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3  Ergebnisse

Um einen möglichen antihypertrophen Effekt der Proteasominhibitoren zu zeigen, wurden die Kennzeichen einer Hypertrophie kardialer Myozyten, d. h. Flächenzunahme, Erhöhung des Gehalts bestimmter Markerproteine, Veränderung der Genexpression und gesteigerte RNA- und Proteinsynthese untersucht.

Dabei konnte durch morphometrische Analysen der Zellfläche die dosisabhängige Verminderung des Zellwachstums bei Inkubation mit Proteasominhibitoren gezeigt werden. Weiterhin gelang es durch Western Blot Analysen, die dosisabhängige Abnahme der Hypertrophiemarkerproteine β-myosin heavy chain, α-sarcomeric actin und α-smooth muscle actin nach Behandlung mit Proteasominhibitoren nachzuweisen. Die verminderte Expression des Markergens BNP konnte durch Transfektion mit einem Reportergenkonstrukt dokumentiert werden. Schließlich konnte durch die verminderte Inkorporation radioaktiv markierter Substrate nach 24-stündiger Inkubation mit Proteasominhibitoren eine deutlich verringerte RNA- und Proteinsynthese belegt werden. Darüber hinaus zeigte sich nach Hemmung der mRNA-Synthese eine Abnahme der rRNA-Synthese.

Die effiziente Blockierung des Proteasoms wurde durch Quantifizierung polyubiquitinierter Proteine mittels Western Blots, durch Messung der Fluoreszenz nach Transfektion mit UbG76V-GFP und durch Bestimmung der proteasomalen Aktivität mittels fluorogener Substrate dokumentiert.

Zur Aufdeckung der Mechanismen, die dem antihypertrophen Effekt der Hemmung des Proteasoms zugrunde liegen, wurde zunächst die Aktivierbarkeit der zur Familie der mitogen activated protein kinases (MAPK) gehörenden extracellular signal regulated kinases 1/2 (ERK 1/2, auch MAPK p44/42) mit Western Blot Analysen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Aktivierbarkeit dieser für die Signaltransduktion in der Entstehung von Hypertrophie eminent wichtigen Enzyme durch Proteasominhibitoren drastisch reduziert wird.

Des Weiteren zeigten Versuche mit Reportergenkonstrukten eine reduzierte Aktivität des Transkriptionsfaktors NFκB. Demgegenüber bewirkte die Hemmung des Proteasoms eine verstärkte Aktivität des Transkriptionsfaktors AP1.


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3.1  Untersuchung der Kennzeichen der Hypertrophie

3.1.1 Morphometrische Auswertung der Zellfläche

Abbildung 6: Mit 10% FCS und verschiedenen Inhibitoren über 48 Stunden behandelte und mit Phalloidin-FITC gefärbte NRC. a: Kontrolle, b-f: 10% FCS, c: 1 µM ALLM, d: 0,1 µM MG262, e: 1 µM MG262, f: 1 µM MG132.


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Zur Quantifizierung der beobachteten Wachstumsverringerung der Kardiomyozyten nach Inkubation mit Proteasominhibitoren wurden Phalloidin-gefärbte NRC mittels Morphometrie analysiert (Abbildung 6).

Dazu wurden neonatale Rattenkardiomyozyten für 48 Stunden mit 10% FCS allein und kombiniert mit verschiedenen Inhibitoren behandelt. Um die Spezifität des beobachteten Effekts zu überprüfen, verwendeten wir zwei Proteasominhibitoren, MG132 und MG262, und einen Inhibitor zytoplasmatischer Proteasen (ALLM). Ausschließlich mit FCS inkubierte Zellen zeigten hierbei gegenüber den unbehandelten Kontrollen einen Flächenzuwachs von 112% (p < 0,001), welcher durch Zugabe von Proteasominhibitoren dosisabhängig verringert werden konnte. So reduzierte sich die durchschnittliche Zellfläche im Vergleich zu ausschließlich mit FCS behandelten Zellen durch Zugabe von MG262 um 16% (0,1 µM, p = 0,015) bzw. um 43% (1 µM, p < 0,001). Behandlung mit 1 µM MG132 führte zu einer Flächenreduktion um 41% (p < 0,001). Der Einsatz von 1 µM ALLM zeigte dagegen keinen signifikanten Effekt auf die Zellfläche (p = 0,170) (Abbildung 7).

