprüngli[Seite 35↓]chen Protokolls verändert.

Die einzelnen, eingesetzten Plasmide werden im Folgenden beschrieben.

  1. UbG76V-GFP
    Bei diesem Plasmid handelt es sich um ein Konstrukt aus Ubiquitin und dem bereits beschriebenen GFP. Das Konstrukt ist dabei derart modifiziert, dass intrazelluläre Ubiquitin-Hydrolasen das Ubiquitin nicht vom GFP abspalten können. Daher wird das neusynthetisierte, ubiquitinierte GFP unmittelbar nach der Translation vom Proteasom abgebaut, so dass auch erfolgreich transfizierte Zellen im Fluoreszenzmikroskop nicht zu erkennen sind. Wird das Proteasom jedoch gehemmt, so akkumulieren Ubi-GFP-Proteine. Die Stärke der Fluoreszenz sowie die Anzahl der fluoreszierenden Zellen können nun als Maß für die Inhibition des Proteasoms genutzt werden.
    Die Transfektion mit UbG76V-GFP wurde 24 Stunden nach Ausplattieren begonnen. Nach Ende der 6-stündigen Inkubationsdauer wurden die Zellen 18 Stunden mit serumfreiem Medium behandelt und im Anschluss stimuliert. Nach weiteren 24 bzw. 48 Stunden wurde der Anteil der fluoreszierenden Zellen am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Dazu wurden 10 zufällig ausgewählte Sichtfelder (5er Optik) fotografiert.
  2. pGL2 AP1 luc
    Bei diesem Plasmid sind die Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors AP1 (activating protein 1) und das Gen für das Enzym Luciferase miteinander verknüpft. AP1 gehört zur Gruppe der so genannten „immediate early genes“ und spielt eine Rolle in der Expressionsregulation von Zellzyklusregulatoren. Das Enzym Luciferase entstammt der südamerikanischen Feuerfliege, Photinus pyralis. Es katalysiert eine Reaktion mit einem Luciferin genannten Substrat, die unter Lichtemission erfolgt. Die Menge synthetisierter Luciferase ist proportional zur transkriptionellen Aktivität des Promoters und somit proportional zur RNA-Synthese der Gene, denen der gleiche Promoter vorgeschaltet ist.
    Die Transfektion wurde 24 Stunden nach dem Ausplattieren gestartet; die Inkubationszeit mit pGL2 AP1 luc betrug 3 Stunden. Nach 21-stündiger Inkubation mit serumfreiem Medium wurden die Zellen stimuliert und nach 24 Stunden geerntet.
  3. pGL2 NFκB mu2 luc
    Dieses Plasmid trägt zwei Bindungsstellen des Transkriptionsfaktors nuclear factor kappa B (NFκB) verbunden mit dem Luciferase-Gen.
    Das Transfektionsprotokoll entsprach ebenfalls dem von pGL2 AP1 luc.
  4. pGL3 hBNP
    Beim brain natriuretic peptide handelt es sich um ein Markergen der kardialen Hypertrophie.
    Für die Transfektion mit diesem Plasmid wurden die Zellen 24 Stunden nach dem Ausplattieren für 24 Stunden serumfrei gesetzt. Nun folgte die Transfektion. Unmittelbar an die 3-stündige Inkubation schloss sich die Stimulation an. 24 Stunden nach Stimulationsbeginn wurden die Zellen geerntet.

2.8 Luciferase-Assays

2.8.1 Materialien

· Luminometer Lumat LB 9501

berthold

· Luciferase-Assay Kit (Reporter Lysis Buffer, Luciferase-Substrat)

ProMega

2.8.2 Durchführung

Um die Luciferase-Synthese zu quantifizieren, wurden die Zellen nach dem Ende der Stimulation einmal mit 2 ml PBS pro well gewaschen und mit 250 µl Reporter Lysis Buffer pro well lysiert. Nach Abschaben der Zellen und Überführen in ein 1,5 ml-Eppendorfgefäß wurde das Lysat 15 Sekunden gevortext, 15 Sekunden bei 12.000 x g (14.000 U/ min) zentrifugiert und der Überstand in ein neues 1,5 ml-[Seite 37↓]Eppendorfgefäß überführt.

Zur Messung der Luciferase-Aktivität wurden 100 µl Luciferase Assay Substrat und 20 µl des Zelllysats in ein Probenröhrchen pipettiert. Nach 5 Sekunden wurde für 10 Sekunden die Lichtemission mit dem Luminometer gemessen. Da das Substrat im Überschuss eingesetzt wurde, war die Menge des ausgesandten Lichts proportional zur Enzymmenge.

2.9 Messung der Aktivität des Proteasoms mit Hilfe fluorogener Substrate

2.9.1 Materialien

· Fluorogenes Substrat Suc-LLVY-MCA (Succinyl-Leucin-Leucin-Valin-Tyrosin-4-Methyl-7-Coumarylamid, 2 mM)

Bachem

·Methylcoumarylamid (MCA)

Bachem

·Fluoreszenzmessgerät FLX 800

Biotek

· 96 well Platten, schwarz

E & K scientific

· 3x 26S-Inkubationspuffer:

450 mM Tris HCl, pH 8,2
90 mM KCl
15 mM Mg(CH3COO)2
15 mM MgCl2

·Reaktionsansatz:

60 µl 3x 26S-Inkubationspuffer
0,22 µl 0,5 M Dithiothreitol (DTT)
6 µl 100 mM Adenosintriphosphat (ATP)
0,5 µl 1 M Phosphokreatin
0,2 µl Phosphokreatinkinase (1 U/ µl)
10 µl 2 mM Suc-LLVY-MCA
23,3 µl H2O

Sigma

Boehringer

Calbiochem

Sigma


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2.9.2  Durchführung

Das Prinzip der hier angewendeten Methode zur Bestimmung der Aktivität des Proteasoms beruht auf der Eigenschaft bestimmter Substrate des Proteasoms, erst nach Abbau durch Proteasomen zu fluoreszieren. Gibt man nun diese so genannten fluorogenen Substrate im Überschuss zu isolierten Proteasomen bzw. Zelllysaten, so ist die messbare Fluoreszenz proportional zur Aktivität der Proteasomen.

