Der Plaqueindex nach QUIGLEY & HEIN bewertet die flächenhafte Verteilung der Plaque auf den buccalen und lingualen Zahnflächen nach Anfärben mit einem Plaquerevelator (Quigley & Hein 1962). Im Rahmen dieser Studie wurde von einer Anfärbung der Zahnoberflächen abgesehen. Das Plaquewachstum wird in sechs Grade von 0 bis 5 eingeteilt, wobei sich der QH-Index aus der Formel „Summe der Bewertungsgrade dividiert durch die Anzahl der bewerteten Flächen“ berechnet. In dieser Versuchsreihe fanden im ersten und dritten Quadranten die vestibulären Flächen sowie im zweiten und vierten Quadranten die lingualen Flächen der Zähne 1, 2, 6 und 7 Beachtung.

Grad

Diagnose

0

keine Plaque

1

vereinzelt Plaqueinseln am Gingivalsaum

2

durchgezogene Plaquelinie am Gingivalsaum

3

Ein Drittel der vestibulären Zahnfläche ist mit Plaque bedeckt.

4

Zwei Drittel der vestibulären Zahnfläche sind mit Plaque bedeckt.

5

Mehr als zwei Drittel der vestibulären Zahnfläche sind mit Plaque bedeckt.

Tabelle 5: Schweregradeinteilung der Plaquebefunde nach QUIGLEY & HEIN

Der Entzündungszustand der Gingiva lässt sich mit Hilfe des Papillen-Blutungs-Index nach MÜHLEMANN & SON bestimmen (Mühlemann & Son 1971). Eine Blutung wird provoziert, indem mit einer stumpfen Parodontalsonde der Sulcus gingivae mit leichtem Druck ausgewischt wird. Die Intensität der auftretenden Blutung wird in vier Grade eingeteilt. Der PBI lässt sich aus „Blutungszahl dividiert durch die Anzahl der untersuchten Papillen“ ermitteln, wobei in dieser Studie im ersten und dritten Quadranten die Zähne 1, 2, 6 und 7 von lingual und im zweiten und vierten Quadranten die Zähne 1, 2, 6 und 7 von buccal sondiert wurden.

Blutungsgrad

Diagnose

Diagnosekriterien

0

keine Blutung

20-30 Sekunden nach der Reizung kein Blut erkennbar

1

Blutpunkt

20-30 Sekunden nach der Reizung nur ein einziger Blutpunkt erkennbar

2

Blutpunkte / Blutlinie

mehrere Blutpunkte oder feine Blutlinie erkennbar

3

Interdentaldreieck

Das Interdentaldreieck füllt sich mit Blut.

4

Tropfenbildung

profuse Blutung: Sofort nach der Sondierung füllt das Blut das interdentale Dreieck und fließt über die Zähne bzw. die Gingiva.

Tabelle 6: Gradeinteilung des Blutbefundes laut PBI

Zur Gewinnung des Speichels stand eine Apparatur zur Verfügung, die Dr. Mathias Jancke im Rahmen seiner Dissertation konstruierte und als Duplikat der Abteilung für Zahnerhaltung und Präventivzahnmedizin, Campus Virchow – Klinikum der Charité – Universitätsmedizin Berlin, überlassen hatte (Jancke 2002).

Die speziell zur drüsenspezifischen Entnahme der Speichelproben entwickelte Apparatur besteht aus sechs Silikonsaugern, die über Silikonschläuche mit einer Unterdruckbox verbunden sind. Innerhalb der Dichtfläche der Sauger ist ein Messingdrahtgitter eingearbeitet. Damit wird verhindert, dass die bewegliche Mukosa in den Hohlraum eingesaugt wird und den Schlauchanschluss verschließt.

In der Unterdruckbox sind in einem Ständer die den Speichel auffangenden Probengefäße untergebracht, in die das Durchtrittsröhrchen der jeweiligen Entnahmestelle mündet. Der Unterdruckanschluss wird mit dem Speichelsaugeranschluss der zahnärztlichen Behandlungseinheit verbunden, so dass sich ein Unterdruck von –5 mmHg aufbaut.

