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4  Diskussion

Am Beginn dieser Arbeit stand die Hypothese, dass sich die Hypertrophie kardialer Myozyten durch die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems supprimieren lässt. Diese These konnte durch zahlreiche Befunde gestützt werden.

Dazu wurden die Zellen zunächst auf Merkmale der Hypertrophie und eine mögliche Beeinflussung durch Behandlung mit Proteasominhibitoren hin untersucht. Dabei konnte ein deutlich vermindertes hypertrophes Zellwachstum, ein verringerter Gehalt an Hypertrophiemarkerproteinen, eine reduzierte Expression des Markergens BNP sowie eine Abnahme der Protein- und RNA-Synthese gezeigt werden. Ebenso konnte eine reduzierte rRNA-Synthese gemessen werden. Der Nachweis der Spezifität des Effekts der Proteasominhibitoren konnte durch Versuche mit ALLM, einem Inhibitor zellulärer Proteasen (Kalpaine und Kathepsine), der keinen signifikanten Einfluss auf die untersuchten Kennzeichen der Hypertrophie hatte, erbracht werden.

Im folgenden wurde die Inhibition des Proteasoms dokumentiert und quantifiziert. Dabei konnte zunächst durch Western Blot Analysen gezeigt werden, dass bereits geringe Dosen MG132 und kurze Inkubationszeiten eine signifikante Akkumulation polyubiquitinierter Proteine bewirken. Ferner wurde die konzentrationsabhängige Abnahme der Aktivität des Proteasoms durch Messung des Abbaus fluorogener Substrate bestimmt. Darüber hinaus resultierte Behandlung mit Proteasominhibitoren in einer konzentrations- und zeitabhängigen Anhäufung von ubiquitinierten GFP in mit UbG76V-GFP transfizierten Myozyten.

Um mögliche Mechanismen des antihypertrophen Effekts der Proteasominhibitoren aufzudecken, wurde die Aktivität von MAP Kinasen und Transkriptionsfaktoren untersucht. Dabei zeigte sich in Western Blot Analysen eine deutliche Abnahme der Aktivierbarkeit der ERK 1/2. Mit Reportergenkonstrukten konnte eine deutlich reduzierte Aktivität des Transkriptionsfaktors NFκB dokumentiert werden. Demgegenüber stand eine Erhöhung der transkriptionellen Aktivität des Transkriptionsfaktors activating protein 1.


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4.1  Kennzeichen der Hypertrophie kardialer Myozyten

4.1.1 Reduktion des hypertrophen Zellwachstums

Zu den auffälligsten und am leichtesten zu beobachtenden Eigenschaften hypertrophierter Zellen zählt die Flächenzunahme. Analog zu Befunden von Messerli et al. konnte auch in Rahmen dieser Arbeit bei neonatalen Rattenkardiomyozyten eine Zunahme der Fläche um Faktor 2 bis 3 nach Behandlung mit Hypertrophie-induzierenden Agonisten gemessen werden (Messerli et al. 1993). Dieses Wachstum verringerte sich unabhängig vom hypertrophen Stimulus durch Koinkubation mit Proteasominhibitoren dosisabhängig.

Während die 72-stündige Behandlung mit 1 µM MG132 einen zytotoxischen Einfluss auf die Kardiomyozyten ausübte (Desintegration des kontraktilen Apparats, Abnahme der lebenden Zellen), hatten niedrigere Dosen auch über längere Inkubationszeiten (> 72 Stunden) keinen erkennbaren Einfluss auf die Vitalität der Zellen. Dies deckt sich mit Befunden von Drexler et al., die zeigen konnten, dass postmitotische Zellen im Vergleich zu proliferierenden Zellen eine relativ hohe Resistenz gegenüber Proteasominhibitoren haben (Drexler et al. 2000).