Zur Isolation der Proteasomen wurden die Kardiomyozyten nach einer 48-stündigen Stimulation zweimal mit 2 ml PBS/ well gewaschen. Nach vollständigem Absaugen des PBS wurden die Zellen mit 80 µl Aqua bidest. überschichtet und abgeschabt. Zur vorsichtigen Lyse wurde die Zellsuspension dreimal in flüssigem Stickstoff (-196°C) eingefroren und wieder aufgetaut. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 15.000 x g (14.000 U/ min) und 4°C wurde der Überstand abgenommen und das Pellet verworfen.

Im Anschluss wurde die Proteinkonzentration bestimmt. Zur Messung wurden pro Probe 10 µg Protein ad 20 µl Aqua bidest. verdünnt und in eine schwarze 96 well-Platte pipettiert (Dreifachwerte). Nun wurde der frisch angesetzte Reaktionsansatz hinzugefügt, die Platte in Aluminiumfolie eingewickelt und nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C die Fluoreszenz bestimmt. Als Standards diente reines MCA (0,25 µM, 0,5 µM, 1 µM, 2 µM und 3 µM); die Leerwerte wurden mit Aqua bidest. gemessen.

2.10 Synthesemessungen mittels Substratinkorporation

2.10.1 Materialien

· L-[3,4,5-3H(N)]-Leucin, 6,3 TBq/ mmol = 170 Ci/ mmol, 1 µCi/ µl

Perkin Elmer Life Sciences

·[5,6-3H]-Uridin, 1,6 TBq/ mmol = 44,5 Ci/ mmol, 1 µCi/ µl

Perkin Elmer Life Sciences

·α-Amanitin

Sigma

· rotiszint eco plus

Carl Roth GmbH & Co.

· Trichloressigsäure (TCA, 20% und 5% in H2O)

Sigma

·Szintillationscounter Wallac 1409

PerkinElmer Life Sciences

2.10.2 Durchführung

Die durchgeführten Inkorporationsversuche dienten der Analyse der Protein- bzw. RNA-Synthese der Kardiomyozyten. Zur Messung der Proteinsynthese wurden dem Medium für die letzten drei Stunden einer Stimulation 5 µCi/ ml der mit Tritium radioaktiv markierten Aminosäure Leucin zugesetzt. Analog dazu wurden zur Quantifizierung der RNA-Synthese die NRC in den letzten drei Stunden einer Stimulation mit 5 µCi/ ml des radioaktiv markierten Nukleosids Uridin inkubiert. Je nach Syntheseleistung wurde nun mehr oder weniger des angebotenen Substrats von den Zellen zum Aufbau von Proteinen bzw. RNA verwendet. Zur Messung der inkorporierten Nuklide wurden die Zellen nach Beendigung der Stimulation einmal mit 2 ml PBS pro well gewaschen und mit 200 µl RIPA pro well 15 Minuten auf Eis lysiert. Nach Abschaben und Überführen in 2 ml-Zentrifugenröhrchen wurden 250 µl eiskalte 20% TCA zum Lysat gegeben. Anschließend wurde das Lysat weitere 15 min auf Eis stehen gelassen und für 20 min bei 12.000 x g (14.000 U/ min) zentrifugiert. Der entstandene Überstand wurde verworfen und das Pellet in 250 µl 5% TCA resuspendiert. Es folgte ein weiterer 20-minütiger Zentrifugenschritt bei 12.000 x g (14.000 U/ min). Nach Abnahme des Überstands wurde das entstandene Pellet in 250 µl 0,2 N NaOH resuspendiert und 2 Minuten bei 50°C im Thermomixer geschüttelt. Nun wurden 1,4 ml des Szintillationscocktails hinzugefügt. Die Hüllelektronen der im Cocktail enthaltenen Moleküle werden durch die β-Strahlung des Tritium angeregt und fallen nach 10-8 Sekunden unter Lichtemission auf ihren ursprünglichen Zustand zurück. Dies wurde für 60 Sekunden im Szintillationscounter gemessen.

Um bei der RNA-Synthese eine Unterscheidung zwischen mRNA- und rRNA-Synthese zu ermöglichen, inhibierten wir die DNA-abhängige RNA-Polymerase II, die für die Synthese der mRNA verantwortlich ist, mit 2,5 µg/ ml α-Amanitin.


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2.11  Statistische Auswertung

Die ermittelten Daten wurden mit der Software SigmaStat (Version 2.0, Jandel Corporation © 1992-1995) auf signifikante Unterschiede hin untersucht. Dazu wurden einfaktorielle Varianzanalysen (ANOVA) und t-Tests durchgeführt.


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27.11.2003