Abbildung 7: Veränderung der Zellfläche nach Behandlung mit 10% FCS allein und kombiniert mit ALLM, MG132 oder MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SD (n = 10) genormt auf die Kontrolle.


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Abbildung 8: Mit 10 µM Isoproterenol und 0,05-1 µM MG132 über 48 Stunden behandelte und mit Phalloidin-FITC gefärbte NRC. a: Kontrolle, b-f: 10 µM Isoproterenol, c: 0,05 µM MG132, d: 0,1 µM MG132, e: 0,5 µM MG132, f: 1 µM MG132.

Im folgenden wurde der dosisabhängige Effekt des Proteasominhibitors MG132 auf mit Isoproterenol induzierter Hypertrophie untersucht. Dazu wurden die Zellen 48 Stunden mit 10 µM Isoproterenol allein und zusammen mit 50 nM, 100 nM, 0,5 [Seite 45↓]µM bzw. 1 µM MG132 behandelt (Abbildung 8).

Dabei zeigte sich analog zur mit Serum induzierten Hypertrophie eine Flächenzunahme der mit Isoproterenol stimulierten Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Zellen um 91% (p < 0,001). Diese Zunahme fiel bei Kombination mit MG132 deutlich geringer aus. So resultierte bereits die Zugabe von 50 nM MG132 in einer um 30% (p < 0,001) verminderten Zellfläche (Abbildung 9). 100 nM MG132 bewirkten eine Reduktion um 36% (p < 0,001), 0,5 µM um 44% (p < 0,001) und 1 µM MG132 um 56% (p < 0,001).

Abbildung 9: Veränderung der Zellfläche nach Behandlung mit 10 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SD (n = 10) genormt auf die Kontrolle.

Zum Vergleich mit dem β-Sympathomimetikum Isoproterenol wurde in einer weiteren Versuchsreihe der Einfluss von MG132 auf die Induzierbarkeit von Hypertrophie mit Angiotensin II untersucht (Abbildung 10).


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Abbildung 10: Mit 20 µM Angiotensin II und 0,05-1 µM MG132 über 48 Stunden behandelte und mit Phalloidin-TRITC gefärbte NRC. a: Kontrolle, b-f: 20 µM Angiotensin II, c: 0,05 µM MG132, d: 0,1 µM MG132, e: 0,5 µM MG132, f: 1 µM MG132.

Dabei wurden 20 µM Angiotensin II und 0,05-1 µM MG132 über 48 Stunden eingesetzt. Ermittelt wurde eine Vergrößerung der durchschnittlichen Zellfläche der [Seite 47↓]mit 20 µM Angiotensin II stimulierten NRC im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen um 147% (p < 0,001). Verglichen mit den ausschließlich mit Angiotensin II inkubierten Zellen zeigten die zusätzlich mit MG132 behandelten Zellen wiederum ein dosisabhängig vermindertes Wachstum. 50 nM MG132 führten zu einer Verringerung der Zellfläche um 31% (p < 0,001). Bei 100 nM waren es 44% (p < 0,001), bei 0,5 µM 51% (p < 0,001) und bei 1 µM 54% (p < 0,001). Abbildung 11 zeigt den Effekt von MG132 auf die Zellfläche in relativen Einheiten normiert auf die Kontrolle.

Abbildung 11: Veränderung der Zellfläche nach Behandlung mit 20 µM Angiotensin II allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SD (n = 10) genormt auf die Kontrolle.

3.1.2 Nachweis von Hypertrophiemarkerproteinen

Um zu untersuchen, ob sich die Inhibition des Proteasoms auch auf die Menge ausgewählter Hypertrophiemarkerproteine auswirkt, wurden Western Blot Analysen durchgeführt. Dazu wurden die NRC für 48 Stunden mit 10 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132 behandelt.