Für den Unterkiefer sind zwei Sauger an einen frontal ausgeschnittenen Abformlöffel befestigt, um zwei Entnahmestellen zu erreichen. Die zwei 2,5 x 0,8 cm großen nierenförmigen Sauger decken lingual jeweils die Caruncula und Plica sublingualis ab. Es kann dadurch der Speichel der großen Unterkieferdrüsen nach links und rechts getrennt entnommen werden. Um eine störungsfreie Entnahme des sublingualen Sekrets trotz seiner hohen Viskosität zu erreichen, mussten Silikonschläuche mit 2 mm Innendurchmesser eingesetzt werden. Durch die Befestigung der ableitenden Schläuche der Submandibularissauger an einem zurechtgeschnittenen Abformlöffel bleiben die Sauger in ihrer Position etwas flexibel und passen sich beim Einsetzen automatisch den anatomischen Platzverhältnissen an. Eine optische Kontrolle ist jederzeit möglich. Für die Glandula parotidea kommt jeweils ein runder Sauger mit 2 cm Durchmesser befestigt an einem 1 mm im Innendurchmesser messenden Schlauch zum Einsatz. Dieser wird auf die Papilla parotidea gesetzt und findet durch den Unterdruck an seinem Platz Halt.

Es war somit möglich, den Speichel der großen Drüsen vollständig und gleichzeitig sowie nach Ausführungsgängen getrennt zu entnehmen.

Abbildung 6: Darstellung der Speichelsauger der Apparatur zur drüsenspezifischen Speichelgewinnung: Für diese Studie kamen Sauger zur Gewinnung des Unterzungensekrets der Glandulae submandibulares /-linguales (siehe Abbildung links oben, inkl. des modifizierten Abformlöffels) und zur Gewinnung des Parotissekrets (siehe Abbildung rechts unten) zum Einsatz. Die Darstellung zeigt des Weiteren Sauger für den Bereich des Unterkiefervestibulums (siehe Abbildung links unten) sowie einen im Oberkieferabformlöffel integrierten Sauger zur Gewinnung des vestibulären und palatinalen Sekrets der Glandulae minores des Mundraums, die jedoch keine Anwendung fanden.

Nach der Bestimmung von QH und PBI wurde der Proband aufgefordert in dem Stuhl der zahnärztlichen Einheit entspannt Platz zu nehmen.

Die gereinigte, sterilisierte und getrocknete Apparatur wurde vor dem Einsetzen in den Mund komplett zusammengesetzt und an den aktiven Unterdruck angeschlossen. Im Anschluss erfolgte die Applikation der Sauger der eingeschalteten Apparatur zur Speichelgewinnung an den jeweiligen Speicheldrüsen. Zuerst wurden die Sauger für den Parotisspeichel adaptiert, danach der Unterkieferlöffel eingebracht.

Abbildung 7: Darstellung der sich in Aktion befindlichen Apparatur zur drüsenspezifischen Speichelgewinnung: Der Proband sitzt entspannt auf dem Stuhl der zahnärztlichen Einheit, die Apparatur ist über die ableitenden Silikonschläuche mit dem Probanden und zur Gewinnung des Unterdrucks mit dem Suktur der Einheit verbunden.

Über einen Zeitraum von 20 Minuten wurde der unstimulierte Speichel in den dafür vorgesehenen Auffanggefäßen gesammelt. Danach wurden die Sauger kurzzeitig aus dem Mund des Probanden entfernt. Nachdem sich durch den Luftzutritt der Inhalt der Schläuche in die Probengefäße binnen einer 2minütigen Leerlaufzeit entleert hatte, wurden diese aus der Unterdruckbox entnommen, verschlossen und durch neue ersetzt. Nachfolgend wurden die Speichelsauger an die entsprechenden Stellen im Mundraum reponiert. Um eine Stimulation der Speicheldrüsen zu erreichen, wurden dem Probanden einmalig fünf Tropfen einer 2%igen Zitronensäurelösung auf die Mitte des Zungenrückens geträufelt. Erneut erfolgte eine 20minütige Abnahme. Nach Ablauf der Zeit wurden die Sauger aus dem Mund des Probanden entfernt, ein Ablaufen des Restspeichels aus den Silikonschläuchen in die Auffanggefäße gewährleistet, die mit Speichel angefüllten Gefäße verschlossen und die Versuchsperson verabschiedet.

Zur Charakterisierung und Spezifizierung der Glykanstrukturen des gewonnenen Speichels kam ein kompetitiver „Lektinbindungs-Inhibitionstest“ (Kage 1989) zum Einsatz. Dieser beruht auf dem Prinzip der Prohibition der Bindung eines biotinylierten, pflanzlichen Lektins mit bekannter Bindungsspezifität an den Glykananteil eines Festphasen-adsorbierten Neoglykoproteins durch den Glykananteil einer Probe. Durch die Menge des gebundenen Lektins ist das Ausmaß der kompetitiven Hemmung ermittelbar. Das Biotin-markierte Lektin bindet an die Streptavidin-Peroxydase, welche ihrerseits eine Farbreaktion katalysiert. Deren Intensität kann später photometrisch gemessen werden und steht in direktem Zusammenhang zur Menge des Festphasen-gebundenen Lektins.