Interessanterweise beschränkte sich der Effekt der Proteasominhibitoren nicht auf eine reine Wachstumshemmung; vielmehr zeigten die Zellen spezifische Veränderungen in der Morphologie: bereits nach Behandlung mit 50 nM MG132 bildeten die Zellen innerhalb von 24 bis 48 Stunden eine spindelförmige Gestalt mit langen bipolaren Zellausläufern aus. Eine so deutliche Reaktion auf derart niedrige Konzentrationen findet sich in der Literatur bisher nicht beschrieben. Interessanterweise ließ sich diese Veränderung der Morphologie in unserem Labor auch bei anderen Zelltypen (z. B. Endothelzellen, glatte Muskelzellen) beobachten, so dass es sich hierbei möglicherweise nicht um einen zell- sondern vielmehr proteasomspezifischen Effekt handelt. Als Ursache dafür denkbar ist die Stabilisierung von monomeren GTPasen der rho-Familie (rac, cdc42), die für die Organisation des Aktin-Zytoskeletts verantwortlich sind (Tapon und Hall 1997). In der Tat konnte kürzlich gezeigt werden, dass rac über das Proteasom abgebaut wird und die Inhibition des Proteasoms zu einer Daueraktivierung der Substrate in der Signaltransduktionskaskade unterhalb von rac führt (Lerm et al. 2002). Für einen Einfluss auf die [Seite 72↓]Organisation des Zytoskeletts spricht weiter eine Arbeit von Fenteany et al., die zeigen konnten, dass Proteasominhibitoren den Auswuchs von Neuriten bei Neuroblastomzellen induzieren (Fenteany et al. 1994).

Erstaunlicherweise führt die alleinige Behandlung mit Proteasominhibitoren zu einer Zunahme der Zellfläche (nicht gezeigt). Darüber hinaus erscheinen die Zellen – zumindest bei niedrig dosierter Gabe von MG132 – vitaler. Als Ursache lässt sich der bereits beschriebene kardioprotektive Effekt der Proteasominhibitoren durch Induktion von Hitzeschockproteinen diskutieren (Stangl et al. 2002). Weitere mögliche Ursachen werden in Abschnitt 4.3 besprochen.

Das zur Kontrolle der Spezifität des Effekts eingesetzte ALLM konnte weder das hypertrophe Zellwachstum noch die Zellmorphologie signifikant beeinflussen.

4.1.2 Abnahme des Gehalts an Hypertrophiemarkerproteinen

Hypertrophe Stimuli bewirken eine quantitative und qualitative Veränderung der Proteinsynthese: neben einer allgemeinen Synthesesteigerung kommt es zur überproportionalen Zunahme bestimmter Proteine, die als Hypertrophiemarker bezeichnet werden. Zu den durch eine Vielzahl verschiedener hypertropher Stimuli induzierbaren Markern gehören die in dieser Arbeit untersuchten β-myosin heavy chain (βMHC), α-sarcomeric actin (αSA) und α-smooth muscle actin (αSMA).

Die Behandlung mit Isoproterenol resultierte in einer deutlichen Steigerung der Menge von βMHC und αSMA. Dies deckt sich mit Befunden von Rupp et al. (βMHC) und Simpson et al. (αSA), die eine Zunahme der beiden Proteine nach Behandlung mit GPCR-Agonisten zeigen konnten (Rupp et al. 1991, Simpson et al. 1989). Unbeeinflusst von der Isoproterenol-Behandlung blieb dagegen die Menge von α-smooth muscle actin, zu dem sich in der Literatur auch keine Hinweise auf eine Beeinflussbarkeit durch GPCR-Agonisten finden ließen.

Unabhängig von der Induzierbarkeit der drei Proteine durch Isoproterenol nahm ihre Menge bei gleichzeitiger Inkubation mit Proteasominhibitoren dosisabhängig ab. Der Effekt des MG132 war dabei bereits ab einer Konzentration von 0,1 µM so [Seite 73↓]ausgeprägt, dass die Anteile von βMHC und αSMA an der Gesamtproteinmenge noch unter die bei den Kontrollen gemessenen Werte sanken.

Dies erlaubt den Schluss, dass die Inhibition des Proteasoms die Expression von Hypertrophiemarkern signifikant verringert.