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Abbildung 12 zeigt die densitometrisch ausgewerteten Ergebnisse für β-myosin heavy chain (βMHC). Isoproterenol bewirkte hier eine deutliche Zunahme des Proteins im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Diese Erhöhung des Proteingehalts konnte durch gleichzeitige Behandlung mit MG132 dosisabhängig und reproduzierbar verringert werden. Wie aus Abbildung 12 ersichtlich lag die Menge an βMHC bereits bei Koinkubation mit 0,5 µM MG132 unter der der Kontrolle.

Abbildung 12: Veränderung der Proteinmenge von βMHC nach 48-stündiger Stimulation mit 10 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.

Abbildung 13 stellt die Daten der Untersuchung von α-sarcomeric actin (αSA) dar. Hier erreichte Isoproterenol eine massive Erhöhung der Menge an αSA im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Diese starke Zunahme konnte durch Inkubation mit niedrig konzentriertem MG132 nicht verringert werden. Die Verwendung höherer Konzentrationen von MG132 resultierte jedoch wieder in einer dosisabhängigen Reduktion der Proteinmenge.


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Abbildung 13: Veränderung der Proteinmenge von α-sarcomeric actin nach 48-stündiger Stimulation mit 10 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.

Als letztes wurde die Wirkung von Isoproterenol und MG132 auf α-smooth muscle actin (α-Aktin des glatten Muskels, αSMA) untersucht. Dabei konnte keine Zunahme des Proteins durch Behandlung mit Isoproterenol gezeigt werden. Jedoch nahm auch hier die Menge von αSMA durch Inhibition des Proteasoms dosisabhängig ab (Abbildung 14).


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Abbildung 14: Veränderung der Proteinmenge von α-smooth muscle actin nach 48-stündiger Stimulation mit 10 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.

3.1.3 BNP-Expressionsanalyse

Das brain natriuretic peptide (BNP) gilt als Hypertrophiemarker. Bereits kurze Zeit nach Behandlung mit Hypertrophie-induzierenden Stimuli zeigt sich ein starker Anstieg der Expression. Daher wurde mit einem Luciferase-Reportergenkonstrukt (pGL3 BNP luc) die Expression von BNP (brain natriuretic peptide) nach Stimulation mit 50 µM Isoproterenol untersucht. Dabei zeigte sich nach 24 Stunden ein Anstieg der Expression um Faktor 10,5 (p < 0,001). Wurden die Zellen zusätzlich zum Isoproterenol mit 1 µM MG132 behandelt, nahm die Expression im Vergleich zu ausschließlich mit Isoproterenol inkubierten Zellen um 44% (p = 0,003) ab (Abbildung 15).


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Abbildung 15: Expression von BNP nach 24-stündiger Behandlung mit 50 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 1 µM MG132. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 12) genormt auf die Kontrolle.

3.1.4 Messung der Proteinsynthese

Zur Klärung der Frage, welchen Einfluss die Proteasominhibition auf die Hypertrophie-vermittelte Proteinsynthese hat, wurde die Veränderung der Proteinsynthese mittels Inkorporation der mit Tritium radioaktiv markierten Aminosäure Leucin in den letzten 4 Stunden einer Stimulation mit hypertrophen Agonisten wie FCS und Isoproterenol gemessen.

Zunächst wurden NRC für 24 Stunden mit 10% FCS allein und kombiniert mit ALLM, MG132 oder MG262 inkubiert. Dabei zeigte sich ein Anstieg der Proteinsynthese bei den ausschließlich mit FCS stimulierten Zellen im Vergleich zu unbehandelten NRC um 225% (p = 0,01). Wurden die Zellen gleichzeitig mit 1 µM MG132 behandelt, war die Syntheseleistung im Vergleich zur Stimulation mit FCS allein um 43% (p = 0,048) geringer. 1 µM MG262 bewirkte eine um 81% (p = 0,005) verringerte Synthese. Dagegen zeigte sich bei Zugabe von 1 µM ALLM keine signifikante Veränderung (p = 0,307) der Syntheseleistung im Vergleich zu ausschließlich mit FCS behandelten Zellen (Abbildung 16).


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Abbildung 16: Veränderung der Proteinsynthese nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS und ALLM, MG132 bzw. MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 3) genormt auf die Kontrolle.