Abbildung 8: „Lektinbindungs-Inhibitionstest“:
links: Biotinylierte Lektine binden spezifisch an immobil an eine Mikrotiterplatte fixierte Glykoproteine. Der quantitative Nachweis der Anlagerung erfolgt über das Streptavidin-Peroxidase-System.
rechts: Speichelglykoproteine inhibieren durch Bindung der Lektine über ihre spezifischen Glykananteile deren Anlagerung an die Festphasen-glykoproteine.

Die Konzentrationsbestimmung der verschiedenen Glykanstrukturen des Speichels wurde auf 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt. In Vorversuchen wurden die optimalen Verdünnungen für jeden Schritt empirisch festgelegt und während des gesamten Versuchsverlaufes beibehalten. Auf eine Platte konnten maximal 20 Speichelproben, d.h. der an allen Versuchstagen gesammelte unstimulierte oder stimulierte Speichel eines Probanden, aufgetragen werden. Zusätzlich wurde auf jeder Platte eine Standardkurve erstellt und eine Verdünnungsreihe einer Kontrollprobe (unverdünnt und 1:3 verdünnt) gemessen. Die Kontrollmessung diente der internen Qualitätssicherung. Insgesamt kamen von 14 Probanden maximal 560 Speichelproben zur Auswertung.

Das folgende Schema zeigt die räumliche Aufteilung einer Mikrotiterplatte:

Abbildung 9: Schema der räumlichen Aufteilung einer Mikrotiterplatte bei der Durchführung eines kompetitiven „Lektinbindungs-Inhibitionstests“, wobei jede Probe doppelt und in zwei Verdünnungen gemessen wurde. Die Kontrolle wurde doppelt unverdünnt und in 1:3 Verdünnung aufgetragen. Zehn Proben entsprechen jeweils dem unstimulierten oder stimulierten Speichel aller Drüsen eines Probanden an allen Tagen.

Der erste Schritt bestand in der Beschichtung der Platten mit dem für das jeweilige Lektin komplementäre Glykoprotein in einer Verdünnung von 1:1.000 in frischem Phosphatpuffer. Jedes Well der Mikrotiterplatte wurde mit 100 µl beschickt und bei Raumtemperatur für eine Stunde auf einem Schüttler (ca. 200 U/min) inkubiert. Während dieser Zeit erfolgte die Vorbereitung der Standardreihen und Speichelproben.

Die Proben wurden nach dem Auftauen und einem dreiminütigen Zentrifugieren bei 14.000 U/min zunächst mit Probenpuffer im Verhältnis 1:7,5 verdünnt. Im Anschluss folgte eine weitere zweite Verdünnung um den Faktor 5. Für die Ermittlung einer spezifischen Glykanstruktur wurde ein Teil der Probe bis zum Erhalt von vier Verdünnungen geometrisch weiterverdünnt.

Ein Kohlenhydrat bekannter Struktur bildete in fünf Verdünnungsstufen die Standardreihe; welche Kohlenhydrate mit welchem Verdünnungsfaktor jeweils Anwendung fanden, erläutert Tabelle 7.

Lektin

(Verdünnung in LPA)

Bindungsspezifität

(nach WU et al. 1988)

Beschichtung

- Verdünnung in PBS -

(Produzent/Lieferant)

Standard

- Verd. in Probenpuffer -

- geometr.Weiterverd.Faktor -

PNA

= Peanut Agglutinin
(50 µg/l + 0,1% BSA)

β-Galaktose-1,3-N-Acetyl-Galaktosamin#SYMBOL#

BSA-Gal-1,3-N-Acetyl-Galak-tosamin
1 mg/l (Janssen Biochemica, Beerse, Belgien)

N-Acetyl-Neuramin-Laktose
60µM
Faktor 3

GS 1

= Griffonia simplicifolia Agglutinin
(25 µg/l + 0,1% BSA)

terminales
α-N-Acetyl-Galaktosamin

BSA-N-Acetyl-Galaktosamin
1 mg/l
(Sigma Biochemica, Deisenhofen)

N-Acetyl-Galaktosamin
300mM
Faktor 8

VVA

= Vicia villosa Agglutinin
(25 µg/l + 0,1% BSA)

terminales
1,3-N-Acetyl-Galaktosamin

BSA-Galaktosamin
1 mg/l
(Sigma Biochemica, Deisenhofen)