4.1.3 Reduzierte BNP-Expression

Das vor allem im Ventrikel gebildete brain (oder B-type) natriuretic peptide (BNP) ist ebenso wie sein Vorhof-Analogon, der atriale natriuretische Faktor (ANF), ein sensibler Marker der Hypertrophie. Im Unterschied zu ANF reagiert es auf Behandlung mit hypertrophen Stimuli jedoch schneller mit einer Steigerung der Expressionsrate (Hanford et al. 1994) und scheint auch in klinischen Studien als Marker für Hypertrophie dem ANF überlegen (Yamamoto et al. 1996). In Übereinstimmung mit Befunden von Hanford et al. stieg die Expressionsrate von BNP um Faktor 10 nach Behandlung mit Isoproterenol. Gleichzeitige Inkubation mit MG132 resultierte in einer Halbierung des Effekts des Isoproterenols.

Dies zeigt, dass analog zu den Western Blot Daten auch mit Reportergenassays eine verminderte Markerexpression nach Behandlung mit Proteasominhibitoren beobachtet werden kann.

4.1.4 Abnahme der Proteinsynthese

Durch Inkorporation der radioaktiv markierten Aminosäure Leucin wurde die Proteinsynthese gemessen. Behandlung mit Serum führte hierbei zu einer Zunahme des inkorporierten Leucins um Faktor 3 bis 4. Während gleichzeitige Behandlung mit niedrig dosiertem MG132 (0,05-0,1 µM) keinen signifikanten Einfluss auf die Syntheserate hatte, bewirkten höhere Konzentrationen (0,5-1 µM) eine Halbierung des Effekts des Serums.

Vergleichbar mit Ergebnissen von Pinson et al. resultierte Inkubation mit Isoproterenol in einer Zunahme der Syntheserate um 50% (Pinson et al. 1993). Im Gegensatz zu den mit Serum durchgeführten Versuchen führte die Behandlung mit [Seite 74↓]MG132 bereits in niedrigen Dosen zu einer vollständigen Kompensation der Wirkung des Isoproterenols. Dabei lag die ermittelte Syntheserate noch unter den bei den unbehandelten Kontrollen gemessenen Werten.

Die Inhibition zellulärer Proteasen durch ALLM hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Syntheserate.

4.1.5  Abnahme der RNA-Synthese

Analog zur Messung der Proteinsynthese wurde auch die RNA-Synthese mittels Inkorporation des radioaktiv markierten Nukleosids Uridin ermittelt.

Auch hier konnte die Synthese durch Behandlung mit Serum um Faktor 2,5 bis 4 gesteigert werden. Niedrige Dosen von MG132 hatten wiederum keinen Einfluss auf die Syntheserate; höhere Konzentrationen bewirkten eine dosisabhängige Reduktion des Effekts des Serums. Inkubation mit 1 µM MG132 hob die Wirkung des Serums komplett auf.

Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Pinson et al. ließ sich auch durch Inkubation mit Isoproterenol die RNA-Synthese steigern: mit einer Zunahme um 80% lag sie etwa im für Endothelin-1 beschriebenen Bereich (Xu et al. 1999). Ähnliche Befunde wie bei der Proteinsynthese fanden sich bei Koinkubation mit MG132: bereits niedrige Dosen des Proteasominhibitors reduzierten den synthesesteigernden Effekt des Sympathomimetikums auf das Niveau der unbehandelten Kontrollen.

Die Behandlung mit ALLM zeigte auch hier keinen signifikanten Einfluss auf die Syntheserate.

Die Beobachtung, dass zur Reduktion des synthesesteigernden Effekts des Serums höhere Dosen von MG132 notwendig waren als bei Einzelstimulationen mit GPCR-Agonisten, korreliert mit Western Blot Analysen polyubiquitinierter Proteine. Auch hier waren im Vergleich zu Versuchen mit GPCR-Agonisten bei Behandlung mit FCS höhere Konzentrationen von MG132 notwendig, um eine signifikante Anhäufung der Ubiquitinkonjugate zu erzielen (nicht gezeigt). Als Ursache für diesen [Seite 75↓]Effekt lässt sich diskutieren, dass das Serum zahlreiche Agonisten enthält (Wachstumsfaktoren, Katecholamine, Schilddrüsenhormone etc.) und so in der Lage ist, eine Vielzahl verschiedener Signaltransduktionskaskaden zu aktivieren. Es ist denkbar, dass durch die Aktivierung multipler Signalwege der Effekt der Proteasominhibitoren teilweise kompensiert wird. Für diese Hypothese spricht, dass die untersuchten Kennzeichen einer Hypertrophie nach Behandlung mit Serum grundsätzlich stärker zunahmen als bei Einzelstimulationen mit GPCR-Agonisten.