Bei dem in Abbildung 17a dargestellten Versuch wurden NRC erneut über 24 Stunden mit FCS-haltigem Medium und 0,05-1 µM MG132 inkubiert. Es konnte eine Zunahme der Synthese durch Behandlung mit 10% FCS um Faktor 4,5 (p < 0,001) gezeigt werden. Zugabe von 0,05 µM bzw. 0,1 µM MG132 hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Syntheseleistung im Vergleich zu ausschließlich mit FCS inkubierten NRC (p = 0,252 bzw. p = 0,403). Dagegen resultierten Dosen von 0,5 µM bzw. 1 µM MG132 in einer Verringerung der Synthese um 56% (p = 0,001) bzw. 61% (p < 0,001).

Des Weiteren wurde die Wirkung von Isoproterenol untersucht. NRC wurden dazu mit 100 µM Isoproterenol und 0,05-1 µM MG132 inkubiert. Wie Abbildung 17b zeigt, nahm dabei die Proteinsynthese im Vergleich zu unstimulierten Zellen um 62% (p < 0,001) zu. Wurden die Zellen jedoch zusätzlich mit 0,05 µM MG132 inkubiert, verringerte sich die Synthese im Vergleich zu ausschließlich mit Isoproterenol inkubierten NRC um 57% (p < 0,001). Mit 0,1 µM MG132 fiel die Synthese um 59% (p < 0,001) geringer aus. 0,5 µM bzw. 1 µM MG132 resultierten in einer Verminderung um 60% (p < 0,001) bzw. 69% (p < 0,001).


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Abbildung 17: Veränderung der Proteinsynthese nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS (a) bzw. 100 µM Isoproterenol (b) und 0,05-1 µM MG132. Die Diagramme zeigen Mittelwerte ± SEM (n = 3) genormt auf die Kontrolle.

3.1.5  Messung der RNA-Synthese

Analog zur Untersuchung der Proteinsynthese wurde der Einfluss der Proteasominhibitoren auf die RNA-Synthese mittels Inkorporation des mit Tritium radioaktiv [Seite 54↓]markierten Nukleosids Uridin gemessen.

Wie aus Abbildung 18 ersichtlich führte eine 24-stündige Inkubation mit FCS-haltigem Medium zu einer Steigerung der RNA-Synthese um Faktor 4 (p < 0,001). Die gleichzeitige Inkubation mit 1 µM MG132 reduzierte die Synthese im Vergleich zu mit FCS behandelten Zellen um 33% (p < 0,001). Durch 1 µM MG262 sank die Syntheseleistung um 84% (p < 0,001). Demgegenüber hatte 1 µM ALLM keinen signifikanten Effekt (p = 0,111).

Abbildung 18: Veränderung der RNA-Synthese nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS und ALLM, MG132 bzw. MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 3) genormt auf die Kontrolle.

In Abbildung 19a finden sich die Ergebnisse einer 24-stündigen Stimulation mit FCS-haltigem Medium und 0,05-1 µM MG132. 10% FCS steigerten die Syntheserate um 152% (p = 0,01). Zugabe von 0,05 µM oder 0,1 µM MG132 zeigten keinen signifikanten Einfluss auf die Wirkung des FCS (p = 0,249 bzw. p = 0,452). Dagegen verminderten höhere Konzentrationen von MG132 den synthesesteigernden Effekt des FCS. So war die Syntheseleistung im Vergleich zu mit FCS allein behandelten Zellen bei 0,5 µM MG132 um 43% (p = 0,028) und bei 1 µM MG132 um [Seite 55↓]59% (p = 0,007) geringer.

Abbildung 19: Veränderung der RNA-Synthese nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS (a) bzw. 100 µM Isoproterenol (b) und 0,05-1 µM MG132. Die Diagramme zeigen Mittelwerte ± SEM (n = 3) genormt auf die Kontrolle.


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Eine Stimulation über 24 Stunden mit 100 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132 gibt die Abbildung 19b wider. Dabei nahm die RNA-Synthese nach Stimulation mit Isoproterenol im Vergleich zu unbehandelten NRC um 77% (p = 0,013) zu. Koinkubation mit 0,05 µM MG132 resultierte in einer Verringerung der Synthese im Vergleich zur Isoproterenol-Gruppe um 37% (p = 0,001). 0,1 µM MG132 bewirkte eine Reduktion um 29% (p = 0,003). Durch 0,5 µM bzw. 1 µM MG132 ließ sich die Syntheserate um 32% (p = 0,007) bzw. 46% (p < 0,001) reduzieren.

