Aus der Medizinischen Klinik m. S.
Kardiologie, Pulmologie und Angiologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Suppression der Hypertrophie
kardialer Myozyten durch Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Henryk Dreger
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. Joachim Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. Karl Stangl
2. Prof. Dr. Jutta Schaper
3. Prof. Dr. Burkhardt Dahlmann

Eingereicht:15. November 2002

Datum der Promotion:20. Juni 2003

Zusammenfassung

Hypertrophie bezeichnet eine zelluläre Anpassungsleistung, die durch vermehrte Arbeitsbelastung ausgelöst wird und durch Zunahme von Zellgröße und Proteinsynthese sowie durch Veränderungen der Genexpression bei konstanter Zellzahl gekennzeichnet ist. Beim Ubiquitin-Proteasom-System handelt es sich um den wichtigsten intrazellulären Proteinabbaumechanismus eukaryontischer Zellen. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle im regulierten Abbau zellulärer Signalmediatoren und Transkriptionsfaktoren.

In einem Hypertrophiemodell mit neonatalen Rattenkardiomyozyten wurde die Wirkung von Proteasominhibitoren auf die Ausbildung einer Hypertrophie untersucht. Behandlung mit Proteasominhibitoren (MG132, MG262) führte dabei zu einer dosisabhängigen Reduktion des Effekts der eingesetzten hypertrophieinduzierenden Agonisten (Isoproterenol, Angiotensin II, Phenylephrin). So konnte mit Hilfe morphometrischer Analysen Phalloidin-gefärbter Kardiomyozyten eine Verringerung des Zellwachstums gezeigt werden. Western Blots belegten eine verringerte Expression von Hypertrophiemarkerproteinen (β-myosin heavy chain, α-sarcomeric actin, α-smooth muscle actin). Analog zu diesen Befunden konnte in einem Reportergenassay die Abnahme der Expression des brain natriuretic peptide (BNP) gezeigt werden. Eine reduzierte RNA- und Proteinsynthese konnte mit Hilfe der Inkorporation radioaktiver Substrate nachgewiesen werden.

Als Nachweis für die effiziente Inhibition des Proteasoms durch MG132 dienten Western Blots akkumulierter, polyubiquitinierter Proteine, die reduzierte proteasomale Degradation fluorogener Substrate sowie die Akkumulation eines grün fluoreszierenden Proteins nach Transfektion mit einem Ubiquitin-GFP-Konstrukt.

Als mögliche Mechanismen des antihypertrophen Effekts der Proteasominhibitoren konnten eine verringerte Aktivierbarkeit der MAP Kinasen ERK 1/2 (Western Blots) sowie eine reduzierte Aktivität des Transkriptionsfaktor NFκB (Reportergenassay) identifiziert werden.

Abstract

Myocardial hypertrophy is an important adaptive response of the heart to increased workload. It is characterized by an increase in cell size and protein synthesis, and alterations in gene expression. The ubiquitin-proteasome-system is the major pathway for intracellular protein degradation in eucaryotic cells. It plays a major role in the regulated degradation of central signal mediators and transcription factors.

In a model system of neonatal rat cardiomyocytes we investigated the effects of proteasome inhibitors on myocardial hypertrophy. Treatment with specific proteasome inhibitors reduced the hypertrophic effects of all used agonists (e.g. isoproterenol, phenylephrin) dose-dependently: 0.05 – 1 µM MG132 resulted in a marked reduction of cell size as determined by morphometric analysis of phalloidin-stained myocytes. Moreover, western blot analysis showed a concentration-dependently reduced expression of hypertrophic marker proteins (β-myosin heavy chain, α-sarcomeric actin, α-smooth muscle actin). This correlated well with a suppressed expression of brain natriuretic peptide in reportergene assays. Reduced RNA and protein synthesis was determined by incorporation of radioactively labeled substrates.

Efficient inhibition of the proteasome by MG132 was confirmed by increased accumulation of multi-ubiquitinated proteins in western blot analysis, by reduced degradation of fluorogenic substrates and by accumulation of a ubiquitin-conjugated variant of the green fluorescent protein.