Grundsätzlich lässt sich sagen, dass sich mit Proteasominhibitoren die Zunahme der Protein- und RNA-Synthese in der Hypertrophie reduzieren lässt. Unklar ist jedoch, ob Proteasominhibitoren direkt in die Synthese eingreifen oder ob sie durch Interaktion mit Signalkaskaden die Aktivierung der Transkription und der Translation indirekt verhindern. Ebenfalls nicht geklärt ist, ob die verminderte Proteinsynthese Folge der reduzierten RNA-Synthese ist.

4.1.6 Abnahme der ribosomalen RNA-Synthese

Die mit Hilfe der Inkorporation von Uridin gewonnenen Daten geben ausschließlich Auskunft über die Veränderung der Gesamt-RNA-Synthese und lassen daher keinen Schluss auf Veränderungen der Synthese von ribosomaler, messenger und transfer RNA zu. Für die Synthese der RNA-Unterformen sind dabei verschiedene DNA-abhängige RNA-Polymerasen verantwortlich: Typ I für rRNA, Typ II für mRNA und Typ III für tRNA. Um differenziertere Informationen über die Veränderung der rRNA-Synthese zu erhalten, wurde daher die mRNA-Synthese (bei Vernachlässigung der tRNA-Synthese) mit Hilfe von α-Amanitin, einem Inhibitor der DNA-abhängigen RNA-Polymerase II, blockiert.

Analog zu den Befunden aus Abschnitt 4.1.5 stieg die RNA-Synthese bei Behandlung mit FCS um Faktor 5 und konnte mit gleichzeitiger Behandlung mit MG132 deutlich reduziert werden. Wurde die mRNA-Synthese durch Inkubation mit α-Amanitin inhibiert, halbierte sich die RNA-Synthese unstimulierter Zellen. Dies deckt sich mit der bekannten Tatsache, dass mRNA- und rRNA-Synthese je etwa die Hälfte der RNA-Synthese ausmachen (Hannan und Rothblum 1995). Weiterhin [Seite 76↓]war die Syntheserate nach Stimulation mit FCS um 39% geringer als bei Zellen, deren mRNA-Synthese nicht blockiert war. Dies legt den Schluss nahe, dass Inkubation mit FCS sowohl die mRNA- als auch die rRNA-Synthese in gleichem Maße stimuliert. Behandlung mit MG132 führte bei den mit α-Amanitin und FCS behandelten Zellen zu einer Verminderung ihrer Syntheserate um 49%. Blockade der mRNA-Synthese mit α-Amanitin hatte keinen signifikanten Effekt auf die Syntheserate von Zellen, die mit FCS und MG132 behandelt wurden.

Diese Daten erlauben den Schluss, dass α-Amanitin keinen signifikanten Einfluss auf die Wirkung des MG132 hatte.

Die ermittelte Inhibition der rRNA-Synthese stellt eine mögliche Erklärung für den antihypertrophen Effekt der Proteasominhibitoren dar. Da bereits im nichthypertrophierten Zustand 90% aller Ribosomen ausgelastet sind (Hannan und Rothblum 1995) und so die Proteinsynthese der Zellen durch ihren Gehalt an Ribosomen limitiert wird (Hannan et al. 1995, Siehl et al. 1985), ist die Neusynthese der Ribosomen, also auch die rRNA-Synthese, ein entscheidender Prozess in der Ausbildung einer Hypertrophie.

4.2 Nachweis und Quantifizierung der Inhibition des Proteasoms

Neben dem Nachweis der Spezifität des Effekts durch Kontrollversuche mit ALLM galt es, den Einfluss der Proteasominhibitoren auf die Aktivität des Proteasoms zu quantifizieren.