3.1.6 Messung der rRNA-Synthese

Die in Abschnitt 3.1.5 beschriebene RNA-Synthese gibt die Veränderungen der Gesamt-RNA-Synthese wider. Diese setzt sich aus ribosomaler, messenger und transfer RNA-Synthese zusammen, wobei die einzelnen RNA-Subtypen von verschiedenen Unterformen der DNA-abhängigen RNA-Polymerase synthetisiert werden. Um nun zwischen ribosomaler und messenger-RNA-Synthese unterscheiden zu können, inhibierten wir die für die mRNA-Synthese zuständige DNA-abhängige RNA-Polymerase II in einem weiteren Experiment mit 2,5 µg/ ml α-Amanitin. Dabei zeigte sich – analog zu den oben beschriebenen Daten – ein Anstieg der RNA-Syntheserate um Faktor 5,1 (p = 0,024) nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Gleichzeitige Behandlung mit 1 µM MG132 verringerte die Rate im Vergleich zu ausschließlich mit FCS behandelten Zellen um 74% (p = 0,002). Wurden Zellen ausschließlich mit α-Amanitin behandelt, reduzierte sich die Syntheserate im Vergleich zu den Kontrollzellen um 46% (p = 0,01). Gleichzeitige Behandlung mit FCS und α-Amanitin führte zu einer 39% (p = 0,029) geringeren Syntheserate im Vergleich zu mit FCS allein inkubierten Zellen. Bei Zellen, die mit FCS, α-Amanitin und MG132 behandelt wurden, wurde eine um 49% (p < 0,001) verringerte Synthese im Vergleich zu mit FCS und α-Amanitin behandelten Zellen gemessen. Dieser Wert lag 69% (p = 0,003) unter dem bei ausschließlich mit FCS behandelten Zellen ermittelten Wert und unterschied sich somit nicht signifikant (p = 0,4) von Messungen bei Zellen, die mit FCS und MG132 allein behandelt wurden (Abbildung 20).


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Abbildung 20: Veränderung der ribosomalen RNA-Synthese nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS, 1 µM MG132 und 2,5 µg/ ml α-Amanitin. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 3) genormt auf die Kontrolle.

3.2 Nachweis und Quantifizierung der Inhibition des Proteasoms

3.2.1 Akkumulation polyubiquitinierter Proteine

Um die effiziente, dosisabhängige Inhibition des Proteasoms zu zeigen, wurde mittels Western Blot Analysen die Anhäufung polyubiquitinierter Proteine nachgewiesen. Dazu wurden NRC mit 10 µM Isoproterenol und 0,05-1 µM MG132 stimuliert und nach 12, 24, 48 und 72 Stunden geerntet. Abbildung 21 gibt hierzu repräsentative Western Blots wider.

Während alleinige Stimulation mit Isoproterenol unabhängig von der Inkubationsdauer die Menge polyubiquitinierter Proteine unbeeinflusst ließ, führte bereits eine 12-stündige Inkubation mit niedrig dosiertem MG132 zu einer deutlichen Zunahme des Gehalts an Ubiquitinkonjugaten um bis zu Faktor 25 im Vergleich zur Kontrolle. Während die Wirkung von 100 nM über den Zeitverlauf nahezu konstant blieb, ließen sich nach Behandlung mit 50 nM MG132 mit zunehmender Inkubationszeit weniger polyubiquitinierte Proteine nachweisen.


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Abbildung 21: Akkumulation polyubiquitinierter Proteine nach Inkubation mit 10 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132 über 12 (a), 24 (b), 48 (c) und 72 Stunden (d). Die Diagramme zeigen die relative Proteinmenge genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.


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Interessanterweise betrug die Menge der nachweisbaren Ubiquitinkonjugate bei Inhibition mit 1 µM MG132 zu allen untersuchten Zeitpunkten nur ca. 50% der jeweiligen, mit niedriger konzentriertem MG132 erreichten Höchstmenge.