Suppression of cardiomyocyte hypertrophy by proteasome inhibition corresponded to reduced ERK 1/2 activation (determined by phospho-specific antibodies) and decreased NFκB activation (determined by luciferase assays).[Seite V↓]

Eigene Schlagworte: Hypertrophie, Proteasom, neonatale Rattenkardiomyozyten, Proteasominhibitoren

Eigene Schlagworte: Hypertrophy, Proteasome, neonatal rat cardiomyocytes, proteasome inhibitors

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1  Hypertrophie
    • 1.1.1  Makroskopische Charakteristika kardialer Hypertrophie
    • 1.1.2  Zelluläre Charakteristika kardialer Hypertrophie
      • 1.1.2.1  Induktoren der kardialen Hypertrophie
      • 1.1.2.2  Intrazelluläre Signaltransduktion
  • 1.2  Das Ubiquitin-Proteasom-System
    • 1.2.1  Markierung der Proteasomsubstrate mit Ubiquitin
    • 1.2.2  Struktur des Proteasoms
    • 1.2.3  Aufgaben des Proteasoms
    • 1.2.4 Selektive Proteasominhibitoren
  • 1.3  Zielsetzung der Arbeit
• 2  Materialien und Methoden
  • 2.1 Zellkultur und -präparation
    • 2.1.1 Materialien
    • 2.1.2 Zellkultur
    • 2.1.3 Zellpräparation
  • 2.2  Zellstimulation
    • 2.2.1 Materialien
      • 2.2.1.1 Agonisten
      • 2.2.1.2 Inhibitoren
    • 2.2.2 Durchführung
  • 2.3 Zelllyse und Proteinextraktion
    • 2.3.1 Materialien
    • 2.3.2 Durchführung
      • 2.3.2.1 Zelllyse nach Langzeitstimulation
      • 2.3.2.2 Zelllyse nach Kurzzeitstimulation
  • 2.4  Bestimmung der Proteinkonzentration
    • 2.4.1 Materialien
    • 2.4.2 Durchführung
  • 2.5 Western Blots
    • 2.5.1 Materialien
      • 2.5.1.1  Lösungen
    • 2.5.2 Durchführung
      • 2.5.2.1 Präparation der Polyacrylamidgele
      • 2.5.2.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
      • 2.5.2.3 Blotten
      • 2.5.2.4 Antikörperbindung
      • 2.5.2.5 Strippen der Western Blots
  • 2.6 Morphometrie
    • 2.6.1 Materialien
    • 2.6.2 Durchführung
      • 2.6.2.1 Phalloidinfärbung
      • 2.6.2.2 Ermittlung der Zellgröße
  • 2.7 Transiente Transfektionen mit Reportergenkonstrukten
    • 2.7.1 Materialien
      • 2.7.1.1 Plasmide
    • 2.7.2 Durchführung
  • 2.8 Luciferase-Assays
    • 2.8.1 Materialien
    • 2.8.2 Durchführung
  • 2.9 Messung der Aktivität des Proteasoms mit Hilfe fluorogener Substrate
    • 2.9.1 Materialien
    • 2.9.2  Durchführung
  • 2.10 Synthesemessungen mittels Substratinkorporation
    • 2.10.1 Materialien
    • 2.10.2 Durchführung
  • 2.11  Statistische Auswertung
• 3  Ergebnisse
  • 3.1  Untersuchung der Kennzeichen der Hypertrophie
    • 3.1.1 Morphometrische Auswertung der Zellfläche
    • 3.1.2 Nachweis von Hypertrophiemarkerproteinen
    • 3.1.3 BNP-Expressionsanalyse
    • 3.1.4 Messung der Proteinsynthese
    • 3.1.5  Messung der RNA-Synthese
    • 3.1.6 Messung der rRNA-Synthese
  • 3.2 Nachweis und Quantifizierung der Inhibition des Proteasoms
    • 3.2.1 Akkumulation polyubiquitinierter Proteine
    • 3.2.2 Bestimmung der Aktivität des Proteasoms mittels fluorogener Substrate
    • 3.2.3 Transiente Transfektionen mit UbG76V-GFP
  • 3.3 Mögliche Mechanismen der Hypertrophiesuppression
    • 3.3.1 Signaltransduktion via ERK 1/2
    • 3.3.2 Untersuchung der Aktivität von nuclear factor kappa B
    • 3.3.3 Untersuchung der Aktivität des activating protein 1
• 4  Diskussion
  • 4.1  Kennzeichen der Hypertrophie kardialer Myozyten
    • 4.1.1 Reduktion des hypertrophen Zellwachstums
    • 4.1.2 Abnahme des Gehalts an Hypertrophiemarkerproteinen
    • 4.1.3 Reduzierte BNP-Expression
    • 4.1.4 Abnahme der Proteinsynthese
    • 4.1.5  Abnahme der RNA-Synthese
    • 4.1.6 Abnahme der ribosomalen RNA-Synthese
  • 4.2 Nachweis und Quantifizierung der Inhibition des Proteasoms
    • 4.2.1 Akkumulation polyubiquitinierter Proteine
    • 4.2.2 Abnahme der Aktivität des Proteasoms
    • 4.2.3 Transfektion mit UbG76V-GFP
  • 4.3  Mögliche Mechanismen des antihypertrophen Effekts der Proteasominhibitoren
    • 4.3.1 Abnahme der Aktivierbarkeit der MAPK ERK 1/2
    • 4.3.2 Abnahme der Aktivität von nuclear factor kappa B
    • 4.3.3 Zunahme der Aktivität des activating protein 1
    • 4.3.4 Abschließende Bemerkungen
• 5  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Lebenslauf
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1: Relativer Anteil der einzelnen Proteasomunterformen und der endogenen Aktivatoren PA28 und PA700 im Zytosol von HeLa-Zellen (Tanahashi et al. 2000).
• Tabelle 2: Physiologische Funktionen und wichtige Substrate des Proteasoms (modifiziert nach Kisselev und Goldberg 2001).
• Tabelle 3: Erstantikörper
• Tabelle 4: Zweitantikörper
• Tabelle 5: Zusammensetzung der Polyacrylamidgele
• Tabelle 6: Effizienz der getesteten Transfektionsreagenzien