4.2.1 Akkumulation polyubiquitinierter Proteine

Dazu wurden zunächst Western Blot Analysen durchgeführt, mittels derer die Akkumulation polyubiquitinierter Proteine gezeigt werden konnte. Auffallend war hierbei, dass sich Ubiquitinkonjugate bereits bei geringer Dosierung (50 nM MG132) und nach kurzen Inkubationszeiten (6 Stunden) nachweisen ließen. Interessanterweise war die nachweisbare Menge polyubiquitinierter Proteine nach Behandlung mit 0,1 µM und 0,5 µM MG132 unabhängig von der Inkubationsdauer [Seite 77↓]größer als nach Inkubation mit der Maximaldosis von 1 µM MG132. Als Ursache dafür könnte diskutiert werden, dass Proteasominhibitoren in höherer Dosierung zytotoxisch wirken (s. o.) und so indirekt die Markierung zum Abbau bestimmter Proteine mit Ubiquitinketten hemmen. Eine andere Erklärungsmöglichkeit liefert die bereits beschriebene Tatsache, dass Proteasominhibitoren zu einer Steigerung der Expression von Proteasomuntereinheiten führen. Es ist daher vorstellbar, dass höhere Konzentrationen von MG132 die Neusynthese von Proteasomuntereinheiten anregen, was in einer partiellen Kompensation der inaktivierten Proteasomen resultieren könnte.

4.2.2 Abnahme der Aktivität des Proteasoms

Analog zu den Ergebnissen der Western Blot Analysen konnte durch Bestimmung der Aktivität der Proteasomen im Zelllysat mittels Abbau fluorogener Substrate gezeigt werden, dass schon die 48-stündige Behandlung mit 50 nM MG132 in einer Halbierung der Aktivität des Proteasoms resultierte. Bereits bei 0,5 µM MG132 betrug die Aktivität nur noch 12% des Kontrollwerts. Angesichts der Tatsache, dass zur Messung der Aktivität eine definierte Proteinmenge aus einem Zelllysat eingesetzt wird, wäre bei einer Neusynthese von Proteasomuntereinheiten eine Steigerung der Aktivität zu erwarten, da sich der Anteil der Proteasomen an der Gesamtproteinmenge erhöhen würde. Dass die messbare Aktivität des Proteasoms nach Behandlung mit 1 µM MG132 auf dem gleichem Niveau wie nach Einsatz von 0,5 µM MG132 lag, spricht daher eher gegen die These einer relevanten Neusynthese von Proteasomuntereinheiten.

4.2.3 Transfektion mit UbG76V-GFP

Einen interessanten Aspekt erleuchtete die Transfektion von Kardiomyozyten mit UbG76V-GFP. Dem in diesem System als Reportergen dienenden grün fluoreszierenden Protein (GFP) ist eine Kette aus Ubiquitinmolekülen, die nicht durch Ubiquitinhydrolasen abgespalten werden kann, vorgeschaltet. Daher kommt es unmittelbar nach der Synthese des Konstrukts durch die Zellen zum Abbau durch das [Seite 78↓]26S Proteasom (Stack et al. 2000).

Dabei zeigte sich nicht nur die erwartete zeit- und konzentrationsabhängige Anhäufung der grün fluoreszierenden Proteine durch Inhibition des Proteasoms. Vielmehr konnten auch bei ausschließlich mit Isoproterenol behandelten Zellen vereinzelt fluoreszierende Zellen beobachtet werden, wohingegen bei den unbehandelten Zellen keinerlei Fluoreszenz gemessen werden konnte (Abbildung 33). Begründung hierfür könnte eine verstärkte Synthese der UbG76V-GFP-Moleküle durch die mit einer Hypertrophie einhergehenden Steigerung der allgemeinen Transkriptionsrate sein, ohne dass es zu einer kompensatorischen Steigerung des Abbaus über das Proteasom kommt. Des Weiteren wäre eine physiologische Inhibition des Proteasoms beim Wechsel von der katabolen zur anabolen Stoffwechsellage denkbar. Es wäre durchaus interessant, diesen Aspekt weiter zu beleuchten, zumal sich in der Literatur so gut wie keine Hinweise darauf finden, wie sich die Aktivität des Proteasoms in der Hypertrophie verändert.