3.2.2 Bestimmung der Aktivität des Proteasoms mittels fluorogener Substrate

Um die Aktivität der Proteasomen durch Messung der Fluoreszenz nach Abbau fluorogener Substrate zu bestimmen, wurden NRC mit 10 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132 inkubiert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen vorsichtig lysiert und die proteasomale Aktivität durch Zugabe von Suc-LLVY-MCA und anschließende Messung der Fluoreszenz bestimmt. Die Fluoreszenz ist dabei proportional zum Abbau des Suc-LLVY-MCA und damit proportional zur Aktivität der Proteasomen.

Wie aus Abbildung 22 ersichtlich führte Inkubation mit 10 µM Isoproterenol allein zu keiner signifikanten Änderung der proteasomalen Aktivität im Vergleich zur Kontrolle (p = 0,127). Dagegen bewirkte die Kombination mit MG132 eine dosisabhängige Reduktion der Aktivität im Vergleich zu ausschließlich mit Isoproterenol behandelten Zellen. So resultierte der Einsatz von 0,05 µM MG132 in einer Aktivitätsverminderung um 54% (p = 0,002). Bei 0,1 µM waren es bereits 76% (p < 0,001) und bei den höheren Dosen 88% (0,5 µM, p = 0,002) bzw. 90% (1 µM MG132, p = 0,002).


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Abbildung 22: Aktivität des Proteasoms nach 48-stündiger Inkubation mit 10 µM Isoproterenol und 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SD (n = 6) der Fluoreszenz nach Abbau fluorogener Substrate (Suc-LLVY-MCA).

3.2.3 Transiente Transfektionen mit UbG76V-GFP

Eine weitere Möglichkeit, die effiziente Hemmung des Proteasoms zu zeigen, ist der Nachweis der Akkumulation ubiquitinierter GFP nach Transfektion mit UbG76V-GFP. Abbildung 23 zeigt die Anzahl fluoreszierender Zellen pro Sichtfeld nach Transfektion und 24- bzw. 48-stündiger Stimulation mit 10 µM Isoproterenol und 0,05-1 µM MG132. In der Kontrollgruppe waren keine fluoreszierenden Zellen sichtbar. Ausschließlich mit Isoproterenol behandelte Zellen fluoreszierten nach 24 Stunden nur sehr vereinzelt mit einer leichten Zunahme nach 48 Stunden. Dagegen ließ sich nach Inkubation mit MG132 ein deutlicher, zeit- und dosisabhängiger Anstieg der Zahl fluoreszierender Zellen von rund 3 pro Sichtfeld nach 24-stündiger Behandlung mit 50 nM MG132 auf bis zu 15 Zellen pro Sichtfeld nach 48 Stunden und 1 µM MG132 dokumentieren (p < 0,001).


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Abbildung 23: Fluoreszierende Zellen/ Sichtfeld nach Transfektion mit UbG76V-GFP und 24- bzw. 48-stündiger Stimulation mit 10 µM Isoproterenol und 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 10).

3.3 Mögliche Mechanismen der Hypertrophiesuppression

3.3.1 Signaltransduktion via ERK 1/2

Um zu klären, ob die Beeinflussung intrazellulärer Signalwege eine der Ursachen des antihypertrophen Effekts der proteasomalen Inhibition sein könnte, wurde mittels Western Blot Analysen der Aktivierungsgrad der extracellular signal regulated kinases 1/2 (MAPK p44/42) untersucht. Dazu wurden NRC 4 Stunden mit Proteasominhibitoren inkubiert und anschließend für 10 bzw. 20 Minuten mit 10% FCS, 50 µM Isoproterenol oder 100 µM Phenylephrin stimuliert. In Vorversuchen zeigte sich, dass bei Stimulation mit FCS und Phenylephrin die Aktivierung der ERK nach 10 Minuten ihr Maximum erreichte, während bei Behandlung mit Isoproterenol die stärkste Aktivierung nach 20 Minuten zu messen war (nicht gezeigt). Dementsprechend wurden die Stimulationszeiten den verschiedenen Stimuli angepasst.

