Aus der Medizinischen Klinik m. S.
Kardiologie, Pulmologie und Angiologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Suppression der Hypertrophie
kardialer Myozyten durch Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Henryk Dreger
aus Berlin


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Dekan: Prof. Dr. Joachim Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. Karl Stangl
2. Prof. Dr. Jutta Schaper
3. Prof. Dr. Burkhardt Dahlmann

Eingereicht:15. November 2002

Datum der Promotion:20. Juni 2003

Zusammenfassung

Hypertrophie bezeichnet eine zelluläre Anpassungsleistung, die durch vermehrte Arbeitsbelastung ausgelöst wird und durch Zunahme von Zellgröße und Proteinsynthese sowie durch Veränderungen der Genexpression bei konstanter Zellzahl gekennzeichnet ist. Beim Ubiquitin-Proteasom-System handelt es sich um den wichtigsten intrazellulären Proteinabbaumechanismus eukaryontischer Zellen. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle im regulierten Abbau zellulärer Signalmediatoren und Transkriptionsfaktoren.

In einem Hypertrophiemodell mit neonatalen Rattenkardiomyozyten wurde die Wirkung von Proteasominhibitoren auf die Ausbildung einer Hypertrophie untersucht. Behandlung mit Proteasominhibitoren (MG132, MG262) führte dabei zu einer dosisabhängigen Reduktion des Effekts der eingesetzten hypertrophieinduzierenden Agonisten (Isoproterenol, Angiotensin II, Phenylephrin). So konnte mit Hilfe morphometrischer Analysen Phalloidin-gefärbter Kardiomyozyten eine Verringerung des Zellwachstums gezeigt werden. Western Blots belegten eine verringerte Expression von Hypertrophiemarkerproteinen (β-myosin heavy chain, α-sarcomeric actin, α-smooth muscle actin). Analog zu diesen Befunden konnte in einem Reportergenassay die Abnahme der Expression des brain natriuretic peptide (BNP) gezeigt werden. Eine reduzierte RNA- und Proteinsynthese konnte mit Hilfe der Inkorporation radioaktiver Substrate nachgewiesen werden.

Als Nachweis für die effiziente Inhibition des Proteasoms durch MG132 dienten Western Blots akkumulierter, polyubiquitinierter Proteine, die reduzierte proteasomale Degradation fluorogener Substrate sowie die Akkumulation eines grün fluoreszierenden Proteins nach Transfektion mit einem Ubiquitin-GFP-Konstrukt.

Als mögliche Mechanismen des antihypertrophen Effekts der Proteasominhibitoren konnten eine verringerte Aktivierbarkeit der MAP Kinasen ERK 1/2 (Western Blots) sowie eine reduzierte Aktivität des Transkriptionsfaktor NFκB (Reportergenassay) identifiziert werden.

Abstract

Myocardial hypertrophy is an important adaptive response of the heart to increased workload. It is characterized by an increase in cell size and protein synthesis, and alterations in gene expression. The ubiquitin-proteasome-system is the major pathway for intracellular protein degradation in eucaryotic cells. It plays a major role in the regulated degradation of central signal mediators and transcription factors.

In a model system of neonatal rat cardiomyocytes we investigated the effects of proteasome inhibitors on myocardial hypertrophy. Treatment with specific proteasome inhibitors reduced the hypertrophic effects of all used agonists (e.g. isoproterenol, phenylephrin) dose-dependently: 0.05 – 1 µM MG132 resulted in a marked reduction of cell size as determined by morphometric analysis of phalloidin-stained myocytes. Moreover, western blot analysis showed a concentration-dependently reduced expression of hypertrophic marker proteins (β-myosin heavy chain, α-sarcomeric actin, α-smooth muscle actin). This correlated well with a suppressed expression of brain natriuretic peptide in reportergene assays. Reduced RNA and protein synthesis was determined by incorporation of radioactively labeled substrates.

Efficient inhibition of the proteasome by MG132 was confirmed by increased accumulation of multi-ubiquitinated proteins in western blot analysis, by reduced degradation of fluorogenic substrates and by accumulation of a ubiquitin-conjugated variant of the green fluorescent protein.

Suppression of cardiomyocyte hypertrophy by proteasome inhibition corresponded to reduced ERK 1/2 activation (determined by phospho-specific antibodies) and decreased NFκB activation (determined by luciferase assays).[Seite V↓]

Eigene Schlagworte: Hypertrophie, Proteasom, neonatale Rattenkardiomyozyten, Proteasominhibitoren

Eigene Schlagworte: Hypertrophy, Proteasome, neonatal rat cardiomyocytes, proteasome inhibitors

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27.11.2003