Abbildung 33: Mit UbG76V-GFP transfizierte NRC nach 48-stündiger Behandlung mit 10 µM Isoproterenol allein (a) und kombiniert mit 1 µM MG132 (b).

4.3  Mögliche Mechanismen des antihypertrophen Effekts der Proteasominhibitoren

4.3.1 Abnahme der Aktivierbarkeit der MAPK ERK 1/2

Um Ursachen für den antihypertrophen Effekt der Proteasominhibitoren aufzude[Seite 79↓]cken, sollte eine mögliche Interaktion des Proteasoms mit dem Ras/ Raf/ ERK Signaltransduktionsweg untersucht werden. Wie in der Einleitung bereits beschrieben, spielt diese Kaskade in der Vermittlung hypertropher Stimuli eine herausragende Rolle. Yue und Mitarbeiter konnten zeigen, dass die Aktivierung der ERK in der Entwicklung von durch GPCR-Agonisten ausgelöster Hypertrophie von essentieller Bedeutung ist (Yue et al. 2000).

Im Rahmen dieser Arbeit konnte mittels Western Blot Analysen dokumentiert werden, dass sich die Aktivierbarkeit der ERK 1/2 durch Vorinkubation mit Proteasominhibitoren drastisch reduzieren lässt. Diese Ergebnisse finden sich in Übereinstimmung mit Befunden von Orlowski et al., die eine verringerte Aktivität von ERK nach Behandlung mit Proteasominhibitoren in Tumorzellen zeigen konnten und darin eine Ursache für den beobachteten proapoptotischen Effekt sehen. Ursache für die reduzierte Phosphorylierung der MAPK scheint eine Induktion von dephosphorylierenden MAPK Phosphatasen (MKP, siehe Abbildung 34) zu sein (Orlowski et al. 2002). In der Tat konnte die Induktion von MKP-1 nach Behandlung mit Proteasominhibitoren auch in Rattenkardiomyozyten gezeigt werden (unveröffentlichte Daten, Hartmut Lüss et al., Münster).

Abbildung 34: Phosphatasen des MAPK-Signalwegs (nach Denhardt 1996).


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Interessanterweise könnte eine verminderte ERK Aktivität auch eine Ursache der weiter oben beschriebenen Abnahme der rRNA-Synthese sein: ERK 1/2 aktivieren durch Phosphorylierung den upstream binding factor (UBF), der in der rDNA-Transkription eine wichtige Rolle spielt. Dementsprechend konnten Stefanovsky et al. zeigen, dass die ribosomale Transkription durch Blockade der ERK auf ein basales Niveau zurückführt wird (Stefanovsky et al. 2001).

Trotzdem kann die verminderte Aktivität der ERK nicht alle beobachteten Effekte erklären, da die ERK v. a. in der Steigerung der Proteinsynthese und weniger in der Ausbildung eines spezifischen hypertrophen Genmusters eine Rolle spielen (Sugden und Clerk 1998).

4.3.2 Abnahme der Aktivität von nuclear factor kappa B

Wie in der Einleitung bereits angedeutet, handelt es sich bei NFκB um einen zentralen Regulator der zellulären Antwort auf Stress: mehr als 150 Stimuli sind in der Lage, NFκB zu aktivieren, woraufhin die Expression von inzwischen über 150 identifizierten Zielgenen moduliert wird (Pahl 1999). So nimmt NFκB beispielsweise Einfluss auf die Expression von Mediatoren der Reaktion auf Entzündungsreize (TNFα, IL-1), auf Enzyme (Cyclooxygenase, NO-Synthetase) und auf Leukozyten Adhäsionsmoleküle (ICAM, VCAM). Ferner scheint NFκB eine wichtige Rolle in der Ausbildung GPCR-vermittelter Hypertrophie zu spielen (Hirotani et al. 2002); Purcell et al. konnten zeigen, dass Inhibition von NFκB die Wirkung verschiedener hypertropher Stimuli reduzierte bzw. aufhob (Purcell et al. 2001).