Bilder

• Abbildung 1: Die wichtigsten Signaltransduktionswege in der Hypertrophie (modifiziert nach Hefti et al. 1997).
• Abbildung 2: Die Kaskade der mitogen activated protein kinases (MAPK). Kursiv: noch nicht identifiziert (modifiziert nach Sugden und Clerk 1998).
• Abbildung 3: Das Ubiquitin-Proteasom-System (nach Coux et al. 1996).
• Abbildung 4: Strukturformeln der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Proteasominhibitoren. a: MG132, b: MG262.
• Abbildung 5: Mit FITC-konjugiertem Phalloidin gefärbte NRC (a) und mit Scion Image bestimmte Zellfläche (b).
• Abbildung 6: Mit 10% FCS und verschiedenen Inhibitoren über 48 Stunden behandelte und mit Phalloidin-FITC gefärbte NRC. a: Kontrolle, b-f: 10% FCS, c: 1 µM ALLM, d: 0,1 µM MG262, e: 1 µM MG262, f: 1 µM MG132.
• Abbildung 7: Veränderung der Zellfläche nach Behandlung mit 10% FCS allein und kombiniert mit ALLM, MG132 oder MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SD (n = 10) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 8: Mit 10 µM Isoproterenol und 0,05-1 µM MG132 über 48 Stunden behandelte und mit Phalloidin-FITC gefärbte NRC. a: Kontrolle, b-f: 10 µM Isoproterenol, c: 0,05 µM MG132, d: 0,1 µM MG132, e: 0,5 µM MG132, f: 1 µM MG132.
• Abbildung 9: Veränderung der Zellfläche nach Behandlung mit 10 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SD (n = 10) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 10: Mit 20 µM Angiotensin II und 0,05-1 µM MG132 über 48 Stunden behandelte und mit Phalloidin-TRITC gefärbte NRC. a: Kontrolle, b-f: 20 µM Angiotensin II, c: 0,05 µM MG132, d: 0,1 µM MG132, e: 0,5 µM MG132, f: 1 µM MG132.
• Abbildung 11: Veränderung der Zellfläche nach Behandlung mit 20 µM Angiotensin II allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SD (n = 10) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 12: Veränderung der Proteinmenge von βMHC nach 48-stündiger Stimulation mit 10 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.
• Abbildung 13: Veränderung der Proteinmenge von α-sarcomeric actin nach 48-stündiger Stimulation mit 10 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.
• Abbildung 14: Veränderung der Proteinmenge von α-smooth muscle actin nach 48-stündiger Stimulation mit 10 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.
• Abbildung 15: Expression von BNP nach 24-stündiger Behandlung mit 50 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 1 µM MG132. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 12) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 16: Veränderung der Proteinsynthese nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS und ALLM, MG132 bzw. MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 3) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 17: Veränderung der Proteinsynthese nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS (a) bzw. 100 µM Isoproterenol (b) und 0,05-1 µM MG132. Die Diagramme zeigen Mittelwerte ± SEM (n = 3) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 18: Veränderung der RNA-Synthese nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS und ALLM, MG132 bzw. MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 3) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 19: Veränderung der RNA-Synthese nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS (a) bzw. 100 µM Isoproterenol (b) und 0,05-1 µM MG132. Die Diagramme zeigen Mittelwerte ± SEM (n = 3) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 20: Veränderung der ribosomalen RNA-Synthese nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS, 1 µM MG132 und 2,5 µg/ ml α-Amanitin. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 3) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 21: Akkumulation polyubiquitinierter Proteine nach Inkubation mit 10 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit 0,05-1 µM MG132 über 12 (a), 24 (b), 48 (c) und 72 Stunden (d). Die Diagramme zeigen die relative Proteinmenge genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.