N-Acetyl-Galaktosamin
300mM
Faktor 8

SNA

= Sambucus nigra Agglutinin
(25 µg/l + 0,1% BSA)

terminale Sialinsäure

Fetuin
1 mg/l
(Sigma Biochemica, Deisenhofen)

Methyl-α-D-Galaktopyranosid
300mM
Faktor 2

AAA

= Anguilla anguilla Agglutinin
(25 µg/l + 0,1% BSA)

α 1,6 gebundene Fucose

BSA-Fucosylamide
1 mg/l
(Sigma Biochemica, Deisenhofen)

Fucose
300mM
Faktor 3

Tabelle 7: Auflistung der im kompetitiven „Lektinbindungs-Inhibitionstest“ verwendeten Lektine mit ihrer Beschichtungsspezifität, der im jeweiligen Test eingesetzten Glykanstruktur und den entsprechenden Standards;
Legende:
geometr.Weiterverd. = geometrische Weiterverdünnung; Verd. = Verdünnung;
LPA = Lektinassay-Puffer, BSA = bovines Serum-Albumin, PBS = Phosphatpuffer

Ebenfalls wurde eine Kontrolle auf jede Mikrotiterplatte aufgebracht, die der internen Qualitätskontrolle und der Berechnung des Inter-Assay-Variationskoeffizienten diente. Sie setzte sich wie folgt zusammen:

Zusammensetzung der Kontroll-Lösung

Fucose

25 mmol (123,15 mg)

N-Acetyl-Galaktosamin

10 mmol (66,36 mg)

N-Acetyl-Neuramin-Laktose

1:60 (500 µl)

Methyl-#SYMBOL#α-Galaktopyranosid

15 mmol (87,39 mg)

Tabelle 8: Auflistung der in der Kontrolllösung enthaltenden Stoffe inklusive der jeweiligen Mengenangabe

Nach Ablauf der Inkubationszeit fand ein viermaliges Waschen der Mikrotiterplatten mit Hilfe eines Waschautomaten statt, an das sich das Auftragen von 25 µl Standard-, Kontroll- oder Proben-Lösung pro Well entsprechend dem Schema (siehe Abbildung 9) anschloss. Des Weiteren erfolgte eine Ergänzung der Wells mit 75 µl der Lektin-Lösung in der jeweiligen Verdünnung auf 100 µl. Im Anschluss wurden die Platten eine halbe Stunde bei 200 U/min geschüttelt und über Nacht in einem Kühlschrank bei +4°C erneut inkubiert.

Der nächste Tag begann mit dem viermaligen Waschen der Mikrotiterplatten. Darauf folgte ein Auffüllen aller Wells mit 100 µl Streptavidin-POD, welches im Verhältnis 1:20.000 in Lektinassay-Puffer verdünnt war, und eine einstündige Inkubation auf dem Schüttler (ca. 200 U/min) bei Raumtemperatur.

Nach erneutem viermaligen Waschen wurde das im Gallati-Puffer frisch angesetzte TMB mit 110 µl je Well pipettiert und die Platten bei Dunkelheit ca. 10 Minuten inkubiert.

Sobald eine abgestufte Blaufärbung in den Wells sichtbar war, wurde dieser enzymatische Farbumschlag mit Hilfe von 50 µl einer 4NH₂SO₄-Lösung gestoppt und die dabei eingetretene Gelbfärbung im Photometer gemessen.

Abbildung 10 zeigt nochmals die einzelnen Schritte und den zeitlichen Ablauf des kompetitiven „Lektinbindungs-Inhibitionstests“ in einer Übersicht.

Abbildung 10: schematischer Ablauf des „Lektinbindungs-Inhibitionstests“

Die Konzentrationsbestimmung der Glykanstruktur-Äquivalente erfolgte durch Messung der optischen Dichte mittels eines Spektralphotometers. Die Messungen wurden bei einer Messfilterwellenlänge von 450 nm und einer Referenzfilterwellenlänge von 490 nm durchgeführt, um eventuelle unterschiedliche Resorptionen der Mikrotiterplatten auszugleichen. Zunächst ergab sich eine halblogarithmische Standardkurve durch die auf jeder Platte vorhandene definierte Standardverdünnungsreihe.

Abbildung 11: Standardkurve am Beispiel von SNA:
OD: die optische Dichte , %std.: der Prozentwert des Standards

Die Messwerte aller Wells wurden dann auf diesen Standard bezogen als Prozentwerte ausgegeben und pro verwendete Platte als Messwertdatei gespeichert. Als Dokumentation lag zum Schluss ein Ausdruck in Tabellenform vor.