Nach Stimulation wird nur ein gewisser Teil des gesamten Pools an ERK phosphoryliert. Der Großteil verbleibt in der inaktiven, nicht-phosphorylierten [Seite 62↓]Form. Zur besseren Vergleichbarkeit wurde der ermittelte Anteil phosphorylierter ERK auf die Menge der inaktiven Form abgeglichen.

Abbildung 24 zeigt eine Stimulation mit 10% FCS nach Vorinkubation mit 1 µM und 10 µM MG132. In der unstimulierten Kontrolle sind phosphorylierte Formen der ERK kaum nachweisbar. Durch Vorinkubation mit 1 µM und 10 µM MG132 ließ sich die Menge aktivierter ERK sogar noch weiter senken. Mit FCS stimulierte Zellen ohne MG132-Behandlung zeigen dagegen eine starke Zunahme phosphorylierter ERK um Faktor 39. Diese Aktivierung konnte durch Inhibition des Proteasoms drastisch reduziert werden.

Abbildung 24: Veränderung des Anteils der aktiven Form von ERK 1/2 nach 4-stündiger Inkubation mit MG132 und 10-minütiger Stimulation mit 10% FCS. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge der phosphorylierten ERK 1/2 abgeglichen auf die inaktive Form und genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.

In Abbildung 25 sind die Ergebnisse des Versuchs nach Stimulation mit Phenylephrin dargestellt. Auch hier findet sich bei der unbehandelten Kontrolle nur eine geringe Menge aktiver ERK. Dieser Anteil lässt sich durch Vorinkubation mit MG132 weiter deutlich reduzieren. Phenylephrin bewirkt eine Zunahme der phosphorylierten ERK um mehr als 300%. Durch Vorinkubation mit MG132 wurde [Seite 63↓]die PE-induzierte Aktivierung der ERK nahezu vollständig inhibiert.

Abbildung 25: Veränderung des Anteils der aktiven Form von ERK 1/2 nach 4-stündiger Inkubation mit MG132 und 10-minütiger Stimulation mit 100 µM Phenylephrin. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge der phosphorylierten ERK abgeglichen auf die inaktive Form und genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.

Wie aus Abbildung 26 ersichtlich verringerte Vorinkubation mit 1 µM MG132 den Anteil phosphorylierter ERK im Vergleich zur Kontrolle erneut deutlich. Stimulation mit Isoproterenol zu einer Erhöhung der Menge aktivierter ERK um mehr als 300%. Vorbehandlung mit 1 µM MG132 reduzierte diesen Effekt um mehr als die Hälfte.


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Abbildung 26: Veränderung des Anteils der aktiven Form von ERK 1/2 nach 4-stündiger Inkubation mit MG132 und 20-minütiger Stimulation mit 50 µM Isoproterenol. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge der phosphorylierten ERK abgeglichen auf die inaktive Form und genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.

In Abbildung 27 sind die Ergebnisse nach Vorinkubation mit MG262 dargelegt. Auch hier führte Vorinkubation mit dem Proteasominhibitor zur Verringerung des aktivierten Anteils der ERK in unstimulierten Zellen. Stimulation mit Isoproterenol erhöhte in diesem Versuch die Menge der aktiven Form auf das Fünffache. Vorinkubation mit MG262 halbierte den Anteil der phosphorylierten ERK.


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Abbildung 27: Veränderung des Anteils der aktiven Form von ERK 1/2 nach 4-stündiger Inkubation mit MG262 und 20-minütiger Stimulation mit 50 µM Isoproterenol. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge der phosphorylierten ERK abgeglichen auf die inaktive Form und genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.

Abbildung 28: Veränderung des Anteils der aktiven Form von ERK 1/2 nach 4-stündiger Inkubation mit ALLM und 20-minütiger Stimulation mit 50 µM Isoproterenol. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge der phosphorylierten ERK abgeglichen auf die inaktive Form und genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.


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Abbildung 28 ist zu entnehmen, dass der Protease-Inhibitor ALLM keinen Einfluss auf die Aktivierbarkeit der ERK 1/2 zeigte.

3.3.2 Untersuchung der Aktivität von nuclear factor kappa B

Die inaktive Form des Transkriptionsfaktors NFκB findet sich im Zytosol gebunden an IκB. Ein wichtiger Schritt in seiner Aktivierung ist die Abspaltung und der schnelle proteasomale Abbau dieses inhibitorisch wirkenden Proteins.