Analog zu diesen Befunden konnte im Rahmen dieser Arbeit erstmals eine gesteigerte Aktivität von NFκB in Reportergen-Versuchen nach Behandlung mit Isoproterenol gemessen werden. Diese Aktivitätszunahme ließ sich durch Proteasominhibitoren dosisabhängig reduzieren: bereits 0,1 µM MG132 hoben den Effekt des Isoproterenols vollständig auf, höhere Konzentrationen des Proteasominhibitors reduzierten die Aktivität von NFκB noch unter das Niveau der bei den Kontrollen gemessenen Werte.

Diese Befunde sind keinesfalls überraschend; Palombella et al. konnten bereits [Seite 81↓]1994 zeigen, dass das Proteasom in der Aktivierung von NFκB eine essentielle Rolle spielt (Palombella et al. 1994). Der Transkriptionsfaktor liegt im Zytosol an ein inhibitorisches Protein, IκB, gebunden vor. Aktivierende Stimuli bewirken eine Phosphorylierung von IκB durch die IκB Kinase (IKK); daraufhin wird es ubiquitiniert und anschließend über das Proteasom abgebaut (Rothwarf und Karin 1999). Auch an der Synthese des Transkriptionsfaktors ist das Proteasom beteiligt: die p50-Untereinheit von NFκB entsteht durch limitierte Proteolyse des Vorläufer-Proteins p105 (Fan und Maniatis 1991).

4.3.3 Zunahme der Aktivität des activating protein 1

Unter dem Begriff activating protein 1 wird eine Gruppe von dimeren Transkriptionsfaktoren zusammengefasst, die in der Regulation von Prozessen wie Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose und Zellstress eine bedeutende Rolle spielen (Piechaczyk und Blanchard 1994). Sie bestehen aus Mitgliedern der Gruppe der bZIP-Proteine (basic region leucine zipper), zu deren wichtigsten Subfamilien jun, fos, ATF und maf gehören (Angel und Karin 1991). In Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Dimere, aktivieren sie verschiedene Promotorregionen ihrer Zielgene (Karin et al. 1997).

Ihre Regulation erfolgt über verschiedene Mechanismen. Zum einen wird die Aktivität der einzelnen Faktoren über Phosphorylierung durch MAPK gesteuert (Karin 1995). So wird die Fähigkeit von c-jun, die Expression seiner Zielgene zu steigern, durch c-jun N terminal kinases erheblich verstärkt (Hibi et al. 1993, Smeal et al. 1994, Dérijard et al. 1994).

Darüber hinaus wird die Transkription der Faktoren durch eine Vielzahl extrazellulärer Stimuli über verschiedene Signaltransduktionskaskaden beeinflusst. So wird beispielsweise die Expression von c-fos durch Zytokine, Wachstumsfaktoren und UV-Bestrahlung über die Januskinase, die extracellular regulated protein kinase, die c-jun N terminal kinase und die Proteinkinase A verstärkt (Karin 1995). Ferner sind AP1-Faktoren in der Lage, ihre eigene Transkription zu verstärken: Heterodimere aus ATF2 und c-jun steigern die Expression von c-jun (van Dam et al. 1993).


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Ein weiterer Regulationsmechanismus beruht auf der Beeinflussung der Stabilität der Proteine (Treier et al. 1994, Tsurumi et al. 1995). Als Beispiel sei c-jun, das ebenso wie die Mehrheit der bZIP-Proteine über das Proteasom abgebaut wird (Acquaviva et al. 2001), genannt: wird c-jun durch JNKs phosphoryliert, kommt es zur Abnahme der Ubiquitinierung des Proteins und folglich zur Verringerung des Abbaus durch des Proteasom (Musti et al. 1997).

Die Tatsache, dass die Mehrheit der AP1-Faktoren über das Proteasom abgebaut wird, liefert eine mögliche Erklärung für die im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe eines AP1-Reportergenkonstrukts gewonnen Daten. Dabei zeigte sich, dass sich die Aktivität von AP1 sowohl durch Inkubation mit Serum als auch durch Behandlung mit Isoproterenol um Faktor 3 steigern lässt. Diese Aktivitätszunahme konnte durch Koinkubation mit Proteasominhibitoren verstärkt werden, so dass Behandlung mit Serum und 1 µM MG132 in einer zehnfachen Erhöhung der Aktivität von AP1 im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen resultierte. Interessanterweise führte auch die Behandlung mit MG132 allein zu einer Steigerung der Aktivität von AP1 um Faktor 5. Dies könnte eine Erklärung für die weiter oben beschriebene Tatsache sein, dass ausschließlich mit Proteasominhibitoren behandelte Zellen einen vitaleren Eindruck machen und Wachstum zeigen.