• Abbildung 22: Aktivität des Proteasoms nach 48-stündiger Inkubation mit 10 µM Isoproterenol und 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SD (n = 6) der Fluoreszenz nach Abbau fluorogener Substrate (Suc-LLVY-MCA).
• Abbildung 23: Fluoreszierende Zellen/ Sichtfeld nach Transfektion mit UbG76V-GFP und 24- bzw. 48-stündiger Stimulation mit 10 µM Isoproterenol und 0,05-1 µM MG132. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 10).
• Abbildung 24: Veränderung des Anteils der aktiven Form von ERK 1/2 nach 4-stündiger Inkubation mit MG132 und 10-minütiger Stimulation mit 10% FCS. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge der phosphorylierten ERK 1/2 abgeglichen auf die inaktive Form und genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.
• Abbildung 25: Veränderung des Anteils der aktiven Form von ERK 1/2 nach 4-stündiger Inkubation mit MG132 und 10-minütiger Stimulation mit 100 µM Phenylephrin. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge der phosphorylierten ERK abgeglichen auf die inaktive Form und genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.
• Abbildung 26: Veränderung des Anteils der aktiven Form von ERK 1/2 nach 4-stündiger Inkubation mit MG132 und 20-minütiger Stimulation mit 50 µM Isoproterenol. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge der phosphorylierten ERK abgeglichen auf die inaktive Form und genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.
• Abbildung 27: Veränderung des Anteils der aktiven Form von ERK 1/2 nach 4-stündiger Inkubation mit MG262 und 20-minütiger Stimulation mit 50 µM Isoproterenol. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge der phosphorylierten ERK abgeglichen auf die inaktive Form und genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.
• Abbildung 28: Veränderung des Anteils der aktiven Form von ERK 1/2 nach 4-stündiger Inkubation mit ALLM und 20-minütiger Stimulation mit 50 µM Isoproterenol. Das Diagramm zeigt die relative Proteinmenge der phosphorylierten ERK abgeglichen auf die inaktive Form und genormt auf die Kontrolle nach Densitometrie.
• Abbildung 29: Veränderung der Aktivität von NFκB nach 24-stündiger Inkubation mit 50 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit MG132 oder MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 6) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 30: Veränderung der Aktivität von AP1 nach 24-stündiger Inkubation mit 10% FCS allein und kombiniert mit MG132 oder MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 9) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 31: Veränderung der Aktivität von AP1 nach 24-stündiger Inkubation mit 50 µM Isoproterenol allein und kombiniert mit MG132 oder MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 9) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 32: Veränderung der Aktivität von AP1 nach 24-stündiger Inkubation mit MG132 oder MG262. Das Diagramm zeigt Mittelwerte ± SEM (n = 9) genormt auf die Kontrolle.
• Abbildung 33: Mit UbG76V-GFP transfizierte NRC nach 48-stündiger Behandlung mit 10 µM Isoproterenol allein (a) und kombiniert mit 1 µM MG132 (b).
• Abbildung 34: Phosphatasen des MAPK-Signalwegs (nach Denhardt 1996).