Um den Einfluss des inhibierten Proteasoms auf die Aktivität von NFκB zu untersuchen, wurde ein Luciferase-Reportergenkonstrukt, bei dem NFκB-Bindungsstellen als Promoter dienen, verwendet. Wie Abbildung 29 entnehmbar konnte nach 24-stündiger Behandlung mit 50 µM Isoproterenol eine Erhöhung der Aktivität von NFκB um 78% (p < 0,001) gemessen werden.

Abbildung 29: Veränderung der Aktivität von NFκB nach 24-stündiger Inkubation mit 50 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit MG132 oder MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 6) genormt auf die Kontrolle.

Wurden die Zellen zusätzlich mit 0,1 µM MG132 inkubiert, ergab sich eine Verminderung der Aktivität im Vergleich zu ausschließlich mit Isoproterenol behandel[Seite 67↓]ten Zellen um 40% (p = 0,038). Erhöhung der Dosis auf 1 µM MG132 bewirkte eine Reduktion um 69% (p = 0,001). Wurde Isoproterenol mit 1 µM MG262 kombiniert, reduzierte sich die Aktivität um 67% (p < 0,001).

3.3.3 Untersuchung der Aktivität des activating protein 1

Im Gegensatz zu NFκB ist die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP1 nicht direkt vom Proteasom abhängig. Vielmehr ist bekannt, dass Untereinheiten des Dimers AP1 (z. B. c-jun und c-fos) über das Proteasom abgebaut werden. Dem entsprachen die mit einem Luciferase-Reportergenkonstrukt mit AP1-Bindungsstellen erhobenen Befunde: Blockade des Proteasoms führte zu einer Erhöhung der Aktivität des Transkriptionsfaktors.

Abbildung 30: Veränderung der Aktivität von AP1 nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS allein und kombiniert mit MG132 oder MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 9) genormt auf die Kontrolle.

Wie Abbildung 30 zeigt, resultierte die 24-stündige Inkubation mit 10% FCS in einer Erhöhung der transkriptionellen Aktivität an der AP1-Bindungstelle um 244% [Seite 68↓](p < 0,001). Gleichzeitige Behandlung mit 0,1 µM MG132 erbrachte keine signifikante Veränderung im Vergleich zu ausschließlich mit FCS behandelten Zellen (p = 0,786). Dagegen stieg die Aktivität bei Inkubation mit FCS und 1 µM MG132 noch um 192% (p < 0,001). Auch durch Zugabe von 1 µM MG262 nahm die Aktivität noch um 187% (p < 0,001) zu.

Abbildung 31 stellt die Ergebnisse nach Stimulation mit 50 µM Isoproterenol dar. Analog zu den mit FCS behandelten Zellen stieg die Aktivität nach Zugabe von Isoproterenol um 164% (p < 0,001) an. Kombination mit 0,1 µM MG132 zeigte wiederum keinen signifikanten Einfluss (p = 0,097) im Vergleich zu ausschließlich mit Isoproterenol inkubierten NRC. Der Einsatz von 1 µM MG132 erhöhte die Aktivität um 67% (p < 0,052). 1 µM MG262 erbrachte einen Zuwachs von 71% (p = 0,034).

Abbildung 31: Veränderung der Aktivität von AP1 nach 24-stündiger Inkubation mit 50 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit MG132 oder MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 9) genormt auf die Kontrolle.


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Abbildung 32 zeigt die Befunde nach Inhibition des Proteasoms ohne gleichzeitige Zugabe von hypertrophen Stimuli. Behandlung mit MG132 resultierte dabei in einer Erhöhung der transkriptionellen Aktivität im Vergleich zu den unbehandelten Zellen um Faktor 4,7 (0,1 µM, p < 0,001) bzw. um Faktor 4,9 (1 µM, p < 0,001). Durch 1 µM MG262 stieg die Aktivität um Faktor 3,8 (p < 0,001).

Abbildung 32: Veränderung der Aktivität von AP1 nach 24-stündiger Inkubation mit MG132 oder MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 9) genormt auf die Kontrolle.


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27.11.2003