Eine weitere Ursache für die Steigerung der AP1-Aktivität könnte in der Signalkaskade der MAPK liegen: während für ERK 1/2 gezeigt werden konnte, dass ihre Aktivierbarkeit durch Proteasominhibition unterdrückt werden kann, wurden p38 und JNK/ SAPK, von denen die Mehrzahl der AP1-Faktoren aktiviert wird, nicht untersucht. Für eine Rolle der JNK/ SAPK und p38 MAPK spricht, dass sie zum Teil durch rac, einer monomeren GTPase, aktiviert werden. In ihrer bereits weiter oben zitierten Arbeit konnten Lerm et al. zeigen, dass Behandlung mit Proteasominhibitoren nach Stimulation von rac in einer Daueraktivierung von JNK, zu deren wichtigsten Substraten c-jun und ATF2 gehören, durch Stabilisierung von rac resultiert (Lerm et al. 2002).

Dementsprechend könnten sowohl verringerter Abbau von AP1 als auch verstärkte Aktivierung durch rac Ursache der verstärkten AP1-Aktivität sein.

Lässt sich die gesteigerte AP1-Aktivität auch gut durch die oben genannten Me[Seite 83↓]chanismen erklären, so spricht sie nicht für die postulierte Suppression der Hypertrophie durch Proteasominhibitoren. Hierzu ist zu diskutieren, dass das Proteasom als der zentrale Abbaumechanismus zellulärer Proteine im Abbau nahezu aller – aktivierenden wie hemmenden – Signalmoleküle eine Rolle spielt. In der Tat scheinen die Fähigkeit, die Transkription von Zielgenen zu aktivieren, und hohe Instabilität durch schnelle Ubiquitinierung und konsekutiven Abbau grundsätzlich eng mit einander verknüpft zu sein (Salghetti et al. 2000, Thomas und Tyers 2000). Folge der Inhibition des Proteasoms ist somit die Veränderung der Aktivität zahlreicher Signalmediatoren auf allen Ebenen ihres komplexen Zusammenspiels. Insofern sind gegensätzliche Effekte keinesfalls überraschend. So führt die oben erwähnte Stabilisierung von rac nicht nur, wie spekuliert, zu einer Aktivierung von c-jun und ATF2 über die MAPK sondern auch zu einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors MEF2C, für den vor kurzem die Aktivierung der Helicase CHAMP (cardiac helicase activated by MEF2 protein) gezeigt werden konnte (Liu et al. 2001). Für diese Helicase wird ein supprimierender Einfluss auf Hypertrophie über den CDK Inhibitor p21CIP1, der ebenfalls über das Proteasom abgebaut wird, diskutiert (Liu und Olson 2002).

4.3.4 Abschließende Bemerkungen

Selbst bei Konzentration auf die wichtigsten Signalwege, würde es den Rahmen dieser Arbeit sprengen, den Einfluss des Proteasoms auf einzelne Mediatoren gezielt zu untersuchen. Konnten auch einige wichtige mögliche Mechanismen identifiziert werden – verminderte rRNA-Synthese, reduzierte Aktivität der ERK 1/2, Abnahme der NFκB-Aktivität –, so erscheint es insgesamt doch schwierig, einen Hauptmechanismus der Suppression der Hypertrophie zu bestimmen. Doch die Daten der hier vorliegenden Arbeit zeigen, dass es bei allen gegenläufigen, teils pro- teils antihypertrophen Substraten der Proteasominhibitoren unter dem Strich einen spezifischen, antihypertrophen Effekt gibt und dass dieser augenscheinlich bei niedrigen Konzentrationen einen geringen bis gar keinen zytotoxischen Effekt auf die Zellen ausübt.


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27